专利名称：新型肝素实体及其使用方法用作机体内和机体上的替代血管、合成人工晶体、电极、导尿管等的医疗装置或用作连接机体以辅助手术或透析的体外装置的医疗装置是众所周知的。但是，在医疗装置中使用生物材料会引起不良机体反应，包括迅速形成血栓作用。各种血浆蛋白对在生物材料 表面上引发血小板和纤维蛋白沉积起作用。这些作用导致阻碍血液流动的血管收缩，随之而来的炎性反应会导致医疗装置功能的丧失。对血液接触装置而言，人们特别感兴趣的是能减少或抑制在生物材料和/或覆盖材料的表面上形成血栓的生物活性实体。糖胺聚糖(glycosaminoglycan)通常是优选的抗血栓剂；特别优选肝素、肝素类似物和衍生物。已对在生物材料上固定的糖胺多糖，如肝素，作出广泛研究来改进生物相容性和血相容性。肝素化材料在降低形成血栓中的机理被认为在于肝素通过抗凝血酶III (ATIII)加速丝氨酸蛋白酶(凝血酶)失活的能力。该方法中，ATIII与肝素中定义明确的五糖序列形成络合物，进行构象变化，从而提高ATIII与丝氨酸蛋白酶如凝血酶的活性位点形成共价键的能力。形成的丝氨酸蛋白酶-ATIII络合物再从肝素中释放，留下所述肝素经过催化过程经历后续循环失活。使生物活性实体，如肝素，以生物活性形式固定在底物上涉及对这些实体和生物材料的化学特性的了解。在医疗装置领域，陶瓷、聚合物和/或金属材料是常见的生物材料。这些材料可用于可植入装置、诊断装置或体外装置。常常需要改性生物材料的化学组成以使生物活性实体固定在底物上。通常这样进行这种改性处理生物材料表面以产生一群化学活性部分或基团，然后用合适的方法固定这些生物活性实体。对于其它生物材料，用其中掺有反应性化学基团的材料覆盖或涂覆生物材料的表面。然后通过覆盖材料的反应性化学基团将生物活性实体固定在生物材料上。已经记载过各种用于覆盖或涂覆生物材料的方案。固定到带有覆盖物或涂覆物的生物材料上的生物活性实体的代表性例子参见美国专利 4，810，784 ;5，213，898 ;5，897，955 ;5，914，182 ;5，916，585 ;和 6，461，665。当生物活性化合物、组合物或实体被固定时，固定过程可能对这些“生物制剂”的生物活性造成负面影响。许多生物制剂的生物学活性取决于该生物制剂在其固定状态下的构象和结构(即伯、仲、叔等)。除了仔细选择固定过程外，可能还需要对生物制剂进行化学改变才能将生物制剂以特定的构象和结构掺入覆盖材料中，所述的构象和结构使所述的生物制剂具有足够高的生物学活性来实现所需功能。尽管有优化的覆盖和固定方案，但其它处理如灭菌可能降低固定的生物制剂的生物学活性。在可移植医疗装置中，需要在临用前进行灭菌。也可能需要对具有污染物敏感性的体外诊断装置进行灭菌。这类装置的灭菌通常需要使装置暴露于升高的温度、压力和湿度，通常是若干循环。在一些情况下，灭菌过程中包括抗微生物杀菌剂，如环氧乙烷气体(EtO)或过氧化氢蒸汽。除灭菌外，机械压缩和膨胀，或长期储存固定的生物制剂会降低该生物制剂的活性。需要其上固定有生物活性实体的医疗装置，可以在不显著降低生物活性的前提下对医疗装置进行灭菌、机械压缩和膨胀和/或储存。这类医疗装置包括生物相容性组合物或化合物与固定的生物实体，以便最大程度减少灭菌、机械压缩和膨胀和/或储存期间该实体生物学活性的降低。在一些情况下，额外的生物相容性组合物或化合物可提高一些生物活性实体在灭菌后的生物学活性。发明概述因此，本发明包括医疗底物，所述医疗底物包括固定在底物上的肝素实体。与其他涂覆的医疗底物相比，本发明的肝素实体在固定、灭菌、机械压缩和膨胀、和/或储存之后保持明显的生物学活性。本发明的一个实施方式包括医疗底物，所述医疗底物包括通过至少一个肝素分子结合到底物上的肝素实体，所述结合的肝素实体对肝素酶敏感。在另一个实施方式中，所述底物选自聚乙烯、聚氨酯、硅酮、含聚酰胺的聚合物、聚丙烯、聚四氟乙烯、膨胀型聚四氟乙烯、含氟聚合物、聚烯烃、陶瓷和生物相容性金属。在另一个实施方式中，所述底物是膨胀型聚四氟乙烯。在另一个实施方式中，所述生物相容性金属是镍-钛合金，如镍钛诺(Nitinol)。在另一个实施方式中，所述底物是医疗装置的组件。在另一个实施方式中，所述医疗装置选自移植物、人造血管、支架、支架-移植物、分叉状移植物、分叉状支架、分叉状支架-移植物、贴片、塞子(Plug)、药物递送装置、导尿管、心脏起搏器导线、气囊和留置脉管滤器。在另一个实施方式中，在肝素酶处理之后，所述底物上检测不到肝素或其片段。本发明的另一个实施方式包括肝素实体，所述肝素实体包括至少一个肝素分子和至少一个核心分子，当所述肝素实体通过至少一个肝素分子结合到底物上时，所述肝素实体对肝素酶敏感。在一个实施方式中，所述核心分子选自蛋白质(包括多肽)、烃、氨基糖苷、多糖和聚合物。在另一个实施方式中，所述肝素实体通过至少一个肝素分子结合到底物上，所述结合的肝素分子通过端点连接与所述底物相连。在另一个实施方式中，所述肝素实体通过至少一个肝素分子结合到底物上，所述结合的肝素分子通过环状连接(loopattachment)与所述底物相连。本发明的另一个实施方式包括ATIII结合实体，其包括核心分子、连接在所述核心分子上的至少一个多糖链和所述多糖链上的至少一个游离末端醛部分(moiety)。在一个实施方式中，所述多糖链是肝素或肝素片段。在另一个实施方式中，所述核心分子选自蛋白质(包括多肽)、烃、氨基糖苷(aminoglycoside)、多糖和聚合物。在另一个实施方式中,所述底物选自聚乙烯、聚氨酯、硅酮、含聚酰胺的聚合物、聚丙烯、聚四氟乙烯、膨胀型聚四氟乙烯、含氟聚合物、聚烯烃、陶瓷和生物相容性金属。在另一个实施方式中，所述ATIII结合实体通过端点连接或环状连接结合到底物上。在另一个实施方式中，所述底物是医疗装置的组件。本发明的另一个实施方式包括确定结合在底物上的肝素实体结构的方法，其包括以下步骤提供包含肝素实体的底物，解聚所述肝素实体以生成可溶性肝素片段的混合物，采用柱色谱在所述混合物中检测各可溶性肝素片段，确定来自上述步骤的各检测肝素片段 的身份特征(identity)，以及从检测到的肝素片段的身份特征得出所述肝素实体的结构。在一个实施方式中，所述解聚通过肝素酶解聚进行。在另一个实施方式中，所述柱色谱是强阴离子交换高效液相色谱(SAX-HPLC)。本发明的另一个实施方式包括用于确定与底物结合的肝素实体结构的系统，该系统包括解聚溶液、标记试剂溶液和检测器。在另一个实施方式中，所述解聚溶液包含肝素酶。在另一个实施方式中，所述标记试剂溶液包含甲苯胺蓝和三(4-甲硫基)苯甲酸铽。在另一个实施方式中，所述检测器包括SAX-HPLC、表面荧光(印ifluoroscent)显微镜和吸收分光仪。附图简要说明图I示出本发明的几种肝素实体和所述肝素实体与底物的连接类型。图2示出各种偶联(conjugated)到膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)上并进行多次EtO灭菌的含醛肝素实体的ATIII结合能力。含醛肝素实体根据合成所述肝素实体时使用的核心分子进行分类。因此，实施例I中作为核心的是硫酸粘菌素(colistin sulfate),实施例2中的是新霉素，实施例4中的是聚-L-赖氨酸，实施例3中的是卷曲霉素，实施例5中的是聚乙烯亚胺(PEI)，实施例6中的是乙二胺(EDA)。所有的柱状物表示样品数的平均值，标出相对于标准偏差的误差线。图3A和B示出通过单端点连接方法固定在ePTFE底物上的包含游离末端醛的肝素实体用肝素酶-I处理并且用甲苯胺蓝染色之前(3A)和之后(3B)的光学显微图。图B与图A相比未着色，证明通过单端点连接方法固定在ePTFE底物上的包含游离末端醛的肝素实体在肝素酶-I处理之后基本上从所述底物上解聚。图3C示出通过端点醛连接和多点连接固定的肝素、包含通过端点连接和多点连接固定的新霉素核心和至少一个肝素分子的肝素实体和通过多点连接固定的USP肝素用肝素酶-I处理之前和之后的亮度归一化变化(normalized change)。对于所有多点连接到所述底物上的肝素端点醛、具有端点醛的包含肝素和新霉素核心的肝素实体和USP肝素，亮度值的归一化变化小，表示表面对肝素酶-I不敏感，在所述表面上仍存在大量肝素。图4A-C示出通过单端点连接方法固定在ePTFE底物上的包含肝素和EDA核心的肝素实体用肝素酶-I处理并且用甲苯胺蓝染色之前(4A和4B)和之后(4C)的光学显微图。染色样品证明存在肝素实体。样品4B和4C进行一轮灭菌，在灭菌后仅用去离子水清洗。经过灭菌和肝素酶-I处理之后的图4C的颜色表明肝素酶-I不能识别表面上的肝素实体。图4D和E示出通过单端点连接方法固定在ePTFE底物上的包含肝素和EDA核心的肝素实体用肝素酶-I处理并且用甲苯胺蓝染色之前(4D)和之后(4E)的光学显微图。这些样品进行一轮灭菌并在灭菌后用去离子水和硼酸清洗。经过灭菌之后的图4E没有颜色表明肝素酶-I能识别所述表面上的肝素实体并将其解聚。图5A-C示出由肝素酶-I解聚(A)USP肝素、(B)由肝素和硫酸粘菌素构成的肝素实体和(C)由肝素和硫酸新霉素构成的肝素实体得到的SAX-HPLC色谱。图6A和B示出由肝素酶-I解聚ePTFE表面固定的(a)通过游离末端醛结合的USP 肝素和(b)通过游离末端醛结合的由肝素和硫酸粘菌素构成的肝素实体得到的SAX-HPLC色谱。本发明包括医疗底物，所述医疗底物包括固定到底物上的肝素实体。与其他涂覆的医疗底物相比，本发明的肝素实体在固定和灭菌之后保持显著的生物学活性。在本发明公开的内容中，使用了一些术语。给出以下定义。本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义，除非上下文另有明确说明。本文中使用的术语“肝素实体”表示共价连接在核心分子上的肝素分子。所述肝素分子可以通过端点连接(如下所述和基本如美国专利第4，613，665号所述，其通过引用结合入本文用于所有目的)或本领域已知的其他方法(参见例如GT Hermanson，《生物偶联技术》Bioconjugate Techniques),学术出版社，1996 ；HG Garg等,肝素和硫酸肝素的化学和生物学性质(Chemistry and Biology of Heparin and Heparan Sulfate), Elsevier,2005)连接到所述核心分子上。 本文中使用的术语“核心分子”表示其上连接肝素的多官能分子。出于本发明的目的，所述核心分子和底物不相同，虽然核心分子和底物可以由同样的材料制成。在本文中，术语“基本纯的”表示目标物质是存在的主要物质(即与组合物中的任意其他独立的物质相比，其摩尔基准更大)，优选基本纯的馏分是目标物质构成存在的所有大分子物质的至少约50% (摩尔基准)的组合物。通常，基本上纯的组合物包含存在于所述组合物中的大于约80 %至约90 %的所有大分子物质。更优选地，所述目标物质纯化成基本均匀(通过常规检测方法在组合物中无法检测到污染物质)，其中所述组合物基本上由单一的大分子物质构成。在本文中，术语“肝素酶”表示解聚(即消化)肝素的任何酶反应。肝素酶的例子包括但不限于能解聚肝素的肝素酶-I、肝素酶-2、肝素酶-3、类肝素酶(heparanase)、外硫酸酯酶(exosulphatase)、细菌外酶和糖苷酶。在本文中，术语“对肝素酶敏感”表示用肝素酶处理包含肝素实体的底物并且用甲苯胺蓝染色所述底物之后，所述底物未观察到染色(基本如图3B和图4E所示)。该术语还表示可忽略量的甲苯胺蓝与残余肝素或其片段结合，能测量底物上甲苯胺蓝(或其他标记物)量的检测器，如分光光度计、亮度计、密度计、液体闪烁计数器、或Y计数器等的读数约为背景水平，或者与不含肝素实体并用甲苯胺蓝染色的底物相比时与背景水平没有明显不同，或者与未经肝素酶处理的包含肝素实体并用甲苯胺蓝染色的底物相比时低于所述检测器的灵敏度。该术语还表示在用肝素酶处理包含肝素实体的底物之后，与肝素或其片段结合的标记物不能检测到明显量的肝素或其片段。在本文中，术语“结合”、“连接”和“偶联”和其派生词涉及肝素实体和/或肝素时表示共价结合，除非另外说明。参照图1A-C，本发明的一个实施方式包括医疗底物，所述医疗底物包括通过至少一个肝素分子104结合到底物106上的肝素实体100，所述结合的肝素实体对肝素酶敏感。用于固定或结合所述肝素实体的合适的底物材料包括聚合物，例如但不限于聚酰胺、聚碳酸酯、聚酯、聚烯烃、聚苯乙烯、聚氨酯、聚(醚氨酯)、聚氯乙烯、硅酮、聚乙烯、聚丙烯、聚异戊二烯、聚四氟乙烯和膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE，如U. S专利第4，187，390号所述)。在一个实施方式中，所述底物是膨胀型或多孔聚四氟乙烯(ePTFE)。其他的底物包括但不限于疏水性底物，如聚四氟乙烯、膨胀型聚四氟乙烯、多孔聚四氟乙烯、氟化乙烯-丙烯、六氟丙烯、聚乙烯、聚丙烯、尼龙、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚氨酯、橡胶、娃酮橡胶、聚苯乙烯、聚砜、聚酯、聚轻基酸(polyhydroxyacid)、聚碳酸酯、聚酰亚胺、聚酰胺、聚氨基酸、再生纤维素和蛋白质如丝、羊毛和皮革。制备多孔聚四氟乙烯材料的方法如美国专利第3，953，566和4，187，390号所述，它们各自通过引用纳入本文。在另一个实施方式中，所述ePTFE可以用至少一种已知的化合物浸溃、填充、浸润(imbibe)或涂覆来引起生物活性应答。引起生物活性应答的化合物包括抗微生物剂(例如抗菌剂和抗病毒剂)、抗炎剂(例如地塞米松和泼尼松)、抗增殖剂(例如紫杉酚、紫杉醇(paclitaxel)和多烯紫杉醇(docetaxel))和抗聚结剂(例如阿昔单抗(abciximab)、依替巴肽(eptifibatide)和替罗非班(tirofibran))。在一个实施方式中，所述抗炎剂是类固醇。在另一实施方式中，所述类固醇是地塞米松。涂覆底物的方法为本领域熟知。在另一个实施方式中，所述底物包括本发明的肝素实体和涂层，所述涂层包含引起生物活性应答的化合物。所述底物包括以上和以下所述的材料。在一个实施方式中，所述底物是ePTFE。 其他合适的底物包括但不限于纤维质材料、琼脂糖、藻酸盐、聚羟基乙基甲基丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚烯丙基胺、聚烯丙基醇、聚丙烯酰胺和聚丙烯酸。此外，某些金属和陶瓷可以用作本发明的底物。合适的金属包括但不限于例如钛、不锈钢、金、银、铑、锌、钼、铷和铜。合适的合金包括钴-铬合金如L-605、MP35N、埃尔吉洛伊耐蚀游丝合金(Elgiloy),镍-铬合金(如镍钛诺(Nitinol)),和银合金如Nb-I % Zr等。用于陶瓷底物的合适的材料包括但不限于氧化硅(silicone oxide)、氧化铝、铝土、娃土、轻基磷灰石(hydroxyapapitite)、玻璃、氧化韩、聚娃烧醇(polysilanol)和氧化磷。在另一个实施方式中，可以使用基于蛋白质的底物，如胶原。在另一个实施方式中，可以使用基于多糖的底物，如纤维素。一些底物可以具有大量反应活性化学基团，增加至少一部分其上可结合本发明肝素实体的表面。本发明的所述肝素实体通过所述反应活性化学基团与底物材料共价结合。所述底物的表面可以是光滑、粗糙、多孔、弯曲、平坦、有角、不规则的表面或其组合。在一些实施方式中，具有表面孔隙的底物含有由该材料多孔表面延伸到材料本体内的内部孔隙空间。这些多孔性底物的内部底物材料约束了这些孔隙，常常提供适合固定生物活性实体的表面。无论是否具多孔性，底物都可以是细丝、薄膜、片层、管状、网状、织物、无纺织物和其组合。表面上缺少反应活性化学基团(或缺少适当反应活性的化学基团)的底物可以至少部分用聚合物覆盖材料覆盖，所述覆盖材料上具有可以与所述肝素实体结合的大量反应活性基团。聚合物底物也可以使用多种方法沿其表面或沿其聚合物主链进行改性，这些方法包括水解、氨解、光解、蚀刻、等离子体改性、等离子体聚合、碳烯插入、氮烯插入(nitreneinsertion)等。所述肝素实体通过覆盖材料的反应活性化学基团与聚合物覆盖材料共价连接或结合，或者直接与已改性的底物共价连接或结合。所述聚合物覆盖材料可以在至少一部分底物上形成至少一层。有多种其他的表面改性方法，例如美国专利第4，600, 652和6，642，242号所述，这些方法基于可以通过共价连接将具有聚氨酯脲层的底物与通过亚硝酸或高碘酸盐氧化来包含醛基的改性肝素结合而作出。类似的技术如美国专利第5，032，666号所述，其中底物表面在用抗血栓形成剂(如醛活化的肝素)固定之前，用富胺的氟化聚氨酯脲涂覆。公开出版物W087/07156中描述的是另一种可能提及的抗血栓形成的表面改性方法。装置的表面通过用溶菌酶或其衍生物层涂覆其上粘附有肝素的表面进行改性。制备抗血栓形成制品的另一种表面改性方法如美国专利第4，326，532号所述。在这种情况下，层状抗血栓形成表面包括聚合物底物、与所述聚合物底物结合的壳聚糖和与所述壳聚糖涂层结合的抗血栓形成剂。其他文献报道了也使用壳聚糖层来结合肝素的抗血栓形成的血滤器(hemofilter)。制备抗血栓形成表面的另一种方法如W097/07834所述，其中肝素与足量高碘酸盐混合，从而不会以超过每肝素分子两个糖单位(2糖单位/肝素分子)进行反应。将该混合物加入医疗装置的表面改性底物中，所述表面改性包含氨基。以上列出的向底物添加反应活性基团的方法仅仅是如何将其实现的小例子。以上列举没有穷尽。此外，应清楚用来向底物添加反应活性化学基团的方法取决于本领域技术人员对底物性质的认识。在本发明的另一个实施方式中，通过至少一个肝素分子包含所述结合的肝素实体的医疗底物是医疗装置的组件。医疗装置包括但不限于移植物、人造血管、支架、 支架-移植物、分叉状移植物、分叉状支架、分叉状支架-移植物!贴片(hernia patch)、_塞(hernia plugs)、牙周移植物(periodontal graft)、手术用织物、药物递送装置、导尿管、心脏导线气囊(cardiac leads balloon)和留置滤器。在一个实施方式中，所述支架可以用于心脏、外周或神经学应用中。在一个实施方式中，所述支架-移植物可以用于心脏、夕卜周或神经学应用中。本发明的另一个实施方式包括一种肝素实体，所述肝素实体包含至少一个肝素分子和至少一个核心分子。如图I所示，核心分子102是肝素实体100的“骨架”，肝素分子104结合在核心分子上。所述核心分子102可以是环状(102a，图IA和1C)、直线状(102b，图1B)、支链状、树枝状、“Y”形、“T”形或“星”形，如Freudenberg, U.，《生物材料》，30，5049-5060，2009 和 Yamaguchi，N.，《生物大分子》，6，1921-1930，2005 中所述。在一个实施方式中，所述核心分子选自蛋白质(包括多肽)、烃、脂质、氨基糖苷、多糖和聚合物。蛋白质包括但不限于抗体、酶、受体、生长因子、激素、丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)和任意球蛋白。特定的蛋白质和多肽包括但不限于白蛋白、粘菌素、胶原、聚赖氨酸、抗凝血酶III、纤维蛋白、纤维蛋白原、凝血酶、层连蛋白(Iaminin)、和角蛋白等。在另一个实施方式中，所述核心分子可以是多肽。所述多肽无需很长，可以包括一种或多种氨基酸的重复，例如丝氨酸、甘氨酸(例如Ser-Gly-Gly-Ser-Gly)、赖氨酸或鸟氨酸残基的重复。或者可以使用其他的氨基酸序列，例如粘菌素、聚赖氨酸和多粘菌素。多糖的例子包括但不限于中性多糖如纤维素、淀粉、琼脂糖、羧甲基纤维素、硝基纤维素和右旋糖苷，阴离子型多糖如藻酸盐、肝素、硫酸肝素、硫酸右旋糖酐、黄原胶、透明质酸、角叉菜胶、阿拉伯胶、黄蓍胶(tragacanth)、阿拉伯半乳聚糖和果胶；大环多糖如环糊精和羟丙基环糊精；和多阳离子型多糖如壳多糖和壳聚糖。合成聚合物的例子包括但不限于聚乙二醇(PEG) 200，300，400，600，1000，1450，3350，4000，6000，8000和20000、聚四氟乙烯、聚丙二醇、聚(乙二醇-共-丙二醇)、聚乙二醇的共聚物、聚丙二醇的共聚物、四氟乙烯与乙酸乙烯酯和乙烯醇的共聚物、乙烯与乙酸乙烯酯和乙烯醇的共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、聚丙烯酸；多元醇如聚乙烯醇和聚烯丙基醇；聚阴离子如丙烯酸和聚(甲基丙烯酸)。聚阳离子共聚物包括聚(烯丙胺)、聚(乙烯亚胺)、聚(胍)、聚(乙烯胺)、聚乙二醇-二胺、乙二胺和聚(季胺)；聚丙烯腈如水解聚丙烯腈、聚(丙烯酰胺-共-丙烯腈)和它们的共聚物。其他共聚物包括氟化共聚物，所述氟化共聚物包括四氟乙烯与乙烯醇、乙酸乙烯酯、乙烯甲酰胺、丙烯酰胺和乙烯胺的共聚物。在另一个实施方式中，所述核心分子可以是氨基糖苷，包括但不限于丁胺卡那霉素、阿贝卡星(arbekacin)、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、乙基西梭霉素、巴龙霉素、红链霉素(rhodostreptomycin)、链霉素、妥布霉素和阿普拉霉素。肝素是从猪肠或牛肺中分离的粘多糖，其分子大小和化学结构是不均匀的。肝素由交替的葡糖醛酸和葡糖胺单元构成。葡糖醛酸单元由D-葡糖醛酸和L-艾杜糖醛酸组成。分别是D-和L-(l，4)_结合至D-葡糖胺单元。较大比例的L-艾杜糖醛酸残基在2-位被硫酸化。D-葡糖胺单元为N-硫酸化，在6-位被硫酸化，a-(1，4)_结合到糖醛酸残基上。一些D-葡糖胺单元也在3-位被硫酸化。肝素包含分子量约为6，000-30, 000道尔顿的材料。通过硫酸化和乙酰化以不同的程度衍生成羟基和胺基。肝素中产生抗凝血性质的活性序列是与配体抗凝血酶III (ATIII)结合的独特五糖序列。该序列由三个D-葡糖胺和两个 糖醛酸残基组成。肝素分子也可以根据其五糖含量进行分类。约三分之一的肝素包含具有对ATIII有高亲和性的一个拷贝的独特五糖序列的链(参见Choay，血栓和止血研讨会(Seminars in Thrombosis and Hemostasis) 11 :81-85 (1985),其通过引用纳入本文)，而较小的比例(估计约为总肝素的1% )由含超过一个拷贝的高亲和性五糖的链组成(参见Rosenberg 等，Biochem. Biophys. Res. Comm. 86 :1319-1324(1979)，其通过引用纳入本文)。剩余的肝素(约66%)不包含五糖序列。因此，所谓的“标准肝素”由以下三种物质的混合物构成“高亲和性”肝素，其富含含有至少一个拷贝的五糖的物质，“极高亲和性”肝素表示大约I %的分子包含超过一个拷贝的五糖序列。这三种物质可以使用常规色谱法彼此分离，例如在抗凝血酶亲和柱上进行色谱(例如Sepharose-AT ;参见,例如Lam等，Biochem.Biophys. Res. Comm. 69 :570-577(1976)和 Horner Biochem. J. 262 :953-958 (1989)，其通过引用纳入本文)。在一个实施方式中，所述肝素来自动物。在另一个实施方式中，所述肝素来自牛或猪。在另一个实施方式中，所述肝素是合成肝素，即非动物来源(例如磺达肝素(fondaparinux)或依诺肝素(enoxaparin))。在另一个实施方式中，本发明的肝素实体包括浓缩的肝素，并且包含基本上纯的“高亲和性”肝素。在另一个实施方式中，本发明的肝素实体包括浓缩的肝素，并且包含基本上纯的“极高亲和性”肝素。在另一个实施方式中，本发明的肝素实体包括浓缩的肝素，并且包含基本上纯的“高亲和性”和“极高亲和性”肝素的组合。本发明的另一个实施方式包括通过至少一个肝素分子将所述肝素实体与医疗底物结合。如图I所示，本发明的肝素实体通过至少一个肝素分子与所述底物结合。这样，在一个实施方式中，所述结合的肝素分子通过端点连接与所述底物相连(如图IA和IB所示)。在另一个实施方式中，所述结合的肝素分子通过端点醛与所述底物相连。这可以基本上如美国专利第4，613，665号(其全文内容通过引用纳入本文)所述并且如以下所述完成。在另一个实施方式中，所述肝素实体通过至少一个肝素分子结合到底物上，所述结合的肝素分子通过环状连接(loop attachment)与所述底物相连。如图IC所示,环状连接是所述肝素实体通过至少一个肝素连接的连接方式，其中所述肝素在少量位置上与所述底物松散地连接，从而使得相当部分的结合肝素与肝素酶相接触(与将肝素紧密地连接在大量位置上的更常见的方法相反)。将肝素与底物偶联的更常见的方法包括使大部分沿肝素分子长度无规定位的官能团反应(例如使用偶联剂如碳二亚胺、环氧化物和聚醛)。这些方法使得所述活性序列(上述独特的五糖序列)有很大的可能与所述底物结合，得到降低的活性和/或丧失活性。在肝素的环状连接中，只有肝素上的一些官能团反应并与所述底物结合。因此，很可能连接的肝素中的活性序列未与所述底物相结合，从而使得所述活性序列与其配体结合。在另一个实施方式中，本发明包括与所述底物有多种连接方式的肝素实体，其中所述活性序列未与所述底物结合。在另一个实施方式中，所述结合的肝素分子通过环状连接与所述底物相连。如上所述，端点连接和环状连接使得至少一个肝素分子中的相当部分(在肝素实体中)未与底物结合。本文中，术语“相当部分”表示约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%的肝素分子未与所述底物结合。在另一个实施方式中，该术语还表示与所述底物结合的所述至少一个肝素分子(在肝素实体中)不通过其活性序列与底物结合。因此，由于所述活性序列未与所述底物的表面结合，所述活性序列与其配体相互作用的可能性较高。换言之，如果所述活性序列与所述底物的表面结合，则肝素与其配体结合的机会就小。但是，由于所述肝素实体通过端点连接和/或环状连接由肝素相连，所述肝素对肝素酶敏感。因此，在肝素酶处理之后，在所述底物的表面上有极少(如果有的话)的肝素或其片段。相反，一些更常见的将肝素与底物表面相连的方法(如上所述，其沿肝素分子的长度包含多个键)在肝素酶处理之后，将仍有大量肝素或其片段与所述底物表面相连。因此，在肝素酶处理之后，可以在所述底物表面上检测到肝素或其片段。不限于任何具体理论，本发明人发现了结合肝素或肝素实体对肝素酶越敏感，所述结合肝素或肝素实体的生物活性越高。这可能是因为结合肝素或肝素实体的活性序列不与底物的表面相连，因此所述结合肝素或肝素实体与其配体结合的机会更大。肝素必须具有完整的构象和结构来被ATIII识别，如果所述构象和结构损失，肝素将表现出很差的活性。此外，所述构象和结构损失导致其他蛋白质如肝素酶-I的识别性差，使得损失肝素难以解聚。例如，用碳二亚胺改性可溶性肝素以不再被肝素酶-I识别的方式改变所述可溶性肝素结构，改性的可溶性肝素具有降低的全血抗凝血活性(参见Olivera, G. B.，生物材料(Biomaterials)，24，4777-4783，2003)。本发明人发现连接的肝素或肝素实体的肝素酶敏感性可通过所述连接肝素或肝素实体的ATIII结合活性来预测。不希望受限于任何具体理论，如果连接的肝素或肝素实体保持对特定酶如肝素酶-I的特异性(specificity)，则所述连接的肝素或肝素实体保持对其基本上足够的初级/二级/三级结构，也具有对ATIII的特异性。因此，本发明人发现当连接的肝素或肝素实体被肝素酶-I识别时，所述连接的肝素或肝素实体也被ATIII识别，即具有高结合活性。本发明人还发现硼酸清洗能恢复失活的连接肝素或肝素实体(例如通过灭菌、机械压缩和膨胀或长期储存失活)对肝素酶敏感性。因此，本发明的另一个实施方式包括一种恢复结合在底物上的肝素或肝素实体的肝素酶敏感性的方法，其包括在硼酸溶液中清洗所述底物。在一个实施方式中，对所述底物进行灭菌循环。在另一个实施方式中，对所述底物进行降低肝素酶-I活性的机械处理。 在本发明的另一个实施方式中，在用肝素酶对具有本发明的结合肝素实体的医疗底物进行处理之后，在所述底物上检测不到肝素或其片段。在另一个实施方式中，在用肝素酶对具有本发明的结合肝素实体的医疗底物进行处理之后，与肝素酶处理之前相比，检测到的肝素或其片段水平明显更低。明显更低水平的检测包括对肝素染色和/或标记之后的极少检测。在另一个实施方式中，所述肝素或其片段在染色或标记之后视觉上(宏观上)观察不到。肝素或其片段可以通过直接或间接与肝素或其片段结合的标记物进行检测。在一个实施方式中，与肝素或其片段结合的所述标记物选自染料、抗体和蛋白。标记物的例子包括但不限于蛋白，包括抗肝素抗体(多克隆或单克隆)和ATIII ;异染性染料，包括甲苯胺蓝、天青 A(azure A)、阿辛蓝(alcian blue)、维多利亚蓝 4R(victoria blue 4R)、夜蓝(night blue)、亚甲蓝；放射性碘化标记物，包括放射性碘化甲苯胺蓝、放射性碘化亚甲蓝、放射性碘化肝素抗体、放射性碘化ATIII ;氚化标记物，包括氚化甲苯胺蓝、氚化天青A、氚化阿辛蓝、氚化维多利亚蓝4R、氚化夜蓝、氚化亚甲蓝；碳-14标记物，包括14C-甲苯胺蓝、14C-天青A、14C-阿辛蓝、14C-维多利亚蓝4R、14C-夜蓝、14C-亚甲蓝；荧光标记物，包括若丹明(rhodamine)标记的肝素抗体、突光素标记的肝素抗体、若丹明标记的ATIII、突光素标记的ATIII。在另一个实施方式中，所述染料是甲苯胺蓝。在另一个实施方式中，在肝素酶处理之后，可忽略量的甲苯胺蓝与肝素或其片段结合，但在所述底物上目测检测不到(基本上如图3B和4E所示)。在另一个实施方式中，在肝素酶处理之后，可忽略量的甲苯胺蓝与残余的肝素或其片段结合，能测量底物上甲苯胺蓝(或上述其他标记物)量的检测器(例如分光光度计、亮度计、密度计、液体闪烁计数器、或Y计数器等)的读数约为背景水平，或者与不含肝素实体的底物相比时与背景水平没有明显差别。在另一个实施方式中，在肝素酶处理之后，能测量底物上甲苯胺蓝(或上述其他标记物)量的检测器读数与未经肝素酶处理的包含肝素实体并用甲苯胺蓝染色的底物相比时明显不同。本发明的另一个实施方式包括肝素实体，所述肝素实体包括至少一个与核心分子相连的肝素分子，其中所述实体通过肝素分子与底物结合，在与肝素酶和甲苯胺蓝接触之后，所述底物宏观上显示其表面上基本上无甲苯胺蓝(如图3B和4E所示)。本发明的另一个实施方式包括肝素实体，所述肝素实体包括至少一个肝素分子和至少一个核心分子，当所述肝素实体通过至少一个肝素分子结合到底物上时，所述肝素实体对肝素酶敏感。在另一个实施方式中，所述底物选自聚乙烯、聚氨酯、硅酮、含聚酰胺的聚合物、聚丙烯、聚四氟乙烯、膨胀型聚四氟乙烯、生物相容性金属、陶瓷、蛋白质、多糖和任意上述底物。在另一个实施方式中，所述底物是膨胀型聚四氟乙烯。在另一个实施方式中，所述底物是医疗装置的组件。在另一个实施方式中，所述医疗装置选自移植物、人造血管、支架、支架-移植物、分叉状移植物、分叉状支架、分叉状支架-移植物、贴片、塞子(Plug)、药物递送装置、导尿管和心脏导线。在另一个实施方式中，所述支架可以用于心脏、外周或神经学应用中。在一个实施方式中，所述支架-移植物可以用于心脏、外周或神经学应用中。在另一个实施方式中，所述医疗装置可以用于矫形外科、皮肤科或妇科应用中。在另一个实施方式中，所述核心分子包括环形、直链、支链、树枝状、“Y”、“T”或星状分子结构。在另一个实施方式中，所述核心分子选自蛋白质、多肽、烃、多糖、氨基糖苷、聚合物和含氟聚合物。 在另一个实施方式中，通过与肝素或其片段结合的标记物检测肝素或其片段。在另一个实施方式中，与肝素或其片段结合的所述标记物选自染料、多克隆抗体和蛋白质。在另一个实施方式中，所述染料是甲苯胺蓝。在另一个实施方式中，在肝素酶处理之后，可忽略量的甲苯胺蓝与残余肝素或其片段结合，在所述底物上目测检测不到。在另一个实施方式中，在肝素酶处理之后，可忽略量的甲苯胺蓝与残余的肝素或其片段结合，能测量底物上甲苯胺蓝(或上述其他标记物)量的检测器(例如分光光度计、亮度计、密度计、液体闪烁计数器、或Y计数器等)的读数约为背景水平，或者与不含肝素实体的底物相比时与背景水平没有明显差别。在另一个实施方式中，在肝素酶处理之后，能测量底物上甲苯胺蓝(或上述其他标记物)量的检测器读数与未经肝素酶处理的包含肝素实体并用甲苯胺蓝染色的底物相比时明显不同。在另一个实施方式中，所述肝素实体通过至少一个肝素分子结合在底物上，所述结合的肝素分子通过端点连接与所述底物相连。在另一个实施方式中，所述肝素实体通过至少一个肝素分子结合在底物上，所述结合的肝素分子通过端点醛与所述底物相连。在另一个实施方式中，所述肝素实体通过至少一个肝素分子结合在底物上，所述结合的肝素分子通过环状连接(loop attachment)与所述底物相连。在另一个实施方式中，所述肝素实体通过至少一个肝素分子结合在底物上，所述结合的肝素分子通过醛 沿所述肝素长度与所述底物相连。本发明的另一个实施方式包括ATIII结合实体，其包括核心分子、与所述核心分子相连的多糖链和在所述多糖链上的游离末端醛部分。该ATIII结合实体则可以通过末端醛与底物相连。本发明的另一个实施方式包括ATIII结合实体，其包括核心分子、与所述核心分子相连的多糖链和沿所述多糖链长度的游离末端醛部分。该ATIII结合实体则可以通过醛沿着所述多糖链的长度与底物环状连接。在另一个实施方式中，所述多糖链是肝素。在另一个实施方式中，所述核心分子选自蛋白质(包括多肽)、烃、氨基糖苷、多糖、聚合物、含氟聚合物或本文所述的任意核心分子。在另一个实施方式中，肝素通过端点连接结合在所述核心分子上。在另一个实施方式中，所述底物选自聚乙烯、聚氨酯、硅酮、含聚酰胺的聚合物、聚丙烯、聚四氟乙烯、膨胀型聚四氟乙烯、生物相容性金属或本文所述的任意底物。在另一实施方式中，所述生物相容性金属是镍钛诺(Nitinol)。在另一个实施方式中，所述底物是膨胀型聚四氟乙烯。在另一个实施方式中，所述底物是医疗装置的组件。在另一个实施方式中，所述医疗装置选自移植物、人造血管、支架、支架-移植物、分叉状移植物、分叉状支架、分叉状支架-移植物、贴片、塞子(Plug)、药物递送装置、导尿管和心脏导线。在另一个实施方式中，所述医疗装置可以用于心脏、外周、神经学、矫形外科、皮肤科或妇科应用中。本发明的另一个实施方式包括可植入的医疗装置，所述医疗装置包括医疗底物、所述医疗底物包括通过至少一个肝素分子结合在底物上的肝素实体，所述结合的肝素实体对肝素酶敏感。在一个实施方式中，所述医疗装置选自移植物、人造血管、支架、支架-移植物、分叉状移植物、分叉状支架、分叉状支架-移植物、贴片、塞子(Plug)、药物递送装置、导尿管和心脏导线。在另一个实施方式中，所述支架可以用于心脏、外周或神经学应用中。在另一个实施方式中，所述支架可以是可扩张气囊的和/或自膨胀型支架。所述支架可以由任意生物相容性材料制备，所述生物相容性材料包括上述任意聚合物或金属。在另一个实施方式中，所述支架由镍钛诺和/或不锈钢制成。在另一个实施方式中，所述支架包括移植物。在另一个实施方式中，所述移植物和/或支架包括本发明的肝素实体。与其他涂覆的医疗底物相比，本发明的肝素实体在固定和灭菌之后保持明显的生物学活性。因此，在一个实施方式中，所述金属底物包括通过至少一个肝素分子结合到底物上的肝素实体，所述结合的肝素实体对肝素酶敏感，其ATIII活性约为300皮摩尔/平方厘米。在另一个实施方式中，所述ATIII活性约为250皮摩尔/平方厘米、约200皮摩尔/平方厘米、约150皮摩尔/平方厘米、约100皮摩尔/平方厘米、约50皮摩尔/平方厘米、约40皮摩尔/平方厘米、约30皮摩尔/平方厘米、约20皮摩尔/平方厘米、约10皮摩尔/平方厘米或约5皮摩尔/平方厘米。在另一个实施方式中，在第一轮灭菌之后，所述医疗底物的ATIII活性约为250皮摩尔/平方厘米、约200皮摩尔/平方厘米、约150皮摩尔/平方厘米、约100皮摩尔/平方厘米、约50皮摩尔/平方厘米、约40皮摩尔/平方厘米、约30皮摩尔/平方厘米、约20皮摩尔/平方厘米、约10皮摩尔/平方厘米或约5皮摩尔/平方厘米。在另一个实施方式中，在第二轮灭菌之后，所述医疗底物的ATIII活性约为100皮摩尔/平方厘米、约90皮摩尔/平方厘米、约80皮摩尔/平方厘米、约70皮摩尔/平方厘米、约60皮摩尔/平方厘米、约50皮摩尔/平方厘米、约40皮摩尔/平方厘米、约30皮摩尔/平方厘米、约20皮摩尔/平方厘米、约10皮摩尔/平方厘米或约5皮摩尔/平方厘米。在另 一个实施方式中，在第三轮灭菌之后，所述医疗底物的ATIII活性高于约50皮摩尔/平方厘米、或者约为70皮摩尔/平方厘米、约60皮摩尔/平方厘米、约50皮摩尔/平方厘米、约40皮摩尔/平方厘米、约30皮摩尔/平方厘米、约20皮摩尔/平方厘米、约10皮摩尔/平方厘米或约5皮摩尔/平方厘米。ATIII活性鉴定方法是本领域熟知的，至少一种如下所述。在另一个实施方式中，本发明的所述肝素实体在压缩和膨胀医疗装置之后保持明显的生物活性。在另一个实施方式中，本发明的所述肝素实体在经过医疗装置的压缩和/或膨胀状态下的储存条件之后保持明显的生物活性。本发明的另一个实施方式包括确定与底物结合的肝素实体结构的方法。确定与底物结合的肝素实体结构的一种方法包括以下步骤提供包含肝素实体的底物，解聚所述肝素实体以产生可溶性肝素片段的混合物，用柱色谱检测所述混合物中的各可溶性肝素片段，确定以上检测到的可溶性肝素片段的身份特征，和从所述检测到的可溶性肝素片段的身份特征得到所述肝素实体的结构。在一个实施方式中，所述解聚通过肝素酶-I进行。在另一个实施方式中，柱色谱是强阴离子交换高效液相色谱或SAX-HPLC。本发明的另一个实施方式包括可植入的医疗装置，所述医疗装置包括医疗底物、所述医疗底物包括通过至少一个肝素分子结合在底物上的肝素实体，所述结合的肝素实体对肝素酶敏感。在一个实施方式中，所述医疗装置选自移植物、人造血管、支架、支架-移植物、分叉状移植物、分叉状支架、分叉状支架-移植物、贴片、塞子(Plug)、药物递送装置、导尿管、心脏导线、气囊和留置滤器。在另一个实施方式中，所述支架可以用于心脏、外周或神经学应用中。在另一个实施方式中，所述支架可以是可扩张气囊的和/或自膨胀型支架。所述支架可以由任意生物相容性材料制备，所述生物相容性材料包括上述任意聚合物或金属。在另一个实施方式中，所述支架由镍钛诺和/或不锈钢制成。在另一个实施方式中，所述支架包括移植物。在另一个实施方式中，所述移植物和/或支架包括本发明的肝素实体。本发明的另一个实施方式包括确定与底物结合的肝素实体的空间分布的方法。确定与底物结合的肝素实体的空间分布的一种方法包括以下步骤提供包含肝素实体的底物，解聚所述肝素实体以产生包含表面结合的不饱和肝素片段的表面，使所述表面与标记试剂反应，所述标记试剂向所述表面结合的不饱和肝素片段引入可检测组分，通过所述可检测组分检测所述表面结合的不饱和肝素片段，以及从存在的表面结合的不饱和肝素片段得到所述肝素实体的空间分布。在一个实施方式中，解聚通过肝素酶-I进行。在另一个实施方式中，所述肝素试剂是镧系迈克尔类加成有机络合物(lanthanoid Michael-Iikeaddition organo-complex)。在另一个实施方式中，所述标记试剂是三(4-甲硫基)苯甲酸铽。在另一个实施方式中，所述有机络合物包含化学吸收的金纳米颗粒。在另一个实施方式中，所述检测通过表面荧光显微镜或透射电子显微镜进行。本发明的另一个实施方式包括用于确定与底物结合的肝素实体结构的系统，该系统包括解聚溶液、标记试剂溶液和检测器。系统是用来检测与底物结合的肝素实体结构和类型的试剂和设备的组合件。在一个实施方式中，所述解聚溶液包括肝素酶-I。在另一个 实施方式中，所述标记试剂溶液包含甲苯胺蓝和三(4-甲硫基)苯甲酸铽。在另一个实施方式中，所述检测器包括SAX-HPLC、表面荧光(印ifluoroscent)显微镜和吸收分光仪。在另一个实施方式中，所述试剂的组合件可以是试剂盒。在对端点连接的肝素和/或肝素实体进行酶促肝素酶-I解聚之后，留在表面上的肝素片段是不饱和的，即它们包含碳碳双键(“残根(nub)”)。酶促肝素酶解聚涉及将非还原性末端糖醛酸残基切割成4，5-不饱和衍生物。这得到与底物结合的剩余表面结合的不饱和肝素片段，所述肝素片段包括碳碳双键。因此，所述剩余表面结合的不饱和肝素片段结构是不饱和的，可以与各种检测分子反应，这些检测分子包括迈克尔类加成络合物，如含硫醇的化合物和含硫醇的荧光化合物，如三(4-甲硫基)苯甲酸铽。因此，在本发明的另一个实施方式中，对端点连接的肝素实体进行酶促肝素酶-I解聚之后，检测到与底物结合的所述剩余表面结合的不饱和肝素片段包含碳碳双键。该方法可以确定肝素和/或肝素实体是否与底物端点连接。在另一个实施方式中，残根检测与任一种上述检测和/或标准方法组合使用。通过以下实施例进一步说明本发明，所述实施例不应解释为具有限制性。所有附图和参考文献的内容通过参考结合于此。实施例实施例I本实施例描述包含肝素和硫酸粘菌素作为核心的肝素实体的构造。该肝素实体包含可用于连接底物表面的游离末端醛。将硫酸粘菌素(0. 10g, Alpharma股份有限公司(Alpharma, Inc.))溶解在300毫升含MES缓冲液(pH 4. 7, BupH 热科学公司(Thermo Scientific))的去离子(DI)水中。向其中加入10克USP肝素、4克N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS，热科学公司)和4克I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(盐酸EDC，密苏里州圣路易斯的西格玛-艾尔德里奇公司(EDC hydrochloride, Sigma-Aldrich, St. Louis,MO))。使反应在室温下进行 4小时，接着用50,000 MWCO膜(Spectra/p0r )透析过夜。将滞留物(从500毫升得到约350毫升)转移至烧杯中，冷却至0°C。加入亚硝酸钠(10毫克)和乙酸(2毫升)，使反应在0°C进行I小时。用50，000MWC0膜进行透析，向透析液中加入I克NaCl，透析过夜。冷冻并冻干滞留物，得到细粉末。实施例2本实施例描述包含肝素和硫酸新霉素作为核心的肝素实体的构造。该肝素实体包含可用于连接底物表面的游离末端醛。将硫酸新霉素(0. 0646克，光谱化学公司(Spectrum Chemical))溶解在300毫升含MES缓冲液(pH 4. 7, BupH 热科学公司(Thermo Scientific))的去离子(DI)水中。向其中加入10克USP肝素、4克N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)和4克盐酸EDC。使反应在室温下进行4小时，接着用50,000 MWCO膜(Spectra/por )透析过夜。将滞留物(从505毫升得到约400毫升)转移至烧杯中，冷却至0°C。加入亚硝酸钠(10毫克)和乙酸(2毫升)，使反应在0°C进行I小时。用50，000MWC0膜进行透析，向透析液中加入I克NaCl，透析过夜。使用20微米、0. 00079英寸的美国标准测试筛(A. S. T. M. E. -11第635号说明)过滤透析滞留物两次，以去除小颗粒。冷冻滞留物并冻干，得到细粉末。实施例3
本实施例描述包含肝素和硫酸卷曲霉素作为核心的肝素实体的构造。该肝素实体包含可用于连接底物表面的游离末端醛。将硫酸卷曲霉素(0. 0501克，密苏里州圣路易斯的西格玛-艾尔德里奇公司)溶解在300毫升含MES缓冲液(pH 4. 7, BupH 热科学公司(Thermo Scientific))的去离子(DI)水中。向其中加入10克USP肝素、4克N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)和4克盐酸EDC。使反应在室温下进行4小时。使用20微米、0. 00079英寸的美国标准测试筛(A. S. T. M. E. -11第635号说明)过滤反应混合物一次，以去除小颗粒，并用50，000MWC0膜(Spectra/ por )透析滤液过夜。将滞留物(从515毫升得到约400毫升)转移至烧杯中，冷却至0°C。加入亚硝酸钠(10毫克)和乙酸(2毫升)，使反应在0°C进行I小时。用50，000MWC0膜进行透析，向透析液中加入I克NaCl，透析过夜。使用20微米、0. 00079英寸的美国标准测试筛(A. S. T. M. E. -11第635号说明)过滤滞留物两次，以去除小颗粒。冷冻滞留物并冻干，得到细粉末。实施例4本实施例描述包含肝素和聚-L-赖氨酸作为核心的肝素实体的构造。该肝素实体包含可用于连接底物表面的游离末端醛。将聚-L-赖氨酸(0. 1776克，西格玛-艾尔德里奇公司，分子量为1，000-5, 000克/摩尔)溶解在300毫升含MES缓冲液(pH 4. 7，BupH 热科学公司(Thermo Scientific))的去离子(DI)水中。向其中加入10克USP肝素、4克N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)和4克盐酸EDC。使反应在室温下进行4小时，接着用50，000MWC0膜(Spectra/ Por )透析过夜。将滞留物(从505毫升得到约400毫升)转移至烧杯中，冷却至(TC。加入亚硝酸钠(10毫克)和乙酸(2毫升)，使反应在0°C进行I小时。用50，000MWC0膜进行透析，向透析液中加入I克NaCl，透析过夜。冷冻滞留物并冻干，得到细粉末。实施例5本实施例描述包含肝素和聚乙烯亚胺(PEI)作为核心的肝素实体的构造。该肝素实体包含可用于连接底物表面的游离末端醛。将PEI (Lupasol，BASF，I. 7756 克)溶解在 300 毫升含 MES 缓冲液(pH 4. 7, BupH 热科学公司(Thermo Scientific))的去离子(DI)水中。向其中加入10克USP肝素、4克N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)和4克盐酸EDC。使反应在室温下进行4小时，接着用50，000MWC0膜(Spectra/ por )透析过夜。将滞留物(从505毫升得到约400毫升)转移至烧杯中，冷却至0°c。加入亚硝酸钠(10毫克)和乙酸(2毫升)，使反应在0°C进行I小时。用50，000MWC0膜进行透析，向透析液中加入I克NaCl，透析过夜。冷冻滞留物并冻干，得到细粉末。实施例6本实施例描述包含肝素和乙二胺(EDA)作为核心的肝素实体的构造。该肝素实体包含可用于连接底物表面的游离末端醛。采用冰浴，用等体积的HCl和去离子水稀释液将EDA(0. 0043克，密苏里州圣路易斯的西格玛-艾尔德里奇公司)中和至PH为4. 7，再溶解在含MES缓冲液(pH 4. 7，BupH 热科学公司(Thermo Scientific))的300毫升去离子水中。向其中加入10克USP肝素、 4克N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)和4克盐酸EDC。使反应在室温下进行4小时，接着用50，000MWC0膜(Spectra/ Por )透析过夜。将滞留物(从505毫升得到约400毫升)转移至烧杯中，冷却至0°C。加入亚硝酸钠(10毫克)和乙酸(2毫升)，使反应在0°C进行I小时。用50，000MWC0膜进行透析，向透析液中加入I克NaCl，透析过夜。冷冻滞留物并冻干，得到细粉末。实施例I将实施例1-6中含游离末端醛的肝素实体固定在ePTFE底物的表面上，并测试ATIII活性。片层形式的ePTFE底物材料获自亚利桑那州弗拉格斯塔夫的W. L.戈尔联合公司(ff. L. Gore&Associates, Inc. ,Flagstaff,AZ),商品名为 GORETM 微孔过滤介质(GMM-406)。将底基涂层形式的覆盖材料施加于ePTFE材料，具体是将该材料设置到直径十厘米(IOcm)的塑料绣花圈(embroidery hoop)上,并将支持的ePTFE材料浸入100%异丙醇(IPA)约五分钟(5分钟)，然后浸入聚乙烯亚胺(PEI，Lupasol，BASF)和IPA的一比一(I I)溶液中。LUPASOL 无水PEI获自BASF，将其稀释至约4%的浓度，并调节至pH 9. 6。将ePTFE材料浸入该溶液约15分钟后，由该溶液中取出该材料，并用PH 9. 6的去离子水冲洗15分钟。保留在ePTFE材料上的PEI与pH 9. 6的0. 05%戊二醛水溶液(安氏公司(Amresco))交联15分钟。将该构造放入pH 9. 6的0. 5% PEI水溶液中15分钟，然后再次用pH 9. 6的DI水冲洗15分钟，以使附加的PEI加入该构造。用氰基硼氢化钠(NaCNBH3)溶液(5g溶解于I升去离子水中，PH 9. 6)还原戊二醛与PEI层之间反应形成的亚胺15分钟，并用DI水冲洗30分钟。将该构造物浸入pH 9.6的0.05%戊二醛水溶液15分钟，然后浸入pH 9. 6的0. 5% PEI水溶液15分钟，以便将另一层PEI加入该构造物。然后用pH 9. 6的DI水冲洗该构造物15分钟。将该构造物浸入NaCNBH3溶液(5g溶解于I升去离子水，pH 9. 6) 15分钟，然后用DI水冲洗30分钟，将得到的亚胺还原。通过重复这些步骤将第三层施加于该构造物。产物是多孔疏水性氟聚合物基料或圆盘，该基料的基本上所有暴露表面和间隙表面上都具有亲水性交联聚合物基料涂层。在将另一层PEI设置到该构造物上的制备过程中，可将中间化学层粘附于聚合物底基涂层。在硫酸葡聚糖(安玛西亚生物技术公司(Amersham Pharmacia Biotech))和氯化钠(0. 15g硫酸葡聚糖和IOOg NaCl溶解于IL DI水，pH 3)的60°C溶液中处理该构造90分钟，然后用DI水冲洗15分钟，以制备中间离子电荷层。
将该构造物放置在0. 3% PEI水溶液(pH 9)中约45分钟，然后用氯化钠溶液(50gNaCl溶解于IL DI水)冲洗20分钟，将本文中称为“加帽层”的PEI层粘附于中间层。最后用DI水冲洗20分钟。通过将构造物放置在含肝素实体的氯化钠盐溶液(约0. 9克含游离末端醛的肝素实体、5. 88克NaCl溶解在200毫升去离子水中，pH 3. 9)中并在60°C保持10分钟将实施例1-6中含游离末端醛的肝素实体连接或偶联到PEI层上。向肝素实体溶液(200毫升)加入体积为572微升的2. 5% (w/v)NaCNBH3水溶液。在上述温度下再保持样品110分钟。然后用DI水冲洗样品15分 钟，用硼酸盐缓冲液(10. 6g硼酸，2. Ig NaOH和0. IgNaCl溶解于IL DI水，pH 9. 0)冲洗20分钟，最后用DI水冲洗15分钟，然后冻干整个构造，得到包含结合于ePTFE底物材料表面的肝素实体的干燥构造物。用甲苯胺蓝对该构造样品的两侧染色，以测定肝素大分子构造物的存在和均匀性。染色产生均匀的染色表面，表明存在肝素，且肝素均匀地与ePTFE材料结合。将标称尺寸约I平方厘米的样品从构造物中切出，通过测量包含端点连接在ePTFE底物表面上的游离末端醛的肝素实体的ATIII结合能力来测定肝素活性° 该测定参见 Larsen M. L.等，“Assay of plasma heparin using thrombin andthe chromogenic substrate H-D-Phe-Pip-Arg-pNA (S-2238)(用凝血酶和发色底物H-D-Phe-Pip-Arg-pNA(S-2238)测定血浆肝素)”。Thromb Res 13 :285-288(1978)和Pasche B.等，“A binding of antithrombin to immobilized heparin under varyingflow conditions(抗凝血酶在不同流动条件下与固定肝素的结合)”，Artif. Organs 15 281-491 (1991)，它们通过引用纳入本文用于所有目的。结果表示为每单位表面积底物材料结合的ATIII量，单位是皮摩尔/平方厘米(pmol/cm2)。在整个测定中，将所有样品保持在湿润条件下。重要的是，注意到如果考虑到材料的两面，则约一平方厘米(Icm2)的各样品的总表面积为2平方厘米(2cm2)，以pmol/cm2计算ATIII肝素实体结合活性时只考虑样品的一个表面(即Icm2)。将表示实施例1-6中制备的各偶联构造物的冻干样品放入单独的Tower DUALPEEL 自密封袋(伊利诺州麦克格的安利真健康护理公司(AllegianceHealthcare Corp.，McGaw Park, IL))中并密封，以进行EtO灭菌。在调理I小时(Ihr)、EtO气体停留时间I小时(Ihr)、设定温度为55°C、曝气时间12小时(12hr)的条件下进行环氧乙烷灭菌。对各EtO灭菌之后的样品用EtO灭菌，重复3次。图2是示出实施例1-6中固定在ePTFE表面上含游离末端醛的肝素实体和进行最高达三次EtO灭菌循环的肝素实体的ATIII结合能力的柱状图。抗凝血酶III结合活性表示为每平方厘米底物材料上的结合抗凝血酶III的皮摩尔数。从结果中可以看出，在灭菌之前和接着进行三次EtO灭菌之前，所有含游离末端醛的偶联肝素实体具有高的抗凝血酶III结合活性。所有的柱状物表示样品数的平均值，标出相对于标准偏差的误差线。实施例8对实施例2、3、4和6中制得的含游离末端醛的肝素实体进行分析，以确定其绝对
分子量。Waters 2414RI检测器与Wyatt ASTRA 5. 3. 4. 10软件结合使用，来确定激光器的波长为660nm时在含0. 02% NaN3的IOOmM NaNO3中USP肝素的dn/dc。对已知的肝素浓度对RI检测器响应作图并计算斜率，确定USP肝素的dn/dc (折射率变化除以浓度变化)。用Wyatt-Dawn Helleos-II 18-角光散射检测器(Wyatt-DawnHelIeos-1118-angle light scattering detector)(怀亚特技术公司(Wyatt TechnologyCorp.))分析肝素实体，进行绝对分子量测量，不使用检测器1，2，3，4，17和18。在具有0. 02% NaN3流动相的IOOmM NaNO3中制备肝素实体的母液。从该母液得到以下浓度对实施例 3 和 4 的肝素实体为 0. 5mg/mL, I. Omg/mL, I. 5mg/mL, 2. Omg/mL 和 2. 5mg/mL。对于实施例 2 和 6 的肝素实体，制备浓度为 0. 25mg/mL, 0. 5mg/mL, I. Omg/mL, I. 5mg/mL 和 2. Omg/mL。各样品在注入光散射检测器之前，使用5毫升注射器用0. 02微米的注射器过滤器进行过滤。使用Zimm曲线和USP肝素(0. 126L/g)的dn/dc对所有样品进行批料数据分析。表I不出绝对分子量。表I.肝素实体的绝对分子量

1.一种医疗底物，其包括 通过至少一个肝素分子结合到底物上的肝素实体，所述结合的肝素实体对肝素酶敏感。
2.如权利要求I所述的医疗底物，其特征在于，所述底物选自聚こ烯、聚氨酷、硅酮、含聚酰胺的聚合物、聚丙烯、聚四氟こ烯、膨胀型聚四氟こ烯和生物相容性金属。
3.如权利要求2所述的医疗底物，其特征在于，所述底物是膨胀型聚四氟こ烯。
4.如权利要求2所述的医疗底物，其特征在于，所述生物相容性金属是镍钛诺。
5.如权利要求I所述的医疗底物，其特征在于，所述底物是医疗装置的组件。
6.如权利要求5所述的医疗底物，其特征在于，所述医疗装置选自移植物、人造血管、支架、支架-移植物、分叉状移植物、分叉状支架、分叉状支架-移植物、贴片、塞子、药物递送装置、导尿管、心脏导线、气囊和留置滤器。
7.如权利要求6所述的医疗底物，其特征在于，所述支架可以用于心脏、外周或神经应用。
8.如权利要求6所述的医疗底物，其特征在于，所述支架-移植物可以用于心脏、外周或神经应用。
9.如权利要求I所述的医疗底物，其特征在于，所述肝素实体包括至少ー个肝素分子和至少ー个核心分子。
10.如权利要求9所述的医疗底物，其特征在于，所述核心分子是环状、直线状、支链状、树枝状、Y形、T形或星形的。
11.如权利要求9所述的医疗底物，其特征在于，所述核心分子选自蛋白质、烃、氨基糖苷、多糖和聚合物。
12.如权利要求11所述的医疗底物，其特征在于，所述蛋白质选自白蛋白、粘菌素和聚赖氨酸。
13.如权利要求11所述的医疗底物，其特征在于，所述多糖选自环糊精、纤维素和壳聚糖。
14.如权利要求11所述的医疗底物，其特征在于，所述聚合物选自聚こニ醇(PEG)和四氟こ烯共聚物。
15.如权利要求I所述的医疗基材底物，其特征在于，所述肝素从牛或猪来源中得到。
16.如权利要求I所述的医疗底物，其特征在于，在肝素酶处理之后，在所述底物上将检测不到肝素或其片段。
17.如权利要求I所述的医疗底物，其特征在于，在肝素酶处理之后，在所述底物上检测到的肝素或其片段的水平与肝素酶处理之前相比明显更低。
18.如权利要求16所述的医疗底物，其特征在于，通过与肝素或其片段结合的标记物检测肝素或其片段。
19.如权利要求18所述的医疗底物，其特征在于，与肝素或其片段结合的所述标记物选自染料、多克隆抗体和蛋白质。
20.如权利要求19所述的医疗底物，其特征在于，所述染料是甲苯胺蓝。
21.如权利要求I所述的医疗底物，其特征在于，在肝素酶处理之后，可忽略量的甲苯胺蓝将与残余肝素或其片段结合，但在所述底物上目测检测不到。
22.如权利要求I所述的医疗底物，其特征在于，在肝素酶处理之后，可忽略量的甲苯胺蓝将与残余肝素或其片段结合，检测器读数约为背景水平或者与不含肝素实体的底物相比与背景没有明显差別。
23.如权利要求I所述的肝素实体，其特征在于，所述肝素实体通过至少一个肝素分子结合到底物上，所述结合的肝素分子通过端点连接与所述底物相连。
24.如权利要求I所述的肝素实体，其特征在于，所述肝素实体通过至少一个肝素分子结合到底物上，所述结合的肝素分子通过环状连接与所述底物相连。
25.如权利要求I所述的肝素实体，其特征在于，所述肝素实体通过至少一个肝素分子结合到底物上，所述结合的肝素分子通过端点醛与所述底物相连。
26.如权利要求I所述的肝素实体，其特征在于，所述肝素实体通过至少一个肝素分子结合到底物上，所述结合的肝素分子通过沿着所述肝素的长度的醛与所述底物相连。
27.ー种肝素实体，其包含 至少ー个肝素分子和至少ー个核心分子，当所述肝素实体通过至少一个肝素分子结合到底物上时，所述肝素实体对肝素酶敏感。
28.如权利要求27所述的肝素实体，其特征在于，所述底物选自聚こ烯、聚氨酷、硅酮、含聚酰胺的聚合物、聚丙烯、聚四氟こ烯、膨胀型聚四氟こ烯和生物相容性金属。
29.如权利要求27所述的肝素实体，其特征在于，所述底物是膨胀型聚四氟こ烯。
30.如权利要求28所述的肝素实体，其特征在于，所述生物相容性金属是镍钛诺。
31.如权利要求27所述的肝素实体，其特征在于，所述底物是医疗装置的组件。
32.如权利要求31所述的肝素实体，其特征在干，所述医疗装置选自移植物、人造血管、支架、支架-移植物、分叉状移植物、分叉状支架、分叉状支架-移植物、贴片、塞子、药物递送装置、导尿管、心脏导线、气囊和留置滤器。
33.如权利要求32所述的肝素实体，其特征在于，所述支架可以用于心脏、外周或神经应用。
34.如权利要求32所述的肝素实体，其特征在于，所述支架-移植物可以用于心脏、夕卜周或神经应用。
35.如权利要求27所述的肝素实体，其特征在于，所述核心分子是环状、直线状、支链状、树枝状、T形、Y形或星形的。
36.如权利要求27所述的肝素实体，其特征在于，所述核心分子选自蛋白质、多肽、烃、多糖、氨基糖苷和聚合物。
37.如权利要求36所述的肝素实体，其特征在于，所述蛋白质选自白蛋白、粘菌素和聚赖氨酸。
38.如权利要求36所述的肝素实体，其特征在于，所述多糖选自环糊精、纤维素和壳聚糖。
39.如权利要求36所述的肝素实体，其特征在于