常染色体隐性非综合征型耳聋致病基因的制作方法[0002]耳聋(hearing 1ss1HL)是导致语言交流障碍的最常见疾病，一般新生儿耳聋的发病率可达到1/1000，在不发达国家中新生儿耳聋发病率甚至可高达1/5001。作为有着13亿人口的中国，每年有近3万名先天性神经感音性耳聋患儿出生。鉴定分离导致耳聋的致病基因，明确耳聋发生的分子机制，通过产前基因诊断和预防等有效措施来降低耳聋的发生率，是防聋治聋的根本途径之一。[0003]单基因遗传的耳聋占全部耳聋50%，其中70%是以耳聋为唯一临床表现的非综合征耳聋。非综合征型耳聋具有高度的遗传异质性，80%是常染色体隐性遗传2。占比例最大的常染色体隐性非综合征型耳聋(autosomal recessive nonsyndromic hearingloss,ARNSHL),是利用经典的耳聋家系定位和鉴定分离致病基因的研究热点。据Hereditary Hear Loss Homepage (HHH)提供的最新信息可知，已定位或分离的ARNSHL基因有63个，其中克隆分离到的致病基因有39个，已被定位但未分离到基因的有24个。[0004]2002年本发明人从山东省遗传病调查中收集到一个近亲婚配导致的ARNSHL耳聋家系。我们在排除已知耳聋基因的基础上，利用纯合子定位法，将该家系耳聋基因定位于17qll.2-12 的 D17S1850 和 D17S1818 之间 5.07cM 区域。[0005]该基因的发现将有助于对耳聋发生机制的进一步研究，为耳聋的基因诊断和预防等提供帮助。
[0006]2001年收集到山东临沂一耳聋家系，经临沂市人民医院协助确诊为非综合征性耳聋。家系图如图1。在此基础上，发明人利用外显子组测序技术，对患者进行分析，在位于候选区域内的TMEM132E基因(transmembrane protein 132E)第7外显子检测到一个错义突变，该突变被进一步证实在家系中与耳聋症状共分离；正常群体中分析排除是SNP多态位点；突变位点氨基酸在多物种进化高度保守。这些结果提示TMEM132E基因是该山东临沂ARNSHL耳聋家系的致病基因，而且是一个新的耳聋致病基因。[0007]在第一方面中，本发明涉及突变的TMEM132E基因，该基因与野生型TMEM132E基因相比有一个或多个有义突变。
[0008]有义突变是造成TMEM132E基因编码氨基酸序列变化的突变，特别是引起TMEM132E蛋白功能变化的突变。所述功能变化，包括功能增强、减弱或消失。
[0009]在一个实施方案中，本发明涉及TMEM132E基因第420位密码子CGA — CAA,导致其编码蛋白的第420位氨基酸由精氨酸一谷氨酰胺(p.R420Q，表示蛋白质序列第420位由R变成Q)。[0010]在一个实施方案中，突变TMEM132E基因为SEQ ID NO:1的序列表示。
[0011 ] 在第二方面中，本发明的突变TMEM132E蛋白，该蛋白与野生型相比有一个或多个
氨基酸变化。
[0012]优选地，所述一个或多个氨基酸变化引起TMEM132E蛋白功能变化。所述功能变化，包括功能增强、减弱或消失。
[0013]在一个实施方案中，本发明涉及TMEM132E蛋白第420位氨基酸由精氨酸一谷氨酰胺(p.R420Q)。
[0014]在另一个实施方案中，突变TMEM132E蛋白为SEQ ID NO:2的序列表示。
[0015]在第三方面中，本发明涉及一种检测耳聋或阴性携带者的方法，所述方法包括检测受试者的TMEMl32E基因或TMEM132E蛋白中是否存在突变，如果有纯合突变位点，则所述受试者被鉴定为患有耳聋，如果有杂合突变位点，则所述受试者被鉴定为耳聋阴性携带者。
[0016]在一个实施方案中，本发明的检测耳聋或阴性携带者的方法包括，获得TMEM132E基因的部分或全长基因序列并进行测序的步骤。优选地，获得TMEM132E基因的部分或全长基因序列通过PCR扩增进行。优选地，所述测序使用测序仪进行。
[0017]优选突变是有义突变，即造成TMEM132E基因编码氨基酸序列变化的突变，特别是引起TMEM132E蛋白功能变化的突变。所述功能变化，包括功能增强、减弱或消失。
[0018]在一个实施方案中，所述突变是该基因第420位密码子CGA — CAA，或其编码蛋白的第420为氨基酸由精氨酸一谷氨酰胺(p.R420Q)。
`[0019]在一个实施方案中，本发明的检测耳聋或阴性携带者的方法包括以可扩增TMEMl32E基因部分或全长的引物对进行扩增的步骤。
[0020]在一个实施案中，所述引物对为:SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4。
[0021 ] 在第四方面，本发明涉及通过PCR检测突变TMEM132E基因中使用的引物对，所述引物对可扩增TMEM132E基因部分或全长。优选地，所述引物对的扩增产物涵盖所述突变。
[0022]在一个实施方案中，所述突变是该基因第420位密码子CGA — CAA，或其编码蛋白的第420为氨基酸由精氨酸一谷氨酰胺(p.R420Q)，所述引物对分别基于该基因第420位密码子前后设计，使得扩增产物涵盖该位置。
[0023]在一个实施方案中，所述引物对是SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4。
[0024]在第五方面，本发明涉及与突变TMEM132E基因全长或部分互补的核苷酸序列，所述互补区序列涵盖所述突变。优选所述核苷酸序列较短，可以作为核酸探针，探测所述突变TMEMl32E 基因。
[0025]在一个实施方案中，所述突变是该基因第420位密码子CGA — CAA，或其编码蛋白的第420为氨基酸由精氨酸一谷氨酰胺(p.R420Q)，所述核酸探针与该基因的互补区包括该基因第420位密码子。
[0026]在第六方面，本发明涉及检测突变TMEM132E基因的试剂盒，所述试剂盒包含可扩增TMEM132E基因部分或全长的引物对。优选地，所述引物对的扩增产物涵盖所述突变。
[0027]在一个实施案中，所述引物对为:SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4。
[0028]所述突变是该基因第420位密码子CGA — CAA,或其编码蛋白的第420为氨基酸由精氨酸一谷氨酰胺(P.R420Q)，所述引物对分别基于该基因第420位密码子前后设计，使得扩增产物涵盖该位置。[0029]在一个实施方案中，所述引物对是SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4。
[0030]在第七方面，本发明涉及检测突变TMEM132E基因的试剂盒，所述试剂盒包含全长或部分互补的核苷酸序列，所述互补区序列含有一个或多个突变。优选所述核苷酸序列较短，可以作为核酸探针，探测所述突变TMEMl32E基因。
[0031]在一个实施方案中，所述突变是该基因第420位密码子CGA — CAA，或其编码蛋白的第420为氨基酸由精氨酸一谷氨酰胺(p.R420Q)，所述核酸探针与该基因的互补区包括该基因第420位密码子。
[0032]TMEM132E是新的耳聋致病基因；该突变位点可用于耳聋的基因诊断。



[0033]图1山东临沂一耳聋家系图。其中空心圆(〇)表示表型正常女性；空心正方形(□)表示表型正常男性；实心正方形()表示男性患者；实心圆(.)表示女性患者。1、I1、III和IV分别表示该家系中的第I代、第2代、第3代和第4代。图中1、2和3用于区分同一代中各成员。
[0034]图2验证实施例结果。其中，N1、N2、和N3是正常人的酶切结果；III1、III2、IV1、IV2和IV3是山东临沂ARNSHL家系成员的酶切结果，IVl和IV3是患者，其他是携带者。
[0035]序列表说明
[0036]本发明中使用了如下序列:
[0037]实施例中检测的突变TMEM132E基因的序列(SEQ ID NO:1)(下划线标明突变位置):
[0038]