高产氨肽酶的重组大肠杆菌及其构建方法_周哲敏专利（氨肽酶,大肠杆菌,高产）-早鸽网

一种高产氨肽酶的重组大肠杆菌及其构建方法

专利名称

一种高产氨肽酶的重组大肠杆菌及其构建方法
发明者

周哲敏, 崔文璟, 高新星
公开日

2012年6月13日
申请日期

2011年11月22日
优先权日

2011年11月22日
申请人

江南大学
文档编号

C12N15/70GK102492646SQ20111037440
关键字

氨肽酶大肠杆菌高产重组
权利要求

1. 一种生产氨肽酶的重组大肠杆菌，是将来源于枯草芽孢杆菌ZjOie的编码成熟氨肽酶基因导入E. coli BL21(DE3)得到的基因工程菌2.如权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述编码成熟氨肽酶基因是去除了31 个氨基酸的信号肽的氨肽酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示3.—种权利要求1所述生产氨肽酶的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，步骤如下1)收集枯草芽孢杆菌Zj016分泌的纯酶进行N端氨基酸序列测定；2)将测得的氨基酸序列在NCBI数据库中比对，根据与其一致性最高蛋白的核苷酸序列并设计引物Pl和P2克隆氨肽酶基因，将所述氨肽酶基因转化E. coli JM109，得到重组质粒 PUC19-SAP ；3)分析氨肽酶核苷酸序列，设计引物P3和P4克隆出不含信号肽的编码成熟氨肽酶的基因；将所述成熟氨肽酶的基因与载体pET48a(+)连接，挑选阳性质粒转化Ε. coli BL21(DE3)4.如权利要求3所述方法，其特征在于，具体步骤如下1)将枯草芽孢杆菌Zj016分泌的纯酶进行SDS-PAGE电泳后，从玻璃板上取下凝胶，去除所有浓缩胶，将凝胶浸入电转缓冲液中30min ；滤纸在电转缓冲液中浸泡Imin ；PVDF膜在甲醇中浸泡1 后将膜放于双蒸水中5min，放于转移缓冲液中平衡IOmin ；然后打开转移夹子，黑孔板朝下，将泡沫垫子、滤纸、凝胶、膜、滤纸、泡沫垫子按顺序放入夹子中；将转移夹放入转移槽中，黑孔板面对准支撑板的负极，白孔板对准支撑板的正极；在转移槽中加入适量缓冲液至转移槽全部浸没；将电转槽放在冰水浴中进行电转，电流恒流85mA，2h即可；转移完成后用镊子从槽中取出膜，在双蒸水中漂洗膜，然后浸入甲醇数秒，放入染色液中染色30-60S ；然后放置脱色液中进行脱色至背景无兰色；用双蒸水漂洗膜，置膜于滤纸自然干燥，剪下目的条带，送测序；2)将测得的氨基酸序列在NCBI数据库中BLAST，查找出与其一致性最高的蛋白的基因；利用同源性最高的基因设计引物，提取枯草芽孢杆菌Zj016基因组并以其作为模板，克隆目的基因；PCR体系为10 μ M引物Pl和P2各1 μ L，2mM dNTPS 5 μ L， 10 X KOD-Plus-NeoBuffer 5 μ L，IU/ μ L 的 KOD-Plus-Neo DNA 聚合酶 1 μ L,模板 0· 5 μ L，力口双蒸水补齐50yL ;PCR条件94°C预变性5min ；94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸Imin 30s, 30个循环；将PCR产物和载体PUC19分别进行双酶切并切胶回收，于16°C连接过夜，转化E. coliJM109，在含有氨苄抗性的LB平板挑取3个转化子，提取重组质粒并进行PCR和双酶切验证后送上海生工测序，重组质粒即PUC19-SAP ；3)根据测得的DNA序列分析，目的基因编码成熟氨肽酶和一个含有31个氨基酸的信号肽，设计另一对引物，以重组质粒PUC19-SAP为模板，克隆不含信号肽的目的基因，PCR体系和条件同上；将PCR产物和空载体pET48a(+)分别进行双酶切并切胶回收，于16°C连接过夜，转化E. coli JM109，在含有卡那抗性的LB平板挑取转化子，提取重组质粒并进行PCR和双酶切验证后测序，重组质粒即pET48a(+)-AP ；将阳性克隆质粒转化E. coliBL21 (DE3)，在含有卡那抗性的LB平板挑取单菌落做表达验证
技术领域

本发明涉及一种高产氨肽酶的重组大肠杆菌及其构建方法，属于生物工程技术领域
背景技术
具体实施例方式

材料和检测方法LB培养基胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，氯化钠，pH 7.0TB培养基1. 2 %胰蛋白胨，2. 4 %酵母提取物，0. 4 %甘油，17mM KH2PO4, 72mMK2HP04o氨肽酶活性测定方法以L-亮氨酸-对硝基苯胺为底物，在50mM pH 8. 5的 Tris-HCl缓冲液中加入稀释一定倍数的酶液和底物(ImM)，50°C水浴反应lOmin，在405nm 下测定吸光度酶活单位定义在50°C下，Imin分解L-亮氨酸-对硝基苯胺产生1 μ M对硝基苯胺所需的酶量为一个酶活单位(IU)实施例1 将枯草芽孢杆菌Zj016分泌的纯酶进行SDS-PAGE电泳后，从玻璃板上取下凝胶，去除所有浓缩胶将凝胶浸入电转缓冲液(CAPS 10mM、甲醇10%、pH 11)中30min滤纸在电转缓冲液中浸泡lminPVDF膜在甲醇中浸泡1 后将膜放于双蒸水中5min，再小心放于转移缓冲液中平衡lOmin然后打开转移夹子，黑孔板朝下，将泡沫垫子、滤纸、凝胶、膜、滤纸、泡沫垫子按顺序放入夹子中将转移夹放入转移槽中，黑孔板面对准支撑板的负极，白孔板对准支撑板的正极在转移槽中加入适量缓冲液至转移槽全部浸没将电转槽放在冰水浴中进行电转，电流恒流85mA，2h即可转移完成后用镊子从槽中取出膜，在双蒸水中漂洗膜，然后浸入甲醇数秒，放入染色液(0. 1 %考马斯亮蓝G-250、40%甲醇、1 %乙酸) 中染色30-60s然后放置脱色液(50%甲醇水溶液)中进行脱色至背景无兰色即可用双蒸水漂洗膜，置膜于滤纸自然干燥剪下目的条带，送测序将测得的氨基酸序列在NCBI数据库中BLAST，查找出与其一致性最高的蛋白的基因利用同源性最高的基因设计引物，提取枯草芽孢杆菌Zjoie基因组并以其作为模板，克隆目的基因上游引物Pl如SEQ ID NO. 2所示；下游引物P2如SEQ ID NO. 3所示PCR 体系为10μΜ 弓I 物 Pl 禾口 P2 各 lyL，2mM dNTPS 5 μ L, 10 X KOD-Plus-Neo Buffer5 μ L, IU/ μ L 的 KOD-Plus-Neo DNA 聚合酶 1 μ L,模板 0. 5 μ L,加双蒸水补齐 50 μ L PCR条件94°C预变性5min ；94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin 30s，30个循环将 PCR产物和载体PUC19分别进行双酶切并切胶回收，于16°C连接过夜，转化Ε. coli JM109，在含有氨苄(lOOyg/mL)抗性的LB平板挑取3个转化子，提取重组质粒并进行PCR和双酶切验证后送上海生工测序，重组质粒即PUC19-SAP根据测得的DNA序列分析，目的基因编码成熟氨肽酶和一个含有31个氨基酸的信号肽，设计另一对引物，以重组质粒PUC19-SAP为模板，克隆不含信号肽的目的基因，PCR体系和条件同上上游引物P3如SEQ ID NO. 2所示；下游引物P4如SEQ ID NO. 2所示将PCR产物和空载体pET48a(+)分别进行双酶切并切胶回收，于16°C连接过夜，转化E. coli JM109，在含有卡那(50yg/mL)抗性的LB平板挑取转化子，提取重组质粒并进行PCR和双酶切验证后测序，重组质粒即pET18a(+)-AP将阳性克隆质粒转化Ε. coli BL21 (DE3)，在含有卡那(50 μ g/mL)抗性的LB平板挑取单菌落做表达验证实施例2 挑取单菌落于5mL LB培养基(卡那50 μ g/mL)中，37°C 200rpm过夜培养，再按 1 %的接种量转接至50mL TB培养基(卡那50 μ g/mL)中37°C 200rpm培养至OD值0. 8左右，加入IPTG至终浓度0. 4mM, 28 °C 200rpm培养12h后8000rpm离心5min收集菌体，再用10mL50mM pH 8. 5的Tris-HCl缓冲液悬浮菌体，超声破碎，离心收集上清液，进行酶活和SDS-PAGE验证测得发酵液的酶活为4. 8U/mL对照组不加IPTG诱导，其余条件同上 SDS-PAGE结果见图5

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专利名称：一种高产氨肽酶的重组大肠杆菌及其构建方法氨肽酶是一类能够水解蛋白质和多肽N端氨基酸的外切蛋白水解酶，广泛存在于动植物及微生物中。氨肽酶在许多生物加工过程中起着重要的作用，如蛋白质的消化和分解、蛋白质的成熟、激素分泌的调节及细胞周期的控制。毫无疑问，许多疾病的引发都与氨肽酶有关，包括炎症、白内障、糖尿病、中风、囊性纤维化甚至癌症和艾滋病等。因此，正确了解氨肽酶的催化机制以及一些影响氨肽酶发挥正常生物学功能的因素对预防和治疗这些疾病有着重要的作用。目前，微生物发酵生产氨肽酶存在产量低的问题，如何提高微生物法生产氨肽酶的产量成为迫切需要解决的问题。
本发明所要解决的技术问题是提供一种高效表达氨肽酶的重组大肠杆菌，是将来源于枯草芽孢杆菌ZjOie的去除了信号肽的氨肽酶基因导入E. coli BL2KDE3)得到的基因工程菌。所述枯草芽孢杆菌Zj016，详见田亚平，须瑛敏。一种枯草芽孢杆菌氨肽酶的纯化及酶学性质[J]·食品与发酵工业，2006，32 (3) :7-10.所述去除了信号肽的氨肽酶核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本发明还要解决的技术问题是提供一种所述高效表达氨肽酶的大肠杆菌基因工程菌的构建方法。为解决上述技术问题，步骤如下1)收集枯草芽孢杆菌ZjOie分泌的纯酶进行N端氨基酸序列测定；2)将测得的氨基酸序列在NCBI数据库中比对，根据与其一致性最高蛋白的核苷酸序列并设计引物Pl和P2克隆氨肽酶基因，将所述氨肽酶基因转化E. coli JM109，得到重组质粒 PUC19-SAP ；3)分析氨肽酶核苷酸序列，设计引物P3和P4克隆出不含信号肽的编码成熟氨肽酶的基因；将所述成熟氨肽酶的基因与载体pET48a(+)连接，挑选阳性质粒转化Ε. coli BL21(DE3)。所述引物Pl核苷序列如SEQ ID NO. 2所示。所述引物P2核苷序列如SEQ ID NO. 3所示。所述引物P3核苷序列如SEQ ID NO. 4所示。所述引物P4核苷序列如SEQ ID N0. 5所示。本发明提供了一种高产氨肽酶的重组大肠杆菌及其构建方法，该方法简单有效，构建的重组大肠杆菌能高效表达氨肽酶，能为后期研究氨肽酶的特性、结构等提供所需蛋白。图1 野生菌纯酶N端测序结果。图2 枯草芽孢杆菌氨肽酶基因的克隆结果(1 目的基因)。图3 重组质粒PUC19-SAP双酶切结果，(1 :PUC19，2 目的基因)。图4 重组质粒pET-28a(+)-AP双酶切结果(1 :pET_28a(+) ；2 目的基因)。图5 重组大肠杆菌表达SDS-PAGE结果(M marker ；1 未诱导；2 诱导；3 目的蛋白)。

本发明公开了一种高产氨肽酶的重组大肠杆菌及其构建方法，生物工程技术领域。该方法简单有效，构建的重组大肠杆菌能高效表达氨肽酶，为后期研究氨肽酶的特性、结构等提供所需蛋白。

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