专利名称：含有当归抽提物的食品以及药物组合物的制作方法 一般，蛋白激酶C(PKC)是为了开发包括最近抗癌物(carcinostatissubstance)的几种生理活性物质而成为主要目标的酶。PKC是在动物里有10几种的isoezymes，参与把荷尔蒙或生长因子等的第一次外部信号传达到细胞内的一系列信号传递过程里担当制造并调整细胞内第二次信号的重要任务。同时PKC非正常地活性化在许多癌细胞里，披露强烈的致癌物质佛波醇化合物在细胞内的收容体为PKC的事实后，活跃了通过调整PKC的抗癌物开发。美国的BMS公司在开发的bryostatin是被公开为活性化PKC的物质，这些物质极少量地含有在叫苔藓虫的原生动物里，并存在从海洋采取等的缺点，至今为止还没有化学合成而产业活用困难的状态。本研究者等在G7课题的第二阶段研究期间通过3年的研究发现了具有跟bryostatin类似活性的物质紫花前胡素以及紫花前胡素肉桂酯，曾经阐明过这些的性质与bryostatin类似(科学技术部课题编号M1-98-08-00-0021有用PKC激动剂(紫花前胡素类))。这些物质与bryostatin比较有从植物体抽提的优点，植物体内的含量为3-7％而相当高的优点，分子量小且可化学合成的优点，而且相对地毒性小的优点等由此判断为比bryostatin优秀。为了这些物质的早期产业化应尽快地进行为大量生产工程的开发和产业化的基础技术开发。本研究者等披露的与bryostatin类似性质的紫花前胡素类是虽然性质上与bryostatin类似，但具有毒性很少、分子量小而可化学合成、从植物抽提的情况下也充分地能生产等的好多优点。而且根据研究结果紫花前胡素类是作为白血病治疗剂以及肾毒性减轻剂的效能非常优秀，特别是对因糖尿病的肾损伤和重金属或药物的滥用的肾毒性的减轻效果优秀。这些肾保护效果是在先进国家也还没有报告出来的新的结果，而目前为止还没有形成世界性的市场，但作为今后的世界性的肾保护剂其市场性非常大。如果作为紫花前胡素类的白血病治疗剂以及肾毒性减轻剂的效能成为产业化时白血病的治疗效果是会给癌患者带来新的希望，考虑患肾衰竭症的许多患者一生因肾透析而受苦以及因透析而所需的许多社会、个人的费用时紫花前胡素的肾保护效果是增进糖尿病患者的健康，预防因重金属污染以及药物滥用的肾损伤，并通过这些可大大地贡献于福利社会。本发明是有关原产地为韩国的当归抽提物的内容，具有肾毒性抑制和对糖尿并发症的肾衰竭症的预防效果为特点的当归抽提物单独或者包括许可的带菌者的组合物的内容。当归的原产地是韩国，其使用范围是补血剂而以韩方药剂来利用，最近报告为韩国产特有物质的紫花前胡素和主要成分Decursinol具有改善血流作用和Helicobacter作用。本发明者等阐明的纯粹精制的紫花前胡素具有肾毒性抑制和对糖尿并发症的肾衰竭症的预防效果通过动物实验证明了(PCT/KR99/00632)。而且比现有的方法简单并可大量确保抽提量的浓缩方法来制造，制造成液体后给实验动物以口服服用时能确认在肠内容易地吸收。目前为止紫花前胡素以及紫花前胡素肉桂酯是结构异构体来被广知，本研究者等一直研究了其作用并确立了其分析法。紫花前胡素是在室温里以固体状态存在而紫花前胡素肉桂酯是在零下20度也以液体状态存在，本研究者等的分析结果是确认了在当归里紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯的比率为约3∶2。而且，口服服用后经过吸收代谢成紫花前胡素在血液内存在，所以用口服服用的结果是这些成分容易吸收在活体内。用现有的酒精抽提方法或70％酒精抽提方法抽提的当归紫花前胡素是占浓缩液的35％左右其量不超过50％，但本研究者的结果是当使用99％以上的乙醇以及药典酒精时其浓缩的含有量高而达到最大含有75％以上的结果，特别是开发其含有量中把紫花前胡素肉桂酯和紫花前胡素分离确定的方法而就知道准确的含量。

本发明的目的在于利用当归抽提浓缩物上存在的紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯经过口服服用后容易吸收到活体上的事实，提供具有肾毒性抑制效能和对糖尿并发症的肾衰竭症的抑制效能以及对糖尿的高血压有效果的可口服服用的含有当归抽提物的食品以及药物组合物。
此外，本发明的目的在于制造大量含有主要成分的紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯并使用在口服服用的目的上。
为了达成如上述的目的，本发明的含有当归抽提物的食品以及药物组合物是抽提浓缩当归(Angelica gigas，Nakai)里含有的紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯对糖尿性高血压以及肾毒性减轻上有效能以药片、胶囊剂、水剂(液体剂)以及粉末形态单独或复合可服用的赋形剂等添加剂的形态制造并口服服用为特点。
此外，抽提浓缩当归里含有的紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯，使对糖尿性高血压以及肾毒性减轻上有效能而成人一日服用量为包含100mg至500mg紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯为特点。


图1是从当归抽提物里分析的紫花前胡素以及紫花前胡素肉桂酯的结果用色谱图表示的示意图。RT＝29.34是指紫花前胡素，RT＝30.84是指紫花前胡素肉桂酯，其比例为3∶2。
图2是紫花前胡素的含量检测实验结果，DecursinRT＝7.84。
图3是紫花前胡素的含量检测实验结果，DecursinolRT＝1.87。
图4是标准Decursinol的HPLC图。
图5是对照组在0hr的HPLC图。
图6是服用1小时后的HPLC图。
图7是服用2小时后的HPLC图。
图8是服用4小时后的HPLC图。
图9是服用8小时后的HPLC图。
图10显示了紫花前胡素对LLC-PK1细胞的cisplatin毒性的抑制效果。
图11显示了不同PKC激活剂对cisplatin引起的肾损伤的效果。
图12显示了紫花前胡素对cisplatin引起的LLC-PK1细胞凋零的抑制效果，A)是对照组，B)是Cispiatin(CDDP)处理组，C)是紫花前胡素处理组D)是把Cispiatin和紫花前胡素同时处理的组。

下面，根据附图详细地说明本发明的内容。
在以下的实验例子里，例证了从当归抽提紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯的方法和分析结果。另外例证了以口服服用为目的制药抽提浓缩物并吸收后分析血液的结果。还例证了有关抽提浓缩物的效能。
实施例1高含量的紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯浓缩物的制造方法1)、利用温度差的抽提方法从当归分离浓缩紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯的方法，且利用韩国产以及北朝鲜产的当归实施实验。为制备食品用料，使用了药典酒精以及酒精乙醇并使用精制水。把当归原料以40目以下细地粉碎并干燥成水分含量为5％以下后，用药典酒精或酒精乙醇(以下为乙醇)浸泡，添加当归的2倍到4倍后在摇动的状态下常温里抽提12小时并过滤。这种情况的浓缩物里含有的紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯的含量为37.7％。而且紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯作为当归原料显示了3.92％。把这些乙醇分离物在-20℃放置20小时以上，并利用温度差对乙醇溶解性低的物质沉淀过滤。把这些分离物紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯浓缩到38.1％。浓缩这些分离物并在温度为80℃以上蒸发乙醇回收剩下的固体物。分析这些回收物的结果是，紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯为64.24％，而具备了相当高的高含量。
2)、例证利用溶解度差的抽提方法从当归分离浓缩紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯的方法，且利用韩国产以及北朝鲜产的当归实施实验。为食品用而使用了药典酒精以及酒精乙醇并使用水时使用了精制水。把当归原料以40mesh以下细地粉碎并干燥成水分含量为5％以下后用药典酒精或酒精乙醇(以下为乙醇)浸泡，并添加当归的2倍到4倍在摇动的状态下而且常温抽提12小时并过滤。把过滤的乙醇在温度为80度以上蒸发并回收剩下的固体物。向回收物放入2倍左右的乙醇后，溶解并超声波处理来补充溶解。把这些过滤后取得乙醇层添加大量(约乙醇的20倍)的水溶液(0.05％tween 80)而收取沉淀的物质。这是利用了目的主成分紫花前胡素或紫花前胡素肉桂酯对乙醇溶解而对水不溶解的性质。把这些收取物干燥并消除水分后分析含量的结果是，含有了76.71％的紫花前胡素或紫花前胡素肉桂酯。这是与一般的抽提里含有30％左右的紫花前胡素或紫花前胡素肉桂酯比较时判断为相当的浓缩物。
3)、例证利用超声波的方法从当归分离浓缩紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯的方法，且利用韩国产以及北朝鲜产的当归实施实验。为使用为食品用而使用了药典酒精以及酒精乙醇。把当归原料以40mesh以下细地粉碎并干燥成水分含量为5％以下后，把乙醇添加到当归的2倍到4倍并摇动的状态下在常温里抽提12小时，在这操作过程中利用超声波以10分钟2次以上进行超声波处理。把这些过滤后过滤的乙醇层在温度为80度以上蒸发并回收剩下的固体物。把这收取物的含量分析的结果是，从当归里可抽提9％以上的紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯。这是比现有的当归里不处理超声波的抽提方法抽提2倍左右多的紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯的结果而浓缩物里显示了88％。
4)、例证利用冷浸的抽提方法从当归分离浓缩紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯的方法，且利用韩国产以及北朝鲜产的当归实施实验。为使用为食品用而使用了药典酒精以及酒精乙醇。把当归原料以40mesh以下细地粉碎并干燥成水分含量为5％以下后把乙醇添加到当归的2倍到4倍并摇动的状态下四天冷浸后抽提。此外为利用为比较数据实施了用加热抽提的方法。把这抽提物过滤后收取乙醇层并把这乙醇层在80度的温度里挥发乙醇且收取剩下的半固体状态的残留物，分析的结果是经过加热抽提的情况是紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯的含量为38％而四天冷浸的情况是收取了59.39％。
实施例2以液体剂制药后在溶液里的稳定性实验和口服服用后的分析血液实验1)、溶解(乳化液形态)紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯的抽提物是不溶解在水里并在60％乙醇里的溶解度为6.6mg/ml左右，所以引进了高容量来液体化时析出并使溶解的制药技术而均匀化。为了均匀的含量(含量的均匀性)用乙醇一次性地完全溶解后用液体剂来溶解。把100mg紫花前胡素在1ml的酒精里溶解后制药的水溶液里使乳化，这制药的水溶液的组成与如下的例示一样。把这些以口服服用的目的稀释水溶液(3.3gram tween80，120gram HPMC，D-sorbitol 1.2kg，柠檬酸30gram，Sucrarose 2.4gram，木糖醇2.4kg)制成液体剂。其中柠檬酸是为维持酸性条件，也可使用其它的酸性物质。本研究者等曾经研究过紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯在碱性里分解的性质和酸性条件里稳定的性质，而最终把酸度维持到pH3.5左右。
2)、稳定性实验实验的条件是在40℃，70％相对湿度里按时间检查了含量实验，用分析法使用了高速液体色谱法(HPLC)。分析结果是在加速条件里可维持稳定性。
紫花前胡素RT＝7.84，如图2所示。
DecursinolRT＝1.87，如图3所示。
结果如表1所示。
表1稳定性实验结果

3)动物实验(1)紫花前胡素服用量(口服服用)50mg/kg鼠(2)用组数以及采取时间如表2所示。
表2用组数以及采取时间

*非服用对照组5条服用试验组20条(3)紫花前胡素溶液紫花前胡素100mg/ml(乙醇)(4)服用把100mg/ml(乙醇)制药化的水溶液里稀释10倍使悬浮，每200g鼠服用1ml。
(5)分析采取血液分离血浆后用HPLC分析。
利用实验用鼠按时间采取并确认口服服用的状态。
这是为开发成可口服服用的液体形态，口服服用溶解的紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯后进行实验，实验的执行是在KYUNGSUNG大学校药学大学的药理实验室里执行。实验结果的分析是在BINEX研究室里进行。一次性地口服服用紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯后，确认是否吸收为分析易于分析的Decursinol分离血清后处理M乙醇1ml取得溶解的上等液并确认实验。
服用量以及服用数如表3所示。
表3服用量以及服用数

结果分析标准液的制造是把Decursinol 50mg溶解在甲醇里并制造50ml。
HPLC分析条件是使用Hitachi HPLC，圆柱是使用COSMOSILC18，移动相是使用MeOH∶H2O＝60∶40，流速为1.0ml/min，检出器波长为280nm。注射体积为20ul。
标准Decursinol如图4所示。
对照组在0hr的结果如图5所示。
服用1小时后的结果如图6所示。
服用2小时后的结果如图7所示。
服用4小时后的结果如图8所示。
服用8小时后的结果如图9所示。
结果是在RT 3.24里分离Decursinol。吸收紫花前胡素以后在活体内里分解而确认Decursinol的分解，Decursinol自己也几乎无毒性的物质可认为不存在因代谢产物的毒性问题。由此确认口服服用后的吸收。
紫花前胡素的结构如式I所示。
式I紫花前胡素肉桂酯的结构如式II所示。
式II实施例3紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯的对糖尿性疾病的效能实验糖尿的血管疾病的病因非常复杂，糖尿病的许多代谢变化里高血糖成了引起血管疾病的最重要的因素。高血糖导致的血管平滑肌细胞(VSMC)成长的增加引发动脉硬化或高血压。但是与高血糖和血管疾病有联系的信号传达机理还不清楚。高血糖增加甘油二酯(DAG)，DAG的增加而活性化蛋白激酶C(PKC)途径，报告为高血糖发生血管疾病。由此认为寻找抑制PKC信号途径的物质是治疗或预防糖尿并发症的好方法中的之一。所以在这期间用PKC抑制剂研究了许多，但是PKC抑制剂其自己的毒性和无特异性成了问题。
紫花前胡素是作为当归抽提物的PKC激动剂，阻止癌细胞的增殖，与强力的PKC激动剂的佛波酯不同地报告为把活性化的PKC更快地下控。所以本实验里对是否被紫花前胡素阻止与其导致体内高葡萄糖导致的VSMC的增殖以及其阻止机理进行了研究。
确认根据葡萄糖浓度是否增加血管平滑肌细胞中的A10细胞的生长，为了最佳化高血糖的状态在不同的葡萄糖浓度里培养A10细胞。用1×103细胞/ml接种到96孔平板里，16小时后用5、10、20、30、40、50mM D-葡萄糖浓度的培养基，更换72小时后用MTT assay测定存活细胞数。72小时后A10细胞的增殖是根据葡萄糖浓度的增加而明显地增加。在50mM D-葡萄糖里的细胞增殖比5.5mM D-葡萄糖约增加为15％。
一般普通葡萄糖是5.5mM D-葡萄糖而高葡萄糖是使用了25mMD-葡萄糖为较多，可是为了加大普通葡萄糖与高葡萄糖的差异在本实验里高葡萄糖使用30mM D-葡萄糖。用3×103把A10细胞接种到6孔平板里，16小时以后用5.5mM D-葡萄糖和30mM D-葡萄糖更换培养基。细胞培养五天，每天用台盼蓝(trypan blue)染色计算存活细胞数。在高葡萄糖里培养的细胞比在普通葡萄糖里培养的细胞更长地显示，结果是在高葡萄糖里的细胞比在普通葡萄糖里的细胞更长为约20％左右。
为调查在被高葡萄糖导致的A10细胞增殖里的紫花前胡素的效果，A10细胞里处理不同浓度的紫花前胡素(1、5、10、25mM)，三天后计算。把紫花前胡素25mM在普通葡萄糖与高葡萄糖里处理的情况是都比没有处理紫花前胡素的对照组约20％左右阻止细胞的增殖。可是高葡萄糖里处理5、25mM紫花前胡素的时候无细胞毒性的控制水平来阻止增殖。为了确认紫花前胡素是否有细胞毒性还是阻止细胞的增殖，分别测定活细胞和死细胞的数量。其结果是处理紫花前胡素时候活细胞为98％以上。总的来说，在普通葡萄糖里处理紫花前胡素时候不影响细胞的生长，而在高葡萄糖里处理的时候无细胞毒性地根据浓度阻止细胞增殖。显示紫花前胡素肉桂酯和Decursinoltiglate比紫花前胡素的效果更好。为了再一次确认其效果，在A10细胞里处理1、5、10、25mM的紫花前胡素肉桂酯和Decursinol tiglate后，经三天以后用台盼蓝计算。紫花前胡素肉桂酯和Decursinol tiglate在普通葡萄糖里不影响细胞的生长，而在高葡萄糖里根据浓度阻止细胞增殖。紫花前胡素肉桂酯25mM是在普通葡萄糖，高葡萄糖里都阻止约20％左右的细胞增殖，但5和10mM是在高葡萄糖里无细胞毒性地阻止细胞增殖。Decursinol tiglate是在普通葡萄糖里物细胞毒性地根据浓度阻止被高葡萄糖导致的细胞增殖。
实施例4紫花前胡素的ciplatin的肾毒性减轻效果为了调查根据紫花前胡素的ciplatin的肾毒性减轻效果，和50uM的ciplatin一起处理不同浓度的紫花前胡素。24小时以后调查LDH的放出量和确认流动细胞的数量而调查细胞的死亡。如图10所示，根据紫花前胡素浓度的增加而增加生存细胞数量。这是通过放出的LDH量减少和流动细胞的数量减少来可确认。
为确认这些紫花前胡素的保护效果是否为PKC激动剂的效果，使用不同的PKC激动剂来确认cisplatin的毒性减轻效果。与以肿瘤启动子来认知的PMA合成的DAG，还使用以独特的PKC激动剂来认知的bryostatin来实验的结果没有观察到cispiatin(CDDP)的毒性减轻效果。从这些结果可知根据紫花前胡素的cispiatin毒性减轻效果是具有与PKC激动剂无关的。PKC是细胞生长上起重要作用的蛋白质而这些结果是提示cispiatin的细胞毒性与一般细胞的信号传达过程不同，如图11所示。
为确认紫花前胡素的肾细胞保护效果与FACS实施电泳现象。利用DNA上奇特地结合的propidium碘化物实施FACS的结果是，得到了抑制被cisplatin发生的细胞死亡的结果，电泳细胞内的DNA的结果是减小作为凋零标记的DNA梯度，如图12所示，由此看到紫花前胡素防止Apotosis的结果。
通过如上述的实验结果确认紫花前胡素具有抑制cisplatin引起的细胞毒性的效果。而且这些紫花前胡素的活性是跟以PKC激动剂来认知的紫花前胡素有所不同的作用引起的。
实施例5
利用当归浓缩抽提物制药成液体剂而每人一天把300mg的紫花前胡素以及紫花前胡素肉桂酯一日一回或者一日三回分量服用的结果是得到患者状态的变化里小便的颜色变为清晰而且小便的臭味消失的结果。还有一日300mg服用为一日两回或者三回的结果是导致下泻的现象而得到服用量较多的推测结果。由此判断为一日300mg一回或者一日两回150mg为好。
发明是利用原产地为韩国的当归以主成分来显示效果的紫花前胡素和紫花前胡素肉桂酯且含有其一定量并制造的口服用形态的具有对肾毒性减轻以及糖尿并发症的肾衰竭症的抑制效果，糖尿性高血压上有效果为特点的组合物的内容。对慢性疾病糖尿和因服用抗癌物等而担心肾毒性的患者可服用。


本发明是有关利用原产地为韩国的当归(Angelica gigas，Nakai)根据肾毒性减轻以及糖尿并发症的肾衰竭症的抑制效果，对糖尿性高血压有效果为特点的含有当归抽提物的食品以及药物组合物的内容。而且本发明是作为肾毒性抑制成分，当归抽提物中包括紫花前胡素以及紫花前胡素肉桂酯为特点，提供在食品(健康食品以及功能性食品)以及药物组合物上使用的当归抽提物单独以及包括人体上许可的带菌者的组合物。