专利名称：一种油茶无性系组培外植体脱毒方法油茶(CaaeBia 5/7/7)是山茶科( eacae)山茶属ifamellia)中种子含油量高、具有生产价值的油用物种的总称，是我国特有的优质木本油料树种，与油棕、椰子和油橄榄并称为世界四大木本油料树种(庄瑞林，中国油茶[M]，北京中国林业出版社，1988)。我国现有油茶栽培面积4531万亩，主要分布于南方14个省(区)，油茶种子榨取的茶油风味独特，营养丰富，脂肪酸组成合理，不饱和脂肪酸含量高达90%，油酸含量80%以上，不含人体难以 吸收的芥酸和山俞酸，也不含会引起人体血压增高而导致血管硬化的胆固醇，油质优于橄榄油等其它食用油，是理想的食用油(陈永忠，杨小胡，彭邵锋，等，我国油茶良种选育研究现状及发展策略[J]，林业科技开发，2005，19 (4):1-4)。茶油的副产品茶枯和茶壳还可以通过综合利用提取茶皂素、磨制刨光粉和发酵高蛋白饲料等，油茶果壳可生产活性碳和提取鞣料等，所以通过深加工和综合利用可大幅度提高油茶产品的附加值。油茶适应性广、耐瘠薄，是南方低山、丘陵和岗地很好的经济林树种之一，不与粮、棉争地，而且还具有一年种植，多年受益的特点，丰产期长达80年，在我国南方农村经济和生态建设中占有很重要的地位(黎先胜，我国油茶资源的开发利用研究[J]，湖南科技学院学报，2005,26 (11)127-129)，发展油茶生产有利于缓解我国食用油长期依赖进ロ，供需紧张的矛盾，对提高我国国民经济和人民生活水平具有重大意义。油茶种苗繁育主要采用播种育苗和芽苗砧嫁接法。过去油茶繁殖方法主要是播种育苗，后代分化严重，难以保持母株的优良性状，一般61年始果，产量高低不一。目前油茶种苗繁育主要采用无性繁殖方式一芽苗砧嫁接法，该方法技术难度大，嫁接成活率和合格苗出圃率均较低，出圃时间长达2年，造林成活率不稳定，造林成本高，林相整齐度差，苗木繁殖系数低，难以满足全国油茶产业发展对油茶优良无性系的需求，迫切需要研究油茶优良无性系高效组培快繁新技木。组培快繁技术是ー种广泛用于农业、林业的无性繁殖方法，具有繁殖速度快、方法简单、操作容易，材料消耗少，不受季节和地域限制的特点，同时子代能够保持母株的优良遗传特性。因此，研究油茶优良无性系组培快繁技术，对缓解油茶苗木紧张、加快油茶产业发展，缓解我国食用油紧张局面，推动农村经济和社会主义新农村建设具有重大战略意义。植物组织培养需经过初代、继代、生根、移栽四个阶段，得到完整植株。初代培养阶段无菌材料的获取是组培能否成功的关键，因植物材料表面常常带有各种微生物，而培养基营养全面，适合微生物生长，且接种后植物组织失去了表皮的保护，抵抗力不强，所以如果灭菌不彻底的话，微生物将迅速滋生，抑制甚至杀死植物组织细胞，使前功尽弃。目前，对油茶组织培养外植体脱毒技术的研究很少，黄雅莉等研究了不同外植体消毒时间对油茶组织培养的影响，研究结果表明，HgCl2消毒6min效果最好，油茶岑软2号与岑软3号的成活率分别达到71%与73% (黄雅莉，张日清，马锦林，等，油茶愈伤组织和芽诱导培养条件的筛选.经济林研究，2010，28 (1):30-34)。刘海龙等对油茶不同外植体的灭菌条件进行了研究，研究结果表明，以油茶种子、茎段为外植体，采用酒精、升汞、高锰酸钾3种灭菌剂，探讨不同处理对外植体污染和种子萌发的影响。结果表明，油茶茎段较好的灭菌方法毛刷刷洗+75%酒精l(Tl5s+0. l%HgCl2l(Tl5min，污染率最低为24. 5% ;新萌条较好的灭菌方法75%酒精4 7s+0. l%HgCl25 6 min，污染率最低为14. 3% ;种子灭菌的条件O. 5%KMn040 24 h+75% 酒精Tl5 min+O. l%HgCl22(T40 min (不剥壳去皮)，75% 酒精 30s+0. l%HgCl2 8 min (剥壳去皮)，这2种处理污染率均较低，种子发芽率相差不大(刘海龙，陈晓明，蔡玲，油茶不同外植体灭菌条件研究，广西林业科学，2010，39 (2) :61-63，68)。毕方铖等用2. 5%次氯酸钠、消毒时间20min对腋芽消毒效果最好，污染率为10%，芽的萌发诱导率为85%(毕方铖，谭晓风，张智俊，等，油茶离体培养诱导再生植株的研究[J].经济林研 究，2004，22 (2) :5-9)。根据现有技术表明，油茶组培外植体脱毒多采用“两步式消毒法”，即75%こ醇5-30秒+无菌水2-3次+0. l%HgCl25-40分钟+无菌水5_6次，采用这种方法材料保存率低，由于灭菌时间难以控制，若时间太短，灭菌不彻底，材料会因微生物滋生死亡，若灭菌时间过长，灭菌剂会对植物组织细胞产生毒害而萌发困难，导致萌芽率低。
本发明g在克服现有技术中的不足，提供一种油茶无性系组培外植体脱毒方法。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为 所述油茶无性系组培外植体脱毒方法，包括如下步骤 (1)将油茶无性系组培外植体在O 10°c条件下进行低温预处理； (2)将低温预处理后的油茶无性系组培外植体用こ醇消毒，冲洗，然后用HgCl2处理；其中，所述的HgCl2处理是分两次以上对油茶无性系组培外植体进行间歇性处理，HgCl2处理的总时间为4 20分钟，HgCl2每处理一次后用水冲洗。こ醇消毒和单次HgCl2处理的操作过程是本领域的常规操作步骤和条件。例如こ醇消毒是采用体积百分比浓度75%的こ醇消毒处理，单次HgCl2处理是用质量百分比浓度O. 1%的HgCl2处理；其中的处理时间可根据不同外植体并结合本领域常识作适当调整。优选地，步骤(I)是将油茶无性系组培外植体放置于4°C恒温箱低温处理3-7天；步骤(2)是将低温处理后的油茶无性系组培外植体用体积百分比浓度75%的こ醇消毒10 15秒，无菌水冲洗3 4次，然后用质量百分比浓度O. 1%的HgCl2处理2 10分钟，无菌水冲洗3 4次，然后再用质量百分比浓度O. 1%的HgCl2处理2 10分钟，无菌水冲洗6 8次。进ー步，本方法还包括如下步骤将经步骤(I)低温处理后的油茶无性系组培外植体取出后进行预处理，然后在O. 1%的多菌灵溶液中浸泡2 4分钟，流水冲洗2 4小时，然后再进行步骤(2)的处理。其中，所述的油茶无性系组培外植体为从油茶健壮植株上剪取的当年生带芽枝条带叶枝条或未成熟果实。所用的组培外植体可以依据现有技术中公布的方法获得。当外植体为当年生带芽枝条时，将经步骤(I)低温处理的带芽枝条取出后剪成一叶一芽的茎段，即，将叶片剪掉，保留叶柄，然后在质量百分比浓度O. 1%的多菌灵溶液中浸泡2 4分钟，流水冲洗2 4小时，然后再进行步骤(2)的处理。其中，所述的步骤(I)低温处理是指在4°C恒温箱中水培。当外植体为当年生带叶枝条时，将经步骤(I)低温处理的带叶枝条取出后剪取叶片，将叶片在在质量百分比浓度O. 1%的多菌灵溶液中浸泡2 4分钟，流水冲洗2 4小时，然后再进行步骤(2)的处理。其中，所述的步骤(I)低温处理是指在4°C恒温箱中水培。当外植体为未成熟果实时，将经步骤(I)低温处理的未成熟果实的种子取出，去掉外种皮，将种子用在质量百分比浓度O. 1%的多菌灵溶液中浸泡2 4分钟，流水冲洗2 4小时，然后再进行步骤(2)的处理。上述方法中步骤(2)的处理过程在超净工作环境下完成。与现有技术相比，本发明方法的有益效果为 本发明方法主要包括外植体预处理及“多步式消毒法”步骤，与传统的“两步式消毒法”不同，采用本发明的脱毒方法能使外植体污染率低于6. 7%，萌芽率达95. 5%以上。本发明方法操作简单，污染率低，克服了传统保存率低的技术问题。

图I是油茶组培苗接种后的实验结果 图2是油茶组培苗萌芽状态的实验结果 图3是油茶组培苗展叶状态的实验结果 图4是油茶叶片愈伤组织诱导的试验结果 图5是油茶种子愈伤组织诱导的试验结果图。

从油茶健壮植株上剪取当年生带芽枝条，采回后放置于4°C恒温箱水培3天；将枝条剪成一叶一芽的茎段，用质量百分比浓度O. 1%的多菌灵溶液浸泡3分钟，浸泡后流水冲洗2小时；在超净工作台上，先用体积百分比浓度75%こ醇消毒10秒，用无菌水冲洗4次，然后用质量百分比浓度O. 1%的HgCl2处理3分钟，无菌水冲洗4次，然后再用质量百分比浓度
O.1%的HgCl2处理3分钟，无菌水冲洗8次，污染率为6. 7%，萌芽率为100%。具体操作如下
(1)4月份从油茶健壮植株上剪取当年生带芽枝条，带回后放入I升的烧杯中，加入200毫升纯净水，放入4°C恒温箱水培3天。
(2)枝条从恒温箱取出后剪成一叶一芽的茎段(将叶片剪掉，保留叶柄)，然后用质量百分比浓度O. 1%的多菌灵溶液浸泡2 4分钟，浸泡后流水冲洗2小吋。(3)将流水冲洗后的外植体放置超净工作台上,先用体积百分比浓度75%こ醇消毒10秒，用无菌水冲洗3次,然后用质量百分比浓度O. l%HgCl2处理2分钟,无菌水冲洗3次，然后再用HgCl2处理3分钟，无菌水冲洗6次，冲洗完以后用剪刀将茎段两端剪掉2 3毫米，同时将叶柄剪掉，然后接种于初代培养基上，培养基用300ml的广ロ瓶分装，每瓶30ml，封口膜包扎，在121°C和I. lkg. cm_2条件下，用高压蒸汽灭菌锅灭菌20min。培养条件的筛选在培养温度为25±2°C，光照1500 2000LX，每日光照时间为12h的培养室中培养。其中，所用培养基为本领域常规培养基。结果参见图I至3。
实施例2
从油茶健壮植株上剪取当年生带芽枝条，采回后放置于4°C恒温箱水培5天；将枝条剪成一叶一芽的茎段，用质量百分比浓度0. 1%的多菌灵溶液浸泡3分钟，浸泡后流水冲洗2小时；在超净工作台上，先用体积百分比浓度75%乙醇消毒15秒，用无菌水冲洗3次，然后用质量百分比浓度0. 1%的HgCl2处理3分钟，无菌水冲洗3次，然后再用质量百分比浓度0. 1%的HgCl2处理4分钟，无菌水冲洗6次，污染率为4. 4%，萌芽率为95. 5%。具体操作中的其他步骤同实施例I。 实施例3
从油茶健壮植株上剪取当年生带芽枝条，采回后放置于4°C恒温箱水培7天；将枝条剪成一叶一芽的茎段，用质量百分比浓度0. 1%的多菌灵溶液浸泡3分钟，浸泡后流水冲洗3小时；在超净工作台上，先用体积百分比浓度75%乙醇消毒15秒，用无菌水冲洗3次，然后用质量百分比浓度0. 1%的HgCl2处理3分钟，无菌水冲洗3次，然后再用质量百分比浓度0. 1%的HgCl2处理5分钟，无菌水冲洗8次，污染率为0%，萌芽率为97. 8%。具体操作中的其他步骤同实施例I。实施例4
从油茶健壮植株上剪取当年生枝条，采回后放置于4°C恒温箱水培5天；水培后剪取叶片，将叶片用质量百分比浓度0. 1%的多菌灵溶液浸泡2分钟，浸泡后流水冲洗2小时；在超净工作台上，先用体积百分比浓度75%乙醇消毒10秒，用无菌水冲洗3次，然后用质量百分比浓度0. 1%的HgCl2处理2分钟，无菌水冲洗3次，然后再用质量百分比浓度0. 1%的HgCl2处理2分钟，无菌水冲洗6次，污染率为4%，愈伤组织诱导率达100%。具体操作如下
(1)3-5月份从油茶健壮植株上剪取当年生枝条，带回后放入I升的烧杯中，加入200毫升纯净水，放入4°C恒温箱水培5天。
(2)枝条从恒温箱取出后剪取叶片，将叶片用质量百分比浓度0.1%的多菌灵溶液浸泡2分钟，浸泡后流水冲洗I小时。(3)将流水冲洗后的外植体放置超净工作台上,先用体积百分比浓度75%乙醇消毒10秒,用无菌水冲洗3次,然后用质量百分比浓度0. 1%的HgCl2处理2分钟,无菌水冲洗3次，然后再用质量百分比浓度0. 1%的HgCl2处理2分钟，无菌水冲洗6次，冲洗完以后用剪刀剪除叶缘、叶柄及叶脉，将叶片剪成0. 5cm*0. 5cm，然后接种于诱导培养基上，培养基用300ml的广口瓶分装，每瓶30ml，封口膜包扎，在121°C和I. lkg. cm_2条件下，用高压蒸汽灭菌锅灭菌20min。培养条件的筛选温度为25±2°C ;光照条件暗培养20天后转入光培养，光培养条件为光照1500 2000LX，每日光照时间为12h。其中，所用培养基为本领域常规培养基。实施例5
7月份从油茶健壮植株上剪取油茶未成熟果实，采回后放置于4°C恒温箱低温处理5天；低温处理后将种子取出(去掉果皮)，然后将外种皮去掉，将种子用质量百分比浓度0. 1%的多菌灵溶液浸泡3分钟，浸泡后流水冲洗2小时；在超净工作台上，先用体积百分比浓度75%乙醇消毒15秒，用无菌水冲洗3次，然后用质量百分比浓度0. 1%的HgCl2处理3分钟，无菌水冲洗3次，然后再用质量百分比浓度0. 1%的HgCl2处理5分钟，无菌水冲洗6次，污染率为3%，愈伤组织诱导率达100%。具体操作如下
(1)7月份从油茶健壮植株上剪取油茶未成熟果实，带回后放入4°C恒温箱低温处理5
天。·
(2)果实从恒温箱取出后去掉果皮及外种皮，然后将种子用质量百分比浓度0.1%的多菌灵溶液浸泡3分钟，浸泡后流水冲洗2小时。(3)将流水冲洗后的外植体放置超净工作台上,先用体积百分比浓度75%乙醇消毒15秒,用无菌水冲洗3次，然后用质量百分比浓度0. 1%的HgCl2处理3分钟,无菌水冲洗3次，然后再用质量百分比浓度0. 1%的HgCl2处理5分钟，无菌水冲洗6次，冲洗完以后用手术刀剪除内种皮，然后接种于诱导培养基上，培养基用300ml的广口瓶分装，每瓶30ml，封口膜包扎，在121°C和I. lkg. cm_2条件下，用高压蒸汽灭菌锅灭菌20min。培养条件的筛选在培养温度为25±2°C，光照1500 2000LX，每日光照时间为12h的培养室中培养。其中，所用培养基为本领域常规培养基。实施例6
10月份从油茶健壮植株上剪取油茶成熟果实，采回后放置于4°C恒温箱低温处理7天；低温处理后将种子取出(去掉果皮)，然后将外种皮去掉，将种子用质量百分比浓度0. 1%的多菌灵溶液浸泡4分钟,浸泡后流水冲洗4小时；在超净工作台上,先用体积百分比浓度75%乙醇消毒15秒，用无菌水冲洗4次，然后用质量百分比浓度0. 1%的HgCl2处理8分钟，无菌水冲洗4次，然后再用质量百分比浓度0. 1%的HgCl2处理10分钟，无菌水冲洗8次，污染率为5%，愈伤组织诱导率达98. 7%。具体操作中的其他步骤同实施例5。


本发明公开了一种油茶无性系组培外植体脱毒方法，包括如下步骤(1)将油茶无性系组培外植体进行低温预处理；(2)将低温预处理后的油茶无性系组培外植体用乙醇消毒，冲洗，然后用HgCl2处理；其中，所述的HgCl2处理是分两次以上对油茶无性系组培外植体进行间歇性处理，HgCl2处理的总时间为4～20分钟，HgCl2每处理一次后用水冲洗。本发明的方法操作简单，污染率低，克服了传统保存率低的技术问题。