专利名称：一种地黄组培快繁方法塊歲{Rehmannia glutinosa Libosch.)是玄参科多年生草本植物,主要分布于我国河北、河南、山东、山西、江苏、湖北等省区，在日本、朝鲜等地也见地黄栽培品种。地黄在我国已有1500年的栽培历史，是最早进行栽培的药用植物之一。其中尤以河南的怀地黄“处后天下之中，名产地黄，河南地厚水浮，得中央湿土之气而生内含润泽”，品质最优，经各种炮制方法入药后药效奇佳，素有“怀参”之称，是我国著名的“四大怀药”之一，也是我国中医药体系中最为常用的中药材之一。 但地黄却存在着非常严重的连作障碍(或复种连作)问题，其忌地年限需8-10年，即种植一茬地黄需要间隔约8-10年的时间方能再种。且地黄为高度的杂合体，亲本自交不亲和，其杂交后所产子代会出现严重性状分离，又由于地黄种子繁殖幼苗生长矮小不能进行正常膨大，所以长期以来均以地黄块根为材料，进行倒栽留种的无性繁殖。但经过多代留种栽培后，块根作为靠营养繁殖材料极易遭受病毒侵染，易感染细菌和真菌病害，在多种自然因素的影响下导致地黄表现出更为严重的连作障碍问题，严重制约了地黄产业的生产和发展。近年来，地黄的离体培养及快速繁殖体系的研究逐渐增多，逐步建立高效的再生系统，从一定程度上能缓解地黄品种退化问题，而且通过诱导地黄叶片、块根、顶芽等组织作为外殖体材料，获得脱病毒植株是规避地黄病毒病的有效途径。但传统的地黄组织培养方法需经过脱分化形成愈伤组织，再分化诱导成苗后，经生根诱导和炼苗移栽后才可成活，所用步骤较为繁琐，传统地黄组培方法培获得的幼苗生长脆弱，移栽后成活率低。传统地黄组织培养所用外殖体材料多用地黄叶片、块根、顶芽，虽然取材容易，但操作时外殖体的消毒较为复杂，不易控制消毒时间。消毒时间过长，虽然污染率降低，但不利于芽的无菌萌发，缩短消毒时间则会导致外殖体材料的污染率加大。
本发明的目的在于提供一种以地黄根生芽为外植体材料的地黄组培快繁方法，能简化组织培养操作过程，降低组织培养成本。本发明采取的技术方案如下 本发明提供的一种地黄组培快繁方法，包括下列步骤 (1)采集地黄块根，用自来水冲洗干净后，于暗室培养，待块根上芽眼长出新芽，将新芽由块根上切下；经消毒、无菌水冲洗，保留新芽顶端长度为0. 5-1厘米，获得根生芽作为地黄外殖体材料； (2)将根生芽接种于成苗诱导培养基上，置入25±2°C培养室中进行成苗诱导；(3)将诱导成苗后的地黄幼苗带叶切成小段，接种于丛生苗快繁培养基上培养，获得丛生苗； (4)取带有2个茎节的丛生苗接种于MS生根培养基中，进行生根诱导； (5)挑选长势旺盛的生根苗，经炼苗培养或不经过炼苗直接将生长健壮的小苗取出，自来水冲洗根部琼脂后，用0. 1%的多菌灵溶液浸泡消毒后，移栽于基质中保湿培养。所述步骤(I)的消毒，其具体操作为先用75 %酒精消毒25-35秒，无菌水冲洗两遍，再用0. 05 %的HgCL2溶液消毒8-10分钟，无菌水冲洗三遍。所述步骤(2)成苗诱导培养基为MS+6-BA 0. 8-1. 2 mg/L+NAA 0. 05-0. 12g/L ;成苗诱导的条件为每日光照时间12_13h，光照强度为4. 17 土 0. 18X103 lux。所述步骤(3)丛生苗快繁培养基为MS+6-BA 0. 2-0. 4 mg/L +NAA 0. 1-0. 3mg/L。所述步骤(4)MS 生根培养基为 MS+ PP333 0. I -0. 3 mg/L。众所周知，组织培养的首要步骤是筛选外殖体材料，适宜的外殖体材料不仅能有利于消毒过程的简化，提高成苗诱导效率，还能为后续快繁过程培育出生长良好的丛生苗材料。本发明以地黄根生芽为外殖体材料，与地黄块根相比，根生芽在暗处出芽后生长较快、出芽较长、暴露于空气的时间较短，有利于消毒处理。同样消毒时间处理后，出芽率与被污染率均优于地黄块根和地黄顶芽。优化后的成苗诱导培养基可以在较短时间内获得地黄无菌苗，不必像以地黄叶片作为外殖体需经过脱分化诱导愈伤后才可诱导成苗。因此本发明所优选的地黄块根在暗处萌发后的根生芽可作为地黄组织培养的良好外殖体材料。本发明的方法以地黄根生芽为外殖体，不必像以块根为外殖体材料以延长消毒时间来控制消毒效果，可以缩短消毒时间，而又不降低成苗诱导的成苗率，简化组织培养环节。以地黄根生芽为外殖体,也不必像以地黄顶芽为外殖体材料,需要经过流水冲洗、洗衣粉冲洗，手术刀剥离出包被在地黄顶端的顶芽，可以很好的控制消毒时间，这样既提高了组织培养效率，还简化了组织培养环节。因此，本发明以地黄根生芽为外殖体材料，能简化组织培养操作过程，提高组织培养效率，还能够降低组织培养成本，加快地黄组织培养的工厂育苗，加速繁殖地黄优系品种。本发明优化了地黄的传统组织培养的外殖体材料，从根本上简化组织培养环节，降低组织培养成本，达到正在的工厂化要求。从而为地黄的高产、优质、高抗病的品种培育，为地黄种质资源保存与利用奠定一定的基础。


图I为地黄根生芽诱导成苗培养基的筛选；其中图A为MS+6-BA I+NAA 0. I下诱导成苗；图 B 为 MS+6-BA 2+NAA 0. 2 下诱导成苗；图 C 为 MS+6-BA 0. 3+NAA 0. 02+GA3 0. I下诱导成苗；图D为MS+6-BA I+NAA 0. 01+GA3 0. 2下诱导成苗。图2为不同快繁培养基的地黄丛生苗生长情况汸和8均为MS+6-BA 0. 3+NAA 0. 2下正常丛生苗；C、D和E为其他培养基下出现的畸形苗或玻璃化苗。图3为生根培养基的筛选及其生根组培苗的生长状况，图A为在没有添加任何激素的MS培养基上地黄生根；图B为添加6-BA的1/2MS培养基上地黄生根；图C为添加PP333的MS培养基上地黄生根。
图4本发明组织培养获得的地黄苗。图A为获得的地黄组培苗生长情况；图B为获得的组培苗生长健壮；图C和图D为移栽后的地黄组培苗。

I、本发明建立的地黄根生芽快速繁殖方法
(I)将采集的地黄块根，用自来水冲洗干净后，于暗室内使根部出芽，获得根生芽作为外殖体材料。用75 %酒精消毒30秒，再用0. 05 %的HgCL2溶液进行消毒处理后用无菌水冲洗，保留顶端0.5-1厘米，获得地黄外殖体材料。通过将消毒方法75 %酒精和0. 05%的HgCL2溶液相互结合，并改善其组织培养基类型，可以简化组织培养操作过程，降低成苗诱导中外殖体污染率，促进地黄组织培养的工厂化应用。采用MS培养基进行成苗诱导，通过激素调控，根生芽的成活率提高，被污染率下降。在成功建立的无菌苗体系基础上，调整生苗快繁培养基配方，可以减缓外殖体的褐化和玻璃化，提高丛生苗的出苗率，进而经诱导生根可以培养出完整的再生植株。 (2)将根生芽接种于含有特定浓度的细胞分裂素(6-BA)和萘乙酸(NAA)的MS培养基中，置入25±2°C培养室中，每日光照时间12. 5h (8:30-21:00)，光照强度为4. 17 土0. 18X103 lux，进行成苗诱导。(3)将诱导成苗后的地黄幼苗带叶切成小段，接种于以MS为基本培养基的丛生苗快繁培养基中，通过调控6-BA和NAA的激素水平可以获得快速繁殖的丛生苗。(4)取带有2个节的无菌苗接种于MS生根培养基中，调控激素水平进行生根诱导。(5)将长势旺盛的生根苗经炼苗培养后，将生长健壮的小苗取出，或不经过炼苗直接将生长健壮的小苗取出，冲洗掉根部琼脂，经多菌灵溶液中浸泡后，移栽于基质培养基中，可以得生长健壮的地黄无菌苗。2、本发明建立的地黄根生芽组织培养结果分析 I)外殖体材料消毒时间对出芽率的影响
地黄块根作为外殖体材料时，消毒时间为15分钟时出芽率最高；低于10分钟时，消毒不彻底，污染率达80%以上；但消毒时间过长，超过17分钟时，不利于芽的无菌萌发。顶芽对作为外殖体材料时，消毒时间超过10分钟时，虽然污染发生较少但95%以上顶芽不能萌发；消毒时间低于8分钟时，消毒不彻底，污染率达85 %以上。根生芽由于在暗室中暴露空气时间较短，特别是其在暗处出芽较长，更利于消毒处理，同样消毒时间处理后，出芽率与被污染率均优于地黄顶芽作为外殖体。而且地黄根生芽诱导成苗时间较短、操作简单，不像叶片作为外殖体材料一样需经过脱分化诱导愈伤后才可诱导成苗。因此本发明优选地黄块根为材料，在暗处萌发后的根生芽作为外殖体材料，进行地黄快速诱导成苗效果明显，操作简便。2)以根生芽为外殖体材料的成苗诱导培养基筛选
地黄根生芽作为外殖体材料，在HW和N6等培养基上，均能发育成苗，但成苗周期较长，且苗多发育畸形。进行资料查询发现，地黄诱导成苗培养基大多采用MS培养基并辅以不同类型激素成分进行成苗诱导。如表I所示，本发明以MS培养基为本底分别添加不同激素类型，茎尖生长成活情况有所差异。
表I根生芽诱导培养基的筛选
Tab. I The screening of the inductive medium


本发明涉及一种地黄组培快繁方法。该方法包括以根生芽作为地黄外殖体材料，进行成苗诱导、获得丛生苗、生根诱导、消毒后移栽。该方法以地黄根生芽为外植体材料，能简化组织培养操作过程，降低组织培养成本。本发明优化了地黄的传统组织培养的外殖体材料，从根本上简化组织培养环节，降低组织培养成本，达到正在的工厂化要求。从而为地黄的高产、优质、高抗病的品种培育，为地黄种质资源保存与利用奠定一定的基础。