专利名称：一种枯草芽孢杆菌氨肽酶在风味功能性营养米制备工艺中的应用的制作方法一种枯草芽孢杆菌氨肽酶在风味功能性营养米制备工艺中的应用技术领域一种食品级枯草芽孢杆菌固体氨肽酶在风味功能性营养米制备工艺中的应用，属于酶制剂、食品添加剂技术领域。酶制剂已广泛应用在食品、酿造、制药、有机酸、淀粉糖、饲料工业、纺织、皮革、洗涤剂及保健品等各个领域，应用领域越来越广泛，食品与人们的生活密切相关，因此酶在食品工业中的应用价值越来越重要，目前在烘焙、奶制品、肉类加工、新型营养食品和蛋白质的水解中得到很大的体现。随着大米加工水平的提高，大米加工精度等级也越来越高，营养物质的损失也越来越严重。营养米可以满足人们对维生素及矿物质的日常需求，在正常饮食条件下便可获得充足维生素。目前市场上已有各种营养米的产品，但口感较普通大米较差，为提高营养米口感，特开发风味营养米。在大米加工过程中添加合适的蛋白酶，使风味前体物水解，从而释放出风味物质， 增强和改善营养颗粒的风味。风味营养米的开发除可满足人体对营养素的正常需求外，还可为特殊人群提供健康饮食。如肾脏病人，肾脏病患者对饮食有很高要求，尤其不可食用蛋白含量高的食物。正常情况下，人体摄入蛋白后经过代谢，大部分都会成为含氮废物，由肾脏排出体外。所以含蛋白食物会加重肾脏的代谢负担，加重病情，肾脏病人多选择无蛋白或低蛋白食物。风味营养米中的蛋白质已被酶解为各种氨基酸，可直接为人体吸收，不仅可以减轻肾脏负担而且可以确保营养摄入的全面均衡。风味营养米的开发对肾脏病患者具有重要意义。不同年龄段人群对营养要求各异，可根据营养要求研制不同类型的风味营养米，如特别针对儿童的营养米，可通过颜色及气味和口感激发儿童摄入欲望。针对老年人的营养米，可提前将大米成分适当降解，减少老年人消化负担。由此可见，风味营养米的研制是对现有营养米的有益补充，对于提高我国人口健康状况具有积极作用。发明内容本发明目的是提供一种枯草芽孢杆菌固体氨肽酶在风味功能性营养米制备工艺中的应用，制备风味功能性营养米。本发明的技术方案大米经过粉碎后成为大米粉末。中性蛋白酶和固体氨肽酶对大米粉末进行复配酶解。 以DPPH消除能力、清除超氧自由基能力，清除羟自由基能力和还原力来综合反映营养米抗氧化肽的抗氧化活性。并选择在后续工艺采用的条件下对其抗氧化活性稳定性进行研究。—种枯草芽孢杆菌氨肽酶在风味功能性营养米制备工艺中的应用 (1)将大米用粉碎机粉碎，得到大米粉末。(2)用5g大米粉末为底物，以50mL水为介质，用中性蛋白酶和固体氨肽酶复配的风味蛋白酶进行酶解，中性蛋白酶(El)固体氨肽酶(E2)的质量比控制为5 1，加酶总量为底物质量的0. 5%-2% ；50°C酶解他。煮沸灭酶5min，加入体积分数95%的乙醇至体系乙醇体积分数为60%，静置12 h后4°C IOOOOrpm离心20min，上清液为大米多肽混合物。分析测定其中分子量小于IkDa的占90%以上；其对超氧自由基、DPPH ·和羟自由基的清除率分别为大于20%，35%，50%，其还原能力为VC的0. 9倍以上，表现出较强的体外抗氧化活性。
B风味功能性营养米抗氧化稳定性研究(1)经过60°C20min处理后，上清液对超氧自由基、DPPH ·和羟自由基的清除率分别为 21. 02%, 37. 79%，50. 42%，其还原能力为 VC 的 0. 97 倍·(2)经过80°CImin处理后，上清液对超氧自由基、DPPH ·和羟自由基的清除率分别为 20. 98%, 37. 78%, 50. 21%，其还原能力为 VC 的 0. 97 倍。
(3)经过95°C 2min处理后，上清液对超氧自由基、DPPH ·和羟自由基的清除率分别为21. 01%, 37. 62%, 50. 07%，其还原能力为VC的0. 97倍。
C枯草芽孢杆菌固体氨肽酶在风味功能性营养米酶解的应用研究(1)中性蛋白酶和氨肽酶复合酶解大米酶解液中多肽分子量分布。经过高效液相色谱分析多肽分子量分布，发现中性蛋白酶和氨肽酶复合酶解大米后，酶解液中多肽小于IkDa 的可占90%以上。结果如

图1。
(2)中性蛋白酶和氨肽酶复合酶解大米酶解液中游离氨基酸的测定。氨基酸分析液相色谱仪(AgllOO)游离氨基酸的总含量从43. 5315mg/mL提高到105. 896mg/mL ；主要呈味氨基酸丙氨酸含量从3. 5631mg/mL提高到7. 5819 mg/mL ；甘氨酸的含量从1. 9140 mg/mL 提高到3. 1073mg/mL ；天冬氨酸的含量从2. 5826 mg/mL提高到4. 4292 mg/mL ；谷氨酸的含量从1. 0569 mg/mL提高到9. 1716 mg/mL。结果如图2。
固体氨肽酶的酶活LNA法测定。测定时，首先配Tris-HCl缓冲液，取6. 075gTris溶于900mL蒸馏水，用浓 HCl调至pH8. 5，然后定容至1L。以L-亮氨酸对硝基苯胺(L-leu-pNA)作为底物，取0. Ig底物溶于ImL酒精，然后用Tris-HCl缓冲液定容到100mL。取0. Ig固体氨肽酶粉用Tris-HCl 缓冲液定容到IOOmL作为待测酶液。加入2mL的1Tris-HCl缓冲液和ImL底物L-leu-pNA， 一个加入ImL酶液，另一个加入ImL Tris-HCl缓冲液作为对照，在50°C水浴反应IOmin后， 405nm比色测定酶活。
酶活公式酶活=AX105.7X4Xn/10其中A为待测酶液的吸光度；η为待测酶液的稀释倍数。
酶活力定义50°C，每分钟分解L-亮氨酸-对硝基苯胺产生1微摩尔的对硝基苯胺所需酶量即为一个酶活单位。
测定样品对DPPH自由基即二苯代苦味胼基自由基的清除率采用消除DPPH自由基法。取2mL待测样品，加入2mL质量浓度为0. 04g/L的DPPH 无水乙醇溶液，混合均勻后反应20min，在转速3500 r/min下，离心lOmin，取上清液，在波长 517nm处测其吸光度为Ai ；另取2mL待测样品于试管中，加入无水乙醇2 mL，反应20min，在转速3500r/min下离心lOmin，取上清液，在波长517nm处测其吸光度为Aj ；以2mL质量浓度0. 04g/L的DPPH ·无水乙醇溶液和2mL无水乙醇反应作为参比，其在波长517nm处吸光度记为Atl，按照下列式子计算样品对DPPH自由基的清除率清除率


一种枯草芽孢杆菌氨肽酶在风味功能性营养米制备工艺中的应用，属于酶制剂﹑食品添加剂技术领域。枯草芽孢杆菌Zj016氨肽酶发酵液经过离心、澄清、浓缩、脱盐和冷冻干燥得固体酶。利用中性蛋白酶和氨肽酶以一定比例添加复配酶解大米，酶解后的营养米游离氨基酸含量也显著增加。通过分析营养米酶解后水解液的DPPH消除能力、超氧自由基消除能力，羟自由基消除能力和还原力等几项指标，表明大米中蛋白质酶解为较高比例小分子肽后可使其营养米的抗氧化活性得到较大幅度的提高，抗氧化活力的稳定性较高。本发明将营养米的酶解加工与风味功能性加工有机地结合，起到强化营养米的风味与功能因子的作用，在风味功能营养米的开发上有广泛的应用前景。