专利名称：胞磷胆碱的制备方法胞磷胆碱(CDPC)是磷脂类磷脂酰胆碱的前体物质，是卵磷脂合成必须的辅酶。胞磷胆碱临床上广泛用于脑缺血、脑损伤、阿尔茨海默病、帕金森病和老年性痴呆等疾病的治疗。胞磷胆碱又名胞二磷胆碱，胞苷二磷酸胆碱。胞磷胆碱已知的制备方法有化学合成法、 使用酵母等微生物菌体的酶法、利用基因重组微生物进行转化的酶法等。这些制备方法中的共同点是作为原料使用了价格昂贵的胞苷一磷酸(CMP)、胞苷二磷酸(CDP)、胞苷三磷酸(CTP)、胞嘧啶等嘧啶系核苷酸及其前体乳清酸、尿嘧啶等，使得胞磷胆碱的制备成本较高。使用酵母等微生物菌体的酶法制造胞磷胆碱，是以胞苷酸和磷酸胆碱作为原料， 利用微生物提供反应所需磷酸胆碱转胞苷酰酶(CCT)等一系列酶，一步催化完成胞磷胆碱的制备。胞苷酸十葡萄糖十磷酸胆碱十无机盐一胞磷胆碱此过程中的起始物胞苷酸的价格是非常昂贵的，使得制备成本居高不下。CN1074938公开了胞苷二磷酸胆碱的制备方法，该方法是以微生物提供反应所需胞苷三磷酸合成酶、磷酸胆碱转胞苷酰酶(CCT)等一系列酶，一步催化完成胞磷胆碱的制备。CN1653188公开了胞苷5’- 二磷酸胆碱的制备方法，该方法采用胆碱、磷酸胆碱或它们的盐以及尿嘧啶在水溶性介质中与生物催化剂接触，蓄积生成⑶P-胆碱。CN102199643A 公开了一种胞二磷胆碱的制备方法，使用单一的基因工程菌的培养物或者其处理物作为酶源，催化包括氯化铵、乳清酸和磷酸胆碱的底物进行反应，使得反应液中生成和积蓄胞二磷胆碱，从所述反应液中提取所述胞二磷胆碱。CN101538598A提供一种胞二磷胆碱的制备方法，其特征是以氯化胆碱、磷酸根离子和胞苷一磷酸或其前体为底物，以葡萄糖、果糖、蔗糖或麦芽糖为能量供体，加入小分子化学效应物质，利用有透性的酵母细胞全细胞催化制备胞二磷胆碱；其中，所述的胞苷一磷酸前体为乳清酸或胞苷；所述的小分子化学效应物质为镁离子、钾离子中的任意一种或两种，与甘露醇、半胱氨酸和精胺中的任意一种或几种的组合物。以上方法的起始原料乳清酸或尿嘧啶或胞苷酸等价格都比较昂贵，成本也较高。
本发明针对现有技术的不足，提供一种以嘧啶从头合成为基础反应的微生物发酵法制备胞磷胆碱的方法。发明概述本发明的方法不使用嘧啶系核苷酸或其前体如乳清酸、尿嘧啶等价格昂贵的原料，而使用工业上易于得到的、廉价的、可提供胆碱的原料(如氯化胆碱、磷酸胆碱等)经过微生物发酵，制备胞磷胆碱。本发明的方法以嘧啶从头合成为基础反应，由简单的起始原料碳、氮源开始，利用一些特定微生物体内合成代谢途径，合成磷酸核糖、氨基酸以及一碳单位与二氧化碳等简单物质，继而合成制备胞磷胆碱的前体胞嘧啶系核苷酸，在含有可提供胆碱的原料如磷酸胆碱或氯化胆碱等的培养液中，由微生物提供的磷酸胆碱转胞苷酰酶的参与下累积生成胞磷胆碱。嘧啶核苷酸的从头合成途径的原料是天冬氨酸、谷氨酰胺、CO2等，这些氨基酸来自生物体内的氨基酸合成代谢。反应过程中的关键酶在不同生物体内有所不同，在细菌中， 嘧啶核苷酸的生物合成，受到终产物反馈控制的点有三个合成途径的第一个调节酶是氨基甲酰磷酸合成酶，它受尿嘧啶核苷酸(UMP)的反馈抑制；另两个调节酶是天冬氨酸氨甲酰转移酶和胞苷三磷酸(CTP)合成酶，它们都受胞苷三磷酸(CTP)的反馈抑制。前者被抑制将影响尿苷酸和胞苷酸的合成，后者被抑制只影响胞苷酸的合成。很多微生物发酵能够产生胞嘧啶系核苷酸，如果解除UMP、CTP的反馈抑制作用， 截止嘧啶合成途径中的起始氨基酸天冬氨酸的分支代谢途径，并选择产胞嘧啶系核苷酸活跃时期的菌体或培养物作为产胞嘧啶系核苷酸的酶源，能够较快速的代谢生成胞嘧啶系核苷酸，在该微生物或其它微生物提供的磷酸胆碱转胞苷酰酶的参与下，累积生成胞磷胆碱。 从而避免使用价格昂贵的嘧啶系核苷酸为前体物，进一步降低制备成本。本发明以此为出发点，选择了适宜该方法的菌株，通过微生物发酵制备胞磷胆碱。发明详述本发明的技术方案如下一种胞磷胆碱的制备方法，以嘧啶从头合成为基础反应，该方法包括在有微生物 A的培养液存在的情况下，或者还有微生物B的培养液或处理物存在的情况下，将胆碱原料在反应温度20 38°C反应10 72小时，控制pH 5 7. 5，累积生成胞磷胆碱。所述的胆碱原料选自胆碱、氯化胆碱、磷酸胆碱、碘化胆碱或溴化胆碱。所述微生物A选自属于棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属 (Brevibacterium)、芽抱杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Rseudomonas)、酿酒酵母属 (Saccharomyces cerevisiae)中的一个或2个以上属的菌株。所用菌株具备以下特征(I)能够代谢产生胞嘧啶系核苷产物；(2)具有嘧啶系结构类似物抗性，能够解除UMP、CTP产物的反馈抑制作用；(3)代谢酶系统中的胞苷脱氨酶缺失，阻断所合成的胞嘧啶系核苷酸脱氨恢复转化为尿嘧啶系核苷酸；(4)能够截止高丝氨酸脱氢酶作用途径，积累嘧啶从头合成的前体物天冬氨酸；(5)具有磷酸胆碱转胞苷酰酶活性，能够将所合成的胞苷酸系产物如胞苷酸、胞苷三磷酸等转化为胞磷胆碱，该酶可以来自天然微生物或者是转导子编码磷酸胆碱转胞苷酰酶的DNA而得到的转化体。所述微生物B选自①啤酒发酵的工业啤酒酵母菌体，或者②含有磷酸胆碱转胞苷酰酶的大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌之一，或者是③含有磷酸胆碱转胞苷酰酶的大肠杆菌、谷氨5酸棒杆菌的转化体、培养液或提取物。根据本发明优选的，微生物A为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QL28001 保藏号CGMCC No. 5849，谷氨酸棒状杆菌保藏号ATCC No. 13032，洋葱假单胞菌保藏号 ATCCNo. 25416，柠檬节杆菌保藏号ATCC No. 11624，酿酒酵母保藏号ATCC No. 40075之一。本发明最优选的微生物A为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) QL28001，是本发明首次由菌种保藏号为ATCC No. 6051的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)选育而来，于 2012年3月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所)保藏，保藏号为CGMCC No. 5849。本发明所述的由菌种保藏号为ATCC No. 6051的枯草芽孢杆菌选育得到的枯草芽孢杆菌QL28001保藏号CGMCC No. 5849含有合成胞嘧啶系核苷酸的所有酶系，并能解除 UMP、CTP的反馈抑制作用，截止了嘧啶合成途径中的起始氨基酸天冬氨酸的分支代谢途径。 其细菌学特征如下I. I形态学I. I. I形状和大小短芽孢杆菌(O. 7-0. 8X2. 5-3微米)I. I. 2多形态单型，双型稀有
I. I. 3运动性无
I. I. 4芽孢形成有
I. I. 5孢子形状卵圆形
I. I. 6孢子部位靠近中央
I. I. 7革兰氏染色阳性
I. 2生长状态
I. 2. I肉浸汁琼脂平板培养不规则和扩散形，表面粗糙而扁平，不透明，浅棕色。
I. 2. 2石蕊牛奶胨化，色素减少
I. 2. 3肉浸汁液体培养表面形成菌膜，不浑浊
I. 3生理特性
1.3. I硝酸盐还原+
1.3.2淀粉水解
I. 3. 3v-p试验阳性+
I. 3. 4丙酸的利用_
I. 3. 5朽1檬酸的利用+
I. 3. 6铵盐的利用+
I. 3. 7脲酶微弱的
I. 3. 8过氧化氢酶存在
1.3. 9对氧的要求好氧
I. 3. 10抗酸性ph5. 7时能生长
1.3. 11抗氯化钠性浓度7%时能生长
I. 3. 12抗嘧啶类似物0. 5ug/ml的5-氟尿嘧啶可生长
1.3. 13胞苷脱氨酶活性低于O. 01单位/mg蛋白
按照上述的胞磷胆碱的制备方法，优选方案之一，步骤如下
(I)将枯草芽孢杆菌QL28001接种于含有O. 1_5%葡萄糖、O. 5_5%牛肉膏、1_10% 蛋白胨、O. 5-5%酵母粉、O. 5-1%氯化钠成分的培养液中，32°C培养至糖耗尽时，得微生物A 的培养物。按5wt%的接种量将微生物A的培养物接种于培养液中，所述培养液是含有碳源、 氮源和微量元素的水溶液，该培养液碳源浓度为8-20wt%、氮源浓度为3-6wt%、微量元素浓度为O. 2-5wt%，并添加O. 1-3%的磷酸盐，30 35°C培养5 25h ;得含有微生物A的培养液，或者将培养液离心收集菌体；(2)向步骤(I)的含有微生物A的培养液中加入胆碱原料，胆碱原料加量为培养液重量的O. 5-3wt%，在反应温度20 38°C，反应10 72小时，控制pH 5 7. 5条件下反应累积生成胞磷胆碱。或者，将步骤(I)的含有微生物A的培养液按照5_30wt%的接种量接种于含有碳源、氮源、微量元素、胆碱原料和微生物B的培养液中，在反应温度20 38°C，反应10 72小时， 控制pH 5 7. 5，在此培养液中反应累积生成胞磷胆碱。该培养液中碳源浓度为8-20Wt%， 氮源浓度为3-6wt %，微量元素浓度为O. 2-5wt %，微生物B浓度为5-30wt %，胆碱原料加量为培养液重量的O. 5-3wt%,30 35°C培养5 25h。进一步优选的，上述步骤(2)的培养液中还添加有O. 005-0. 05wt%的表面活性剂。按照上述的胞磷胆碱的制备方法，优选方案之二，步骤如下I)将微生物A接种于含有O. 5%葡萄糖、O. 5%牛肉膏、1%蛋白胨、O. 5%酵母粉、 O. 5%氯化钠成分的培养液中，32°C培养至糖耗尽时，分离菌体得微生物A的培养物。2)将步骤I)微生物A的培养物按照5-20wt%的接种量接种于含有碳源、氮源、微量元素的培养液中，在反应温度20 38°C，反应10 30小时分离菌体；所述培养液中碳源浓度为8-20wt%，氮源浓度为3-6wt%，微量元素浓度为O. 2-5wt% ；3)将步骤2)菌体按照5-30wt%加入含有碳源、氮源、微量元素、胆碱原料、表面活性剂和微生物B的培养液中，在反应温度20 38°C，反应20 72小时，控制pH 5 7. 5， 在此培养液中反应生成累积胞磷胆碱。所述培养液中碳源浓度为8-20wt%，氮源浓度为
3-6wt%,微量元素浓度为O. 2-5wt%,微生物B浓度为5-30wt%，胆碱原料加量为培养液重量的0.5-3wt%。或者，将步骤2)的菌体按照5-30wt%加入含有碳源、氮源、微量元素、胆碱原料的培养液中，在反应温度20 38°C，反应20 72小时，控制pH 5 7. 5，在此培养液中反应生成累积胞磷胆碱。所述培养液中碳源浓度为8-20wt%，氮源浓度为3-6wt%，微量元素浓度为
O.2-5wt%，胆碱原料加量为培养液重量的O. 5-3wt%。进一步优选的，上述步骤3)的培养液中还添加有O. 005-0. 05被％的表面活性剂。进一步优选的，上述步骤2)、3)的培养液中还添加有O. 1-3%的磷酸盐。根据本发明所述的胞磷胆碱的制备方法，从以上所得的累积胞磷胆碱反应液中进一步提取所述胞磷胆碱。按现有技术即可。在上述胞磷胆碱的制备方法中，所述碳源选自以下三类之一a、糖类，具体选自葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、山梨糖、葡萄糖酸、糖蜜、甘油或淀粉水解物。b、有机酸，具体选自丙酮酸、乳酸、柠檬酸或丙酮酸。C、天然有机碳源，具体选自玉米浆或甘蔗渣。上述胞磷胆碱的的制备方法，所述氮源选自玉米浆、酵母粉、酵母浸膏、硫酸铵、氨水、氨气、醋酸铵、谷氨酰胺、尿素之一或组合；上述胞磷胆碱的的制备方法，所述的微量元素选自镁盐、锰盐、钴盐、铜盐、钾盐、 D-生物素中的一种或组合，进一步优选硫酸镁、磷酸二氢钾、D-生物素中的一种或组合。上述胞磷胆碱的的制备方法，优选的反应条件为pH 6 7，反应温度30 35°C， 反应时间控制在30 48小时。本发明所述的制备方法，为了能够促进胞磷胆碱的合成，反应体系中也可加入合适的表面活性剂，优选的，表面活性剂为吐温-80。本发明所述的制备方法中未详细列举的按现有技术即可。采用以上所列条件制备胞磷胆碱的方法，采用了廉价的磷酸胆碱、氯化胆碱等为原料，使得制备成本大大降低。通过该方法胞二磷胆碱的制备水平可达到11. 2g/L反应液。

O.5%酵母粉、O. 5%氯化钠成分的培养液中，32°C培养至糖耗尽时，得枯草芽孢杆菌的培养物；B、按5%的接种量，将所得枯草芽孢杆菌QL28001的培养物接种于含有20%葡萄糖、5%酵母粉、O. 5%硫酸镁、1%磷酸二氢钾成分的培养液中，32°C培养6h ;得枯草芽孢杆菌QL28001的培养液；C、所得枯草芽孢杆菌QL28001的培养液连续流加I %的磷酸胆碱，继续反应30h， 过程中用浓氨水调节pH在6. 8，获得的培养液中含胞磷胆碱5. 7g/L。实施例2、按实施例I的步骤A制得枯草芽孢杆菌的培养物；按5%的接种量，将枯草芽孢杆菌的培养物接种于含有8%葡萄糖、2%酵母粉、1%尿素、O. 5%硫酸镁、1%磷酸二氢钾、O. 01% D-生物素的培养液中，35°C培养约20小时至糖耗尽。
将所得培养液按照30%的接种量接种于含有12%葡萄糖、1%硫酸镁、1%磷酸二氢钾、I %磷酸胆碱、O. 01%吐温-80、10%工业啤酒酵母湿菌体的培养液中，继续反应30h， 过程中用浓氨水调节PH保持在6. 8，获得的培养液中含胞磷胆碱7. 6g/L。实施例3、按实施例I的步骤A制得枯草芽孢杆菌的培养物；按5%的接种量，将枯草芽孢杆菌的培养物接种于含有8%葡萄糖、2%酵母粉、1%尿素、O. 5%硫酸镁、1%磷酸二氢钾、O. 01 % D-生物素的培养液中，35°C培养至24小时，离心收集菌体，按照湿菌体10%的接种量接种于含有12 %葡萄糖、I %硫酸镁、I %磷酸二氢钾、I %磷酸胆碱、O. 01 %吐温-80 的培养液中，反应30h，过程中用浓氨水调节pH保持在6. 8，获得的培养液中含胞磷胆碱 8.2g/L。实施例4、按实施例I的步骤A制得枯草芽孢杆菌的培养物；按5 %的接种量，将枯草芽孢杆菌的培养物接种于含有12 %葡萄糖、2%酵母粉、I %尿素、2%玉米浆、O. 5%硫酸镁、I %磷酸二氢钾、O. 01% D-生物素的培养液中，35°C培养至24小时，离心收集菌体， 按照湿菌体10%的接种量接种于含有10%葡萄糖、1%硫酸镁、4%磷酸二氢钾、1%磷酸胆碱、O. OI %吐温-80、10 %工业啤酒酵母湿菌体的培养液中，24 °C反应46h，过程中用浓氨水调节PH保持在6. 5，获得的培养液中含胞磷胆碱11. 2g/L。实施例5、按实施例I的步骤A制得枯草芽孢杆菌的培养物；按5%的接种量，将枯草芽孢杆菌的培养物接种于含有13%葡萄糖、2%酵母粉、1%尿素、O. 5%硫酸镁、1%磷酸二氢钾、O. 01% D-生物素、10%冻融的工业啤酒酵母湿菌体、2%磷酸胆碱的培养液中， 30°C培养48小时，过程中用浓氨水调节pH保持在6. 5，获得的培养液中含胞磷胆碱8. 7g/ L0实施例6、按实施例I的步骤A制得枯草芽孢杆菌的培养物；按5%的接种量，将培养物接种于含有10%葡萄糖、2%酵母粉、2%尿素、O. 8%硫酸镁、I %磷酸二氢钾、O. 01% D-生物素的培养液中，30°C培养24小时后，添加15%工业啤酒酵母湿菌体和I. 5%的磷酸胆碱，继续培养48h，过程中用浓氨水调节pH保持在6. 8，获得的培养液中含胞磷胆碱 7. 2g/L。实施例7将谷氨酸棒状杆菌保藏号ATCC No. 13032接种于含有O. 5%葡萄糖、O. 5%牛肉膏、1%蛋白胨、O. 5%酵母粉、O. 5%氯化钠成分的培养液中，31°C培养至糖耗尽，得谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的培养物。按5 %的接种量，将所得培养物接种于含有8 %葡萄糖、2 % 酵母粉、I %尿素、O. 5%硫酸镁、I %磷酸二氢钾、O. 01% D-生物素的培养液中，37°C培养至糖耗尽时，将培养液按照30%的接种量接种于含有13%葡萄糖、O. 6%硫酸镁、I. 5%磷酸二氢钾、I. 5 %磷酸胆碱、O. 01 %吐温-80、10 %工业啤酒酵母湿菌体的培养液中，继续反应 27h，过程中用浓氨水调节pH保持在6. 8，获得的培养液中含胞磷胆碱4. 8g/L。实施例8将洋葱假单胞菌保藏号ATCC No.25416接种于含有1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、 酵母膏O. I %、磷酸氢二钠O. 05%成分的培养液中，28°C培养19h，得洋葱假单胞菌ATCC 25416的培养物。按5%的接种量，将所得培养物接种于在含有5%葡萄糖、I. 5%玉米浆、 1%豆柏水解液、麦芽糖2%、0. 5%硫酸镁、1%磷酸二氢钾成分的培养液养基中，26°C培养 IOh后，连续流加I %的磷酸胆碱，继续反应40h，过程中用浓氨水调节pH在6. 8，获得的培养液中含胞磷胆碱4. 7g/L。实施例9将柠檬节杆菌保藏号ATCC No. 11624接种于含有I %葡萄糖、O. 5%酵母膏、I %蛋白胨、O. I %磷酸氢二钠成分的培养液中，25°C培养至糖耗尽，得柠檬节杆菌ATCC 11624的培养物。按5 %的接种量，将培养物接种于含有8 %葡萄糖、I %玉米衆、I %豆柏水解液、麦芽糖2 %、O. 5 %硫酸镁、I %磷酸二氢钾、O. OI % D-生物素的培养液中，25 °C培养至36小时， 离心收集菌体，按照湿菌体10%的接种量接种于含有12%葡萄糖、1%硫酸镁、1%磷酸二氢钾、I %磷酸胆碱、O. 01%吐温-80的培养液中，反应30h,过程中用浓氨水调节pH保持在
6.8，获得的培养液中含胞磷胆碱3. 4g/L。实施例10将酿酒酵母保藏号ATCC No. 40075接种于含有O. 5%葡萄糖、O. 5%牛肉膏、I % 蛋白胨、O. 5%酵母粉、O. 5%氯化钠成分的培养液中，32°C培养至糖耗尽，得酿酒酵母ATCC 40075的培养物。按5%的接种量，将培养物接种于含有12%葡萄糖、2%酵母粉、I %尿素、 2%玉米浆、O. 5%硫酸镁、I %磷酸二氢钾、O. 01% D-生物素的培养液中，35 °C培养至24小时，离心收集菌体，按照湿菌体10%的接种量接种于含有10%葡萄糖、I %硫酸镁、4%磷酸二氢钾、I %磷酸胆碱、O. 01%吐温-80、25%大肠杆菌ATCC 21148干菌体的培养液中，24°C 反应40h，过程中用浓氨水调节pH保持在6. 7，获得的培养液中含胞磷胆碱4. 2g/L。实施例11、按实施例I的步骤A制得枯草芽孢杆菌的培养物；按5%的接种量，将培养物接种于含有12%葡萄糖、2%酵母粉、1%尿素、2%玉米浆、O. 5%硫酸镁、1%磷酸二氢钾、O. 01% D-生物素的培养液中，35°C培养至24小时，离心收集菌体，按照湿菌体10% 的接种量接种于含有10 %葡萄糖、I %硫酸镁、4 %磷酸二氢钾、I %磷酸胆碱、O. 01 %吐温_80、9%谷氨酸棒杆菌保藏号ATCC No. 13287干菌体的培养液中，24°C反应40h，过程中用浓氨水调节PH保持在6. 7，获得的培养液中含胞磷胆碱6. 9g/L。


本发明涉及一种胞磷胆碱的制备方法，是以嘧啶从头合成为基础反应，在有微生物A的培养液存在的情况下或者还有微生物B的培养液或处理物存在的情况下，将胆碱原料在反应温度20～38℃反应10～72小时，控制pH 5～7.5，累积生成胞磷胆碱；利用简单的起始原料碳、氮源，在含有胆碱原料的培养液中，利用代谢过程合成胞磷胆碱的前体胞嘧啶系核苷酸，在此反应溶液中反应累积生成胞磷胆碱；该方法避免使用价格昂贵的嘧啶系核苷酸或其前体原料，使得胞磷胆碱的制备成本大大降低。