专利名称：一种出芽短梗霉联产聚苹果酸和普鲁兰多糖的方法聚苹果酸和普鲁兰多糖都是出芽短梗霉的产物，都可由出芽短梗霉发酵产生。为了提高聚苹果酸或是普鲁兰多糖的产量，人们通过诱变选育或基因工程构建合成能力强的菌种，筛选和优化培养基配方，建立和优化发酵过程控制，改进和提高下游工程技术等方面来提高产品的产量产率和质量。聚苹果酸是以苹果酸为唯一单体聚合而成的高分子聚合物。目前国外有关微生物发酵聚苹果酸的专利非常少，已有的发酵生产或人工合成聚苹果酸(苹果酸聚合物)的专利有1995年公开的日本专利“生产苹果酸聚合微生物的培养方法(P 7308188A2)"[22], 1991年公开的日本专利“酶法生产L-苹果酸聚合物(JP4341189A2)”和1992年公开的日本专利“微生物合成L-苹果酸聚合物(JP4211385A2)[23]”。美国专利US4320753主要是合成聚苹果酸和相应内酯的衍生物@]。目前关于聚苹果酸应用的专利较多，如 US05811032、US05324519, US5702716等共30多项；国内有关聚苹果酸的专利仅有6项， 其中与聚苹果酸生物合成有关的专利3项(宋存江等[25] “同时获得副产物普鲁兰糖的聚苹果酸的制备方法”申请号200710058398 ；万印华等[26] “ β _聚苹果酸及其盐的制备方法”，申请号=200910078227. 7 ；乔长晟等[27] “一种酶法去除普鲁兰多糖提取获得 β-聚苹果酸的方法”，申请号200910068951. 1)，其余三项均为以聚苹果酸为原料的应用型专利。有关聚苹果酸合成的研究论文有中科院微生物研所刘双江研究员利用出芽短梗霉Aureobasidium pullulans发酵得到PMLA产物、乔长晟等发表的“Optimization of Poly(β -L-malic acid)production using Aureobasidium pullulans by response surface methodology”、南京工业大学王发表的“聚苹果酸的发酵培养条件优化”以及“响应面发优化β-聚苹果酸发酵培养基的研究”。普鲁兰多糖是由出芽短梗霉利用糖质化合物为基质进行好气发酵产生的一种粘性胞外多糖，早在1936年就人们被发现。一直到六十年代，人们才开始对其发酵、提取和应用等方面发明内容进行研究，在1978年日本林原公司实现工业化生产普鲁兰多糖。综上所述，现有的技术所做的只是针对聚苹果酸或是普鲁兰多糖一种产品进行的发酵，存在原料利用率低，能耗高，成本高等问题。
本发明提出了利用出芽短梗霉联产聚苹果酸和普鲁兰多糖的方法。本发明以出芽短梗霉为培养菌株，采用优化的联产培养基配方，包括接入菌种、向发酵液中流加营养物和调节剂，控制发酵液中出芽短梗霉细胞代谢产物生成条件。其中出芽短梗霉培养基中按每升发酵液的质量含量配制碳源6g/Lj8g/L，氮源0. 5g/L-5. 5g/L，无机盐0.01g/L-2g/L，所述碳源有葡萄糖、蔗糖、琥珀酸、柠檬酸，氮源有蛋白胨、酵母膏、硫酸铵、硝酸钠、氯化铵、碳酸铵、丁二酸铵，无机盐有氯化钾、硫酸盐和磷酸盐；发酵过程流加的营养物有葡萄糖，蔗糖，蛋白胨，苹果酸，添加的调节剂为碳酸钙， 调节发酵液PH3-8之间，发酵温度在20-30°C，发酵周期4_7天，得到联产聚苹果酸和普鲁兰多糖的发酵液。发酵罐培养基温度降至后接入菌种，按3%的接种量接入发酵罐，搅拌转速在200rpm，通风比为0. 5VVM，控制温度左右开始发酵，从发酵开始到72小时温度控制在-31°C，从M小时开始流加蔗糖，控制发酵液中葡萄糖量在35g/L，72小时以后控制温度在25°C左右，并且继续流加蔗糖控制发酵液中葡萄糖含量15g/L，直至发酵136小时停止加蔗糖，发酵直至发酵液中葡萄糖含量降至0后继续发酵8小时，发酵过程中pH控制 5-7. 2之间，发酵166小时，普鲁兰多糖总量为52g/L以上，聚苹果酸总量为37g/L以上。金属离子Mn2+、Fe2 Zn2+ 各在 0. OOlg/L-O. 4g/L ；金属离子以硫酸盐或氯化盐的形式加入，包括Μη2+、 ^2+、&ι2+。上述磷酸盐包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾。上述菌种包括出芽短梗霉或通过诱变和基因工程改造过的工程菌。本发明中使用菌种见出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)TKPM00006, CGMCC3337，见天津科技大学申请专利，申请号为CN200910071018，发明名称为一种大量产生β -聚苹果酸的诱变菌株出芽短梗霉ΤΚΡΜ00006及其培养方法，后接入菌种，按6% (种子液与发酵液的体积比)的接种量接入发酵罐，搅拌转速在 400rpm，通风比为1VVM，控制温度左右开始发酵，从发酵开始到72小时温度控制在 280C -31°C，从M小时开始流加蔗糖，控制发酵液中葡萄糖量在40g/L，72小时以后控制温度在25°C左右，并且继续流加蔗糖控制发酵液中葡萄糖含量20g/L，直至发酵136小时停止加蔗糖，发酵直至发酵液中葡萄糖含量降至0后继续发酵8小时，发酵过程中pH控制5-6 之间，直至发酵结束大概166小时左右，生物量达到94g/L (干重)，普鲁兰多糖总量为73g/ L，聚苹果酸总量为51/L。实施例3 使用30L通用式发酵罐配置18L发酵培养基，培养基配方蔗糖200g/L，蛋白胨 50g/L,碳酸钙40g/L,氯化钾2g/L，硝酸钠3g/L，硫酸镁0. 6g/L，磷酸二氢钾4g/L，Mn2+、 Fe2 Zn2+各在0. 4g/L，按常规灭菌方式在121 °C下实罐灭菌20min，待培养基温度降至后接入菌种，按10% (种子液与发酵液的体积比)的接种量接入发酵罐，搅拌转速在 600rpm，通风比为1. 5VVM，控制温度左右开始发酵，从发酵开始到72小时温度控制在 280C -31°C，从M小时开始流加蔗糖，控制发酵液中葡萄糖量在50g/L，72小时以后控制温度在25°C左右，并且继续流加蔗糖控制发酵液中葡萄糖含量30g/L，直至发酵136小时停止加蔗糖，发酵直至发酵液中葡萄糖含量降至O后继续发酵8小时，发酵过程中pH控制6-7之间，直至发酵结束大概166小时左右，生物量达到113g/L(干重)，普鲁兰多糖总量为90g/ L，聚苹果酸总量为65g/L。

本发明公开了一种出芽短梗霉联产聚苹果酸和普鲁兰多糖的方法。本发明涉及一种通过出芽短梗霉细胞生产聚苹果酸和普鲁兰多糖的方法，属于生物发酵工程技术领域。一种出芽短梗霉联产聚苹果酸和普鲁兰多糖的方法，包括如下步骤，发酵罐培养基温度降至28℃后接入菌种，按3％的接种量接入发酵罐，搅拌转速在200rpm，通风比为0.5VVM，控制温度28℃-31℃左右开始发酵，从24小时开始流加蔗糖，控制发酵液中葡萄糖量在35g/L，72小时以后控制温度在25℃左右，继续流加蔗糖控制发酵液中葡萄糖含量15g/L，发酵136小时停止加蔗糖，发酵液中葡萄糖含量降至0后继续发酵8小时，发酵过程中pH控制5-7.2之间，发酵166小时。提高原料利用率，节约能源，降低了成本。

公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日