专利名称：刺果藤属物种的抗结核病组合物的制作方法WHO估计，相比于2006年的924万新增病例，2007年产生了 927万例新增TB病例。在这些927万例新增病例中，估计有44%或者说410万(每100000人口中有61例)是新涂阳病例。与其他任何国家相比，印度每年有更多的新增TB病例。已知印度人口中具有最大的疾病发生率，其中高达180万为已受感染者。人们估计，2007年有137万例HIV阳性的TB发生(全部病例的14. 8%)并且在HIV阳性的人群中，456000例死于TB。针对该新兴威胁的唯一的世界范围内的研究发现，在灾情最严重的地区，将近20%的多药耐药结核 病(MDR-TB)病例为严重/广泛耐药结核病(XDR-TB)。本领域需要有能够有效地对抗杆菌以降低结核病发生率并且降低由于该疾病的发病率和死亡率的分子。此外，这能够成为克服多药耐药杆菌的策略，所述多药耐药杆菌逐渐使常规治疗方案无效。MtbGS酶(结核分支杆菌谷氨酰胺合成酶)被鉴定为该疾病的靶标，并且其通过合成聚-L-谷氨酸-谷氨酰胺复合物，在细胞壁的生合成中发挥重要作用。来自于结核分支杆菌、牛分支杆菌和其他类似细菌的GlnAl酶的胞外定位与其参与细胞壁成分聚(L-谷氨酸谷氨酰胺)的合成有关。B.A.Adeniyi等人在于2004年5月26日在线发表的，植物疗法研究第18卷，第 5 期，414-418 页(Phytotherapy Research, Volume 18，Issue 5, Pages 414-418)中题目为 “In vitro anti-mycobacterial activities of three species of Cola plantextracts (Sterculiaceae) ”的文章中公开了使用放射性测量(BACTEC)法,使用1000 μ g/ml的缓慢生长的牛分支杆菌ATCC 35738，对获得自三种尼日利亚梧桐科植物红可乐树(Cola accuminata)、白可乐树(C. nitida)和千年可乐树(C. milleni)的提取物讲行抗分支杆菌属件的筛选。另外，使用肉汤微稀释法(broth microdilution method)对于母牛分支杆菌的六种快速生长的ATCC菌株测试所述提取物。来自于红可乐树的树叶、萃皮和根皮以及来自于白可乐树和千年可乐树的树叶和莖皮的甲醇提取物在1000 μ g/ml的最高浓度下无活性。人们发现，只有白可乐树和千年可乐树的根皮的甲醇提取物具有对抗牛分支杆菌和母牛分支杆菌菌株的潜力。Tullius, Μ. V. , G. Harth 和 M. A. Horwitz. 2001. High extracellular levelsof Mycobacterium tuberculosis glutamine synthetase and superoxide dismutasein actively growing cultures are due to high expression and extracellularstability rather than to a protein-specific export mechanism. Infect.Tmmun. 69:6348-6363。发明目的本发明的主要目的是提供一种包含刺果藤属物种提取物的组合物。所述提取物用于抑制引发结核病的结核分支杆菌的结核分支杆菌谷氨酰胺合成酶。本发明的另一个目的是提供一种刺果藤属植物的提取物，所述提取物抑制引发结核病的结核分支杆菌的结核分支杆菌谷氨酰胺合成酶(MtbGS)的活性。本发明的另一个目的是提供有效对抗结核分支杆菌的抗菌提取物。本发明的另一个目的是提供一种抑制MtbGS的草质刺果藤(Byttneriaherbecea)提取物，进而提供一种治疗结核病的方法。
因此，本发明涉及一种包含刺果藤属物种提取物的组合物，所述组合物用于抑制引发结核病的结核分支杆菌的结核分支杆菌谷氨酰胺合成酶。另外，本发明涉及抑制处于 休眠期和生长期的结核分支杆菌。本发明进一步涉及一种通过向患者施用刺果藤属物种的化学处理提取物治疗结核病的方法。另外，本发明公开了刺果藤属本身的用途，经过化学处理以形成提取物和提取物的抑制作用，因此具有对抗疾病症状，特别是处于分支杆菌的休眠期和生长期的结核病的活性。在本发明的一个实施方案中，提取物的纯化的级分抑制MtbGS。在本发明的另一个实施方案中，刺果藤属植物部分本身抑制MtbGS。在本发明的另一个实施方案中，刺果藤属植物、植物部分、提取物及其级分对于处于生长期和休眠期的结核分支杆菌有效。在本发明的另一个实施方案中，刺果藤属植物、植物部分、提取物及其级分用于治疗疾病症状。在本发明的另一个实施方案中，刺果藤属植物、植物部分、提取物及其级分用于治疗疾病症状，其中刺果藤属抑制MtbGS。在本发明的另一个实施方案中，组合物包含至少3μ g/ml的用于抑制结核分支杆菌谷氨酰胺合成酶的刺果藤属物种提取物。在本发明的另一个实施方案中，所述组合物用于治疗结核病。在本发明的一个实施方案中，所述提取物对于由处于杆菌的生长期和休眠期的分支杆菌引起的结核病有效。在本发明的一个实施方案中，所述提取物用于制备治疗结核病的药物组合物和剂型。在本发明的一个实施方案中，所使用的刺果藤属物种是草质刺果藤。图I-收集自柱色谱法的25个级分的TLC。使用5:95Me0H: CHCl3作为用于收集自柱色谱法的级分的展开体系。将显示出相似的化合物TLC模式的级分合并以获得11个级分。图2-级分D的合并亚级分的TLC。使用10:3:87乙腈甲醇氯仿作为用于在进行级分D的柱色谱法之后收集的这些亚级分的展开体系。将显示出相似的化合物TLC模式的级分合并并且进行最终的TLC。图3-获得自制备TLC (PLC)的级分D4的主要成分的TLC。进行该TLC以检查在PLC之后获得的主要成分的纯度。为此，使用甲醇氯仿(5:95)作为展开相。图4-测定级分K对纯化的结核分支杆菌谷氨酰胺合成酶的生合成活性的剂量响应曲线。使用O. 23-15mg/ml的不同浓度的级分K测定IC5tl值。测定的IC5tl值为4. 5mg/ml。图5-测试本发明的化合物对处于生长期的杆菌的活性。使用O. 78-100g/ml的不同浓度的级分K测定IC5tl值。测定的IC5tl值为I. 56 μ g/ml。
在另一个实施方案中，本发明提供包含刺果藤属植物提取物的组合物用于抑制MtbGS和/或治疗结核病的用途。本发明将进一步通过下面给出的实施例来说明，但是这些实施例不应该被解释为限制本发明的范围。实施例实施例I :用于鉴定MtbGS抑制剂的方案试验混合物含有50mM HEPES (4_(2_羟乙基)-I-哌嗪乙磺酸)、ρΗ6· 8的缓冲剂、220mM L-谷氨酸(pH被调节至6. 8),7. 5mM氯化铵、32. 5mM氯化镁和62. 5 μ g/ml酶(结核分支杆菌谷氨酰胺合成酶)。向85μ1反应混合物中加入5μ1样品(刺果藤提取物)。在对照中加入5μ1 DMSO (二甲亚砜)并且在空白中加入5μ I 420mM EDTA (乙二胺四乙酸)。通过在反应混合物中加入7. 6mM ATP (pH被调节至飞.8)来启动反应并且于25°C孵育2小时。 通过加入停止试剂然后加入柠檬酸盐以阻断ATP的进一步水解来终结反应。将全部混合物于室温放置另外的30分钟以通过SpectraMax平板读取器于655nm处读取颜色。发现刺果藤属物种的甲醇提取物对于MtbGS有活性。[Ref-Singh. U, Sarkar. D. , Development of a Simple High-ThroughputScreening Protocol Based on Biosynthetic Activity of Mycobacterium tuberculosisGlutamine Synthetase for the Identification of Novel Inhibitors, Journal ofBiomolecular Screening 11 (8);2006.]实施例2 :实施例I的甲醇提取物的柱色谱法使用根据表-I的梯度流动相，通过200gms的硅胶(100-200目)对19gms的样品进行色谱法。在该阶段收集25个级分。使用5:95Me0H:CHCl3展开相在氧化铝包被的硅胶TLC板上进行所有这些收集的级分的TLC以检查纯度。将显示出相似TLC (图-I)模式的级分合并，并将其置于15ml玻璃测试管中以获得11个级分(A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K)。在除去溶剂之后，使用实施例I中提到的方案评价这些级分的生物活性。发现级分D (第4级分)和K (第11级分)显示出对抗MtbGS的活性。表I


在本研究中，讨论了来自于植物草质刺果藤(科-梧桐科)的，显示出抗结核活性的活性级分。在生合成试验的初步筛选中，草质刺果藤地上部分的甲醇提取物显示出对抗MtbGS的活性。在有机溶剂中进行后续分级。此外，两种级分(级分D和K)显示出对抗结核分支杆菌谷氨酰胺合成酶活性的抑制活性。这些级分D和K于7.5mg/ml的浓度分别抑制74%和44%。从对抗纯化的结核分支杆菌谷氨酰胺合成酶的剂量响应曲线中发现，级分K的测定的IC50值为4.5mg/ml。本研究的主要优势在于知道了化合物的作用方式，其增加了草质刺果藤成为抗结核草药的潜力。对于牛分支杆菌BCG的IC50值为1.56μg/ml。人们观察到，采集的化合物在10X MIC水平上，对HL-60细胞系的增殖没有显著影响。该数据说明，这些化合物可能首先被认为是安全的。