一种虫草素纳米缓释囊及其制备方法【技术领域】，具体涉及一种虫草素纳米缓释囊及其制备方法。[0002]虫草菌素又称虫草素、蛹虫草菌素，3’ -脱氧腺苷，它是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素。其分子式为CltlH13N5O3，分子量为251.24，熔点230~231°C，溶于水、热乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，紫外光的最大吸收波长为259nm。虫草素有抗肿瘤、抗白血病、抗菌、免疫调节、清除体内自由基等多方面的药理作用。另据报道，虫草素一方面具有对DNA和RNA合成过程、加RNA和mRNA转录后修饰过程及腺苷酸环化酶活化等三方面的抑制作用，另一方面它又能促进细胞分化，重建细胞骨架。虫草素有降低胆固醇、降血糖、抗感染、抗疟原虫、抗蚊虫的作用，含虫草素的虫草发酵液对哮喘及支气管疾病、肾衰竭病人的肾功能等方面都有良好的辅助治疗效果。[0003]目前，虫草素在体内经过脱氨作用而发生降解，导致体内使用半衰期短。研究人员一般采用防脱氨保护剂与虫草素配和使用，解决虫草素脱氨造成的半衰期短的问题。但是，虫草素体内脱氨反应属于正常的生理代谢，防脱氨保护剂的使用同时会造成其它正常脱氨降解途径异常， 影响机体的生理过程。同时，现有防脱氨保护剂的作用有限，不能根本延长虫草素半衰期。[0004]现代纳米缓释药物技术在延长小分子药物半衰期、降低药物副作用、靶向治疗、提高药物疗效等方面具有巨大优势。目前，没有发现制备虫草素纳米缓释囊的报道。
[0005]为了解决虫草素使用过程中出现的半衰期短的问题，本发明提供一种虫草素纳米缓释囊及其制备方法。[0006]本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下:
[0007]本发明的一种虫草素纳米缓释囊，通过将虫草素溶于弱酸性溶液得100mol/L虫草素溶液，将海藻酸钠溶于碱性溶液得lmol/L海藻酸钠溶液，在20°C~40°C条件下，将上述两种溶液按虫草素与海藻酸钠的摩尔比为1:10~10:1比例混合至少20min，经离心洗涤、超声分散后得虫草素纳米缓释球，将该虫草素纳米缓释球与0.125mol/L的CaCl2溶液等体积混合固化后，经离心洗涤、干燥后得到直径为200nm~300nm的虫草素纳米缓释囊粉状物。
[0008]所述弱酸性溶液为经过去离子水稀释的I %甲酸、I %乙酸、0.5%磷酸、I %柠檬酸或0.5%硼酸；所述碱性溶液为I % KOH溶液或I % NaOH溶液。
[0009]所述虫草素购自Sigma，纯度为99.9%。
[0010]本发明还提供一种虫草素纳米缓释囊的制备方法，由以下步骤实现:
[0011](I)将虫草素溶解于弱酸性溶液中，得到浓度为100mol/L的虫草素溶液；所述弱酸性溶液为经过去离子水稀释的1%甲酸、1%乙酸、0.5%磷酸、1%柠檬酸或0.5%硼酸，优选1%乙酸；
[0012](2)将海藻酸钠溶解于碱性溶液中，得到浓度为lmol/L的海藻酸钠溶液；所述碱性溶液为I % KOH溶液或I % NaOH溶液；
[0013](3)将步骤(1)得到的虫草素溶液与步骤(2)得到的海藻酸钠溶液按照虫草素与海藻酸钠的摩尔比为1:10~10:1(优选摩尔比为5:1,10:1)的比例混合至少20min，经离心、洗涤、超声分散后得到虫草素纳米缓释球；所述虫草素溶液与海藻酸钠溶液的混合温度为 20°C~40°C ；
[0014](4)将步骤(3)得到的虫草素纳米缓释球与浓度为0.125mol/L的CaCl2溶液等体积混合，固化后，经离心、洗涤、干燥后得到直径为200nm~300nm的虫草素纳米缓释囊粉状物；所述虫草素纳米缓释球与CaCl2溶液的混合时间IOmin~20min。
[0015]本发明的有益效果是:本发明使用海藻酸钠作为载体材料，通过虫草素溶液与海藻酸钠溶液混合法，以保护虫草素活性、使其更好的发挥抗菌作用；同时采用CaCl2固化技术，CaCl2溶液的浓度设定在0.125mol/L，工艺流程可操作性强，易于工厂化，经过测试，本发明得到的虫草素纳米缓释囊粒径范围为200nm~300nm，具有良好的虫草素缓释性能和抑菌效果，抑菌率可达到70%。



[0016]图1为实施例1中得到的虫草素纳米缓释囊的扫描电子显微镜检测图。
[0017]图2为实施例1中得到的虫草素纳米缓释囊的虫草素释放曲线示意图；A线表示经CaCl2溶液固化的虫草素纳米缓释囊的虫草素释放曲线；B线表示未采用CaCl2溶液固化的虫草素纳米缓释囊的虫草素释放曲线。
[0018]图3为实施例1中得到的虫草素纳米缓释囊的抑菌效果图；图3八为枯草芽孢杆菌的抑菌情况，图3B为大肠杆菌的抑菌情况。
[0019]图4为实施例2中得到的虫草素纳米缓释囊的扫描电子显微镜检测图。
[0020]图5为实施例3中得到的虫草素纳米缓释囊的扫描电子显微镜检测图。
[0021]图6为实施例4中得到的虫草素纳米缓释囊的扫描电子显微镜检测图。
[0022]图7为实施例5中得到的虫草素纳米缓释囊的扫描电子显微镜检测图。
[0023]图8为实施例2、3、4、5中得到的虫草素纳米缓释囊的虫草素释放曲线示意图；A线表示实施例2中的虫草素释放曲线示意图，B线表示实施例3中的虫草素释放曲线示意图，C线表示实施例4中的虫草素释放曲线示意图，D线表示虫草素释放曲线示意图。
[0024]图9为实施例2中得到的虫草素纳米缓释囊的抑菌效果图；图9A为枯草芽孢杆菌的抑菌情况(374个菌落)，图9B为大肠杆菌的的抑菌情况(249个菌落)。
[0025]图10为实施例3、4、5中得到的虫草素纳米缓释囊的抑菌效果图；图1OA为实施例3中得到的虫草素纳米缓释囊对大肠杆菌的抑菌效果图，图1OB为实施例4中得到的虫草素纳米缓释囊对大肠杆菌的抑菌效果图，图1OC为实施例5中虫草素纳米缓释囊对大肠杆菌的抑菌效果图。

[0027]实施例1
[0028](I)将购自Sigma、纯度99.9%的虫草素溶解于1%乙酸(去离子水稀释)中，得到浓度为lOOmol/L的虫草素溶液；
[0029](2)将海藻酸钠溶解于I % NaOH溶液中，得到浓度为lmol/L的海藻酸钠溶液；
[0030](3)将步骤⑵得到的lmol/L海藻酸钠溶液向步骤⑴得到的lOOmol/L虫草素溶液中滴加，按照100mol/L虫草素溶液中含有的虫草素与lmol/L海藻酸钠溶液中含有的海藻酸钠的摩尔比为10:1的比例混合，25°C条件下混合20min，1000rpm离心弃上清，沉淀用去离子水1%稀释，超声分散20min，重复离心、去离子水洗涤和超声分散过程三次，得到虫草素纳米缓释球；
[0031](4)将步骤(3)得到的虫草素纳米缓释球用去离子水I %稀释、超声分散，再与浓度为0.125mol/L的CaCl2溶液等体积混合，缓慢搅拌IOmin即可，固化后离心洗涤三次，经干燥后得到虫草素纳米缓释囊粉状物；
[0032](5)将步骤(4)得到的虫草素纳米缓释囊粉状物进行场发射环境扫描电子显微镜检测，测定其直径约为200nm，如图1所示。
[0033](6)称取步骤⑷得到的虫草素纳米缓释囊粉状物Ig置于容器中，加入100mL浓度为0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)，37 °C避光条件下摇床IOOrpm进行释放；在lh、4h、8h、12h、18h、24h、48h时间点各取出I管样品，15000rpm离心20min，取上清，分光光度法260nm测定虫草素浓度。
[0034]结果如图2所示:24h时平均只有大约40%的虫草素释放，48h后仍有大约60%虫草素保留在海藻酸钠纳米粒中，虫草素缓慢释放(见图2中A线)；而未采用CaCl2溶液固化的虫草素纳米缓释囊在0.5h之内释放大约45%虫草素，8h之内虫草素释放达90% (见图2中B线)。说明采用CaCl2溶液固化的虫草素纳米缓释囊能够保持更好的稳定性。
[0035](7)将步骤(4)得到的虫草素纳米缓释囊粉状物以5% (质量/体积)比例溶解于去离子水中，涂布于微生物平板培养基上的下半部分(微生物平板培养基下半部分涂布虫草素纳米缓释囊、上半部分空白不涂虫草素纳米缓释囊作为对照)，将稀释的菌液(枯草芽孢杆菌和大肠杆菌)均匀涂布于微生物平板培养基上培养。
[0036]结果如图3所示:图3A为枯草芽孢杆菌的抑菌情况，图3B为大肠杆菌的抑菌情况，上半部分未涂布虫草素纳米缓释囊，下半部分涂布虫草素纳米缓释囊；上半部分菌落连片，下半部分菌落稀疏。无论是枯草芽孢杆菌还是大肠杆菌，均受到明显抑制，虫草素纳米缓释囊具有良好的抑菌能力，通过菌落计数法估计枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌率，分别达到68%和70%。
[0037]实施例2
[0038](I)将购自Sigma、纯度99.9%的虫草素溶解于I %甲酸(去离子水稀释)中，得到浓度为lOOmol/L的虫草素溶液；
[0039](2)将海藻酸钠溶解于I % KOH溶液中，得到浓度为lmol/L的海藻酸钠溶液；
[0040](3)将步骤⑵ 得到的lmol/L海藻酸钠溶液向步骤⑴得到的lOOmol/L虫草素溶液中滴加，按照100mol/L虫草素溶液中含有的虫草素与lmol/L海藻酸钠溶液中含有的海藻酸钠的摩尔比为5:1的比例混合，20°C条件下混合30min，1000rpm离心弃上清，沉淀用去离子水I %稀释，超声分散20min，重复离心、去离子水洗涤和超声分散过程三次，得到虫草素纳米缓释球；
[0041](4)将步骤(3)得到的虫草素纳米缓释球用去离子水I %稀释、超声分散，再与浓度为0.125mol/L的CaCl2溶液等体积混合，缓慢搅拌20min，固化后离心洗涤三次，经干燥后得到虫草素纳米缓释囊粉状物；
[0042](5)将步骤(4)得到的虫草素纳米缓释囊粉状物进行场发射环境扫描电子显微镜检测，测定其直径为200nm，如图4所示。
[0043](6)称取步骤(4)得到的虫草素纳米缓释囊粉状物Ig置于容器中，加入100mL浓度为0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)，37 °C避光条件下摇床IOOrpm进行释放；在lh、4h、8h、12h、18h、24h、48h时间点各取出I管样品，15000rpm离心20min，取上清，分光光度法260nm测定虫草素浓度。
[0044]结果如图8中A线所示:24h时平均只有大约33%的虫草素释放，48h后仍有大约65 %虫草素保留在海藻酸钠纳米粒中，虫草素缓慢释放。
[0045](7)将步骤(4)得到的虫草素纳米缓释囊粉状物以5% (质量/体积)比例溶解于去离子水中，涂布于微生物平板培养基上，将稀释的菌液(枯草芽孢杆菌和大肠杆菌)均匀涂布于微 生物平板培养基上培养。
[0046]结果如图9所示，图9A为枯草芽孢杆菌的抑菌情况(包含374个菌落)，图9B为大肠杆菌的的抑菌情况(包含249个菌落)；无论是枯草芽孢杆菌还是大肠杆菌，均受到明显抑制，虫草素纳米缓释囊具有良好的抑菌能力，通过菌落计数法估计枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌率，分别达到65%和69%。
[0047]实施例3
[0048](I)将购自Sigma、纯度99.9%的虫草素溶解于0.5%硼酸(去离子水稀释)中，得到浓度为100mol/L的虫草素溶液；
[0049](2)将海藻酸钠溶解于I % KOH溶液中，得到浓度为lmol/L的海藻酸钠溶液；
[0050](3)将步骤⑵得到的lmol/L海藻酸钠溶液向步骤⑴得到的lOOmol/L虫草素溶液中滴加，按照100mol/L虫草素溶液中含有的虫草素与lmol/L海藻酸钠溶液中含有的海藻酸钠的摩尔比为1:5的比例混合，30°C条件下混合30min，1000rpm离心弃上清，沉淀用去离子水I %稀释，超声分散20min，重复离心、去离子水洗涤和超声分散过程三次，得到虫草素纳米缓释球；
[0051](4)将步骤(3)得到的虫草素纳米缓释球用去离子水I %稀释、超声分散，再与浓度为0.125mol/L的CaCl2溶液等体积混合，缓慢搅拌20min，固化后离心洗涤三次，经干燥后得到虫草素纳米缓释囊粉状物；
[0052](5)将步骤(4)得到的虫草素纳米缓释囊粉状物进行场发射环境扫描电子显微镜检测，测定其直径为300nm，如图5所示。
[0053](6)称取步骤⑷得到的虫草素纳米缓释囊粉状物Ig置于容器中，加入100mL浓度为0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)，37 °C避光条件下摇床IOOrpm进行释放；在lh、4h、8h、12h、18h、24h、48h时间点各取出I管样品，15000rpm离心20min，取上清，分光光度法260nm测定虫草素浓度。
[0054]结果如图8中B线所示:24h时平均只有大约30%的虫草素释放，48h后仍有大约70 %虫草素保留在海藻酸钠纳米粒中，虫草素缓慢释放。
[0055](7)将步骤(4)得到的虫草素纳米缓释囊粉状物以5% (质量/体积)比例溶解于去离子水中，涂布于微生物平板培养基上，将稀释的大肠杆菌菌液均匀涂布于微生物平板培养基上培养。
[0056]结果如图1OA所示:大肠杆菌受到明显抑制，虫草素纳米缓释囊具有良好的抑菌能力,通过菌落计数法估计大肠杆菌抑菌率,达到60 %。
[0057]实施例4
[0058](I)将购自Sigma、纯度99.9%的虫草素溶解于1%柠檬酸(去离子水稀释)中，得到浓度为100mol/L的虫草素溶液；
[0059](2)将海藻酸钠溶解于I % NaOH溶液中，得到浓度为lmol/L的海藻酸钠溶液；
[0060](3)将步骤⑵得到的lmol/L海藻酸钠溶液向步骤⑴得到的lOOmol/L虫草素溶液中滴加，按照100mol/L虫草素溶液中含有的虫草素与lmol/L海藻酸钠溶液中含有的海藻酸钠的摩尔比为1:1的比例混合，25°C条件下混合20min，1000rpm离心弃上清，沉淀用去离子水1%稀释，超声分散20min，重复离心、去离子水洗涤和超声分散过程三次，得到虫草素纳米缓释球；
[0061](4)将步骤(3) 得到的虫草素纳米缓释球用去离子水I %稀释、超声分散，再与浓度为0.125mol/L的CaCl2溶液等体积混合，缓慢搅拌lOmin，固化后离心洗涤三次，经干燥后得到虫草素纳米缓释囊粉状物；
[0062](5)将步骤(4)得到的虫草素纳米缓释囊粉状物进行场发射环境扫描电子显微镜检测，测定其直径为300nm，如图6所示。
[0063](6)称取步骤⑷得到的虫草素纳米缓释囊粉状物Ig置于容器中，加入100mL浓度为0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)，37 °C避光条件下摇床IOOrpm进行释放；在lh、4h、8h、12h、18h、24h、48h时间点各取出I管样品，15000rpm离心20min，取上清，分光光度法260nm测定虫草素浓度。
[0064]结果如图8中C线所示:24h时平均只有大约28%的虫草素释放，48h后仍有大约70 %虫草素保留在海藻酸钠纳米粒中，虫草素缓慢释放。
[0065](7)将步骤(4)得到的虫草素纳米缓释囊粉状物以5% (质量/体积)比例溶解于去离子水中，涂布于微生物平板培养基上，将稀释的大肠杆菌菌液均匀涂布于微生物平板培养基上培养。
[0066]结果如图10B所示:大肠杆菌受到明显抑制，虫草素纳米缓释囊具有良好的抑菌能力，通过菌落计数法估计大肠杆菌的抑菌率，达到61 %。
[0067]实施例5
[0068](I)将购自Sigma、纯度99.9%的虫草素溶解于0.5%磷酸(去离子水稀释)中，得到浓度为100mol/L的虫草素溶液；
[0069](2)将海藻酸钠溶解于I % NaOH溶液中，得到浓度为lmol/L的海藻酸钠溶液；
[0070](3)将步骤⑵得到的lmol/L海藻酸钠溶液向步骤⑴得到的lOOmol/L虫草素溶液中滴加，按照100mol/L虫草素溶液中含有的虫草素与lmol/L海藻酸钠溶液中含有的海藻酸钠的摩尔比为1:10的比例混合，25°C条件下混合20min，1000rpm离心弃上清，沉淀用去离子水1%稀释，超声分散20min，重复离心、去离子水洗涤和超声分散过程三次，得到虫草素纳米缓释球；
[0071](4)将步骤(3)得到的虫草素纳米缓释球用去离子水I %稀释、超声分散，再与浓度为0.125mol/L的CaCl2溶液等体积混合，缓慢搅拌lOmin，固化后离心洗涤三次，经干燥后得到虫草素纳米缓释囊粉状物；
[0072] (5)将步骤(4)得到的虫草素纳米缓释囊粉状物进行场发射环境扫描电子显微镜检测，测定其直径为200nm，如图7所示。
[0073](6)称取步骤(4)得到的虫草素纳米缓释囊粉状物Ig置于容器中，加入100mL浓度为0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)，37 °C避光条件下摇床IOOrpm进行释放；在lh、4h、8h、12h、18h、24h、48h时间点各取出I管样品，15000rpm离心20min，取上清，分光光度法260nm测定虫草素浓度。
[0074]结果如图8中D线所示:24h时平均只有大约25%的虫草素释放，48h后仍有大约70 %虫草素保留在海藻酸钠纳米粒中，虫草素缓慢释放。
[0075](7)将步骤(4)得到的虫草素纳米缓释囊粉状物以5% (质量/体积)比例溶解于去离子水中，涂布于微生物平板培养基上，将稀释的大肠杆菌菌液均匀涂布于微生物平板培养基上培养。
[0076]结果如图1OC所示:大肠杆菌受到明显抑制，虫草素纳米缓释囊具有良好的抑菌能力,通过菌落计数法估计大肠杆菌抑菌率,达到58 %。