专利名称：提高聚苹果酸产量的培养基及其应用和方法聚苹果酸(Polymalic acid，PMLA)以L-苹果酸为唯一单体在体内聚合而成，是一种新型完全生物降解性高分子材料，具有高度的生物相容性、生物降解性和生物可吸收性等优点。由于PMLA在侧链上具有悬挂羧基，容易与其他官能团反应而制备PMLA衍生物，与聚乳酸等材料相比，PMLA在体内易代谢性、易修饰性等方面表现出更好的优势，在药物制齐U、食品包装、农业等方面应用前景广阔。聚苹果酸还可以水解为单体，即L-苹果酸，又名2-羟基丁二酸，是重要的有机酸和生物炼制平台化合物。L-苹果酸具有天然果实的酸味特 征，L-苹果酸的酸感强度约相当于柠檬酸的1.2倍，味觉自然丰厚，产热量更低，可以替代柠檬酸作为食品添加剂加以应用。聚苹果酸的可以由出芽短梗霉(Aureobasidium pulIulans)以淀粉或葡萄糖为原料发酵生产聚苹果酸，该过程是以三羧酸循环(TCA)代谢产生的苹果酸经聚苹果酸聚合酶聚合而成聚苹果酸，聚合过程需要ATP的参与。而细胞内源ATP产生达到饱和条件下，无法继续增加，因此在一定程度上影响了聚苹果酸的得率。因此急需一种提高聚苹果酸产量的培养基，能够大幅度提高聚苹果酸的产量。
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种提高聚苹果酸产量的培养基，在培养基中通过添加外源能源供体，提高细胞内ATP的供应量，从而提高聚苹果酸的产量。为了实现上述为目的，本发明的技术方案为提高聚苹果酸产量的培养基，所述培养基是含有1-20 g/L的柠檬酸或柠檬酸盐。优选的，所述培养基还包括葡萄糖50-200g/L、氮源l_5g/L、KH2P04 O. 005-0. 3g/L、ZnSO4 O. 005-0. 3g/L、MgSO4 O. 005-0. 3g/L、玉米浆 0. 05_3g/L 和 CaCO3 10-50 g/L。更优选的，所述培养基由葡萄糖100-150g/L、氮源2_4g/L、KH2PO4 O. 05-0. 2g/L、ZnSO4 O. 05-0. 2g/L、MgS04 O. 05-0. 2g/L、玉米浆 0. 5_2g/L、柠檬酸或柠檬酸盐 5_15g/L 和CaCO3 20-40 g/L 组成。最优选的，所述氮源为硫酸铵、氯化铵、硝酸钾或硝酸钠；所述柠檬酸盐为柠檬酸钠。本发明中柠檬酸可以用分析级柠檬酸，为降低生产成本也可以为工业生产柠檬酸中柠檬酸发酵液经结晶剩余的液体，即柠檬酸母液。柠檬酸母液为柠檬酸发酵液经钙盐法提取工艺，柠檬酸结晶后剩余的液体，柠檬酸母液中含柠檬酸60wt%，以及残糖、蛋白、色素及 Ca2+、Fe3+、S042_ 等离子。本发明目的之二在于提供培养基的应用，技术方案为所述培养基在利用出芽短梗霉{Aureobasidium pulIulans )生产聚苹果酸中的应用。本发明的目的之三在于提供利用培养基的方法，技术方案为 利用所述培养基生产聚苹果酸的方法，包括以下步骤 将出芽短梗霉的活化种子液接种于所述提高聚苹果酸产量的培养基中，在温度为23-30°C震荡培养96小时以上。优选的，将所述活化种子液与所述培养基按体积比为1:10-20接种，在温度为25°C、转速为180-1000 rpm条件下培养96-200小时。更优选的，所述活化的种子液的制备方法是将出芽短梗霉接种于种子培养基，在温度为23-30°C震荡培养至0D_= O. 4，得活化种子液；所述种子培养基为葡萄糖40_100g/ L^NH4NO31-5 g/L、KH2PO4 O. 005-0. 3g/L、ZnSO4 O. 005-0· 3g/L、MgSO4 0· 005-0· 3g/L、玉米浆0.05-3 g/L和 CaCO3 10-50 g/L。最优选的，所述出芽短梗霉为出芽短梗霉FMT1801 CCTCC NO: M2012223。本发明有益效果在于本发明公开的提高聚苹果酸产量的培养基，由于含有适量的柠檬酸或柠檬酸盐能够为出芽短梗霉提供外源能源供体，能够提高出芽短梗霉胞内的ATP，因此能够有效提高聚苹果酸的产量，打破了聚苹果酸合成中的瓶颈；同时利用出芽短梗霉发酵的终产物为聚苹果酸，解决了传统路线发酵直接产生苹果酸会抑制菌种产酸能力的问题，因而能够获得高浓度的聚苹果酸发酵液，发酵液中聚苹果酸最高达48. 48g/L。本发明使用的出芽短梗霉FMT1801生产的聚苹果酸还能直接分泌到胞外，用体积分数为95%的乙醇溶液即可沉淀，容易提取，工艺步骤简单，适合大规模工业生产，获得的聚苹果酸可通过酸水解获得苹果酸产品。本发明中朽1檬酸可以由朽1檬酸母液提供，我国是朽1檬酸发酵生产的世界第一大国。采用钙盐法或色谱法从发酵液中提取柠檬酸，提取后柠檬酸母液中含有大量都会产生大量的柠檬酸，直接丢弃造成资源浪费，如果将其回收继续提取，容易导致产品收率下降，并影响产品质量等问题。因此本发明将柠檬酸母液添加，提高聚苹果酸产量，同时解决柠檬酸母液资源浪费等问题。菌种保藏 本发明中出芽短梗霉(Jtfreo AaWia pul Iulans^) FMT1801是从出芽短梗抱NRRLY2311经过自然分离获得能高效利用蔗糖为碳源产生聚苹果酸的菌株，送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO: M2012223，地址位于中国武汉武汉大学，保藏日期为2012年6月12日，分类命名为出芽短梗霉Uareo如Wiws pullulans ) FMT1801。
生产聚苹果酸的方法，具体步骤为a.种子活化
将出芽短梗霉FMT1801 CCTCC NO: M2012223接种于种子培养基中，接种量按照出芽短梗霉FMT1801种子液与种子培养基的体积比为1:200，种子培养基配方为葡萄糖40 g/L、硝酸铵 O. 005 g/L、KH2PO4 O. 005g/L、ZnSO4 O. 005g/L、MgSO4 O. 005g/L、玉米浆 O. 5g/L 和CaCO3 10g/L，在温度为23°C、转速为250 rpm条件下震荡培养72小时，得活化种子液。b.发酵
将步骤a所得活化种子液接种于含3L发酵培养基的5L发酵罐中，接种量按照活化种子液与发酵培养基的体积比为1:15，发酵培养基配方为葡萄糖50 g/L、氯化铵I g/L、KH2PO4 O. 005g/L、ZnSO4 O. 005g/L、MgSO4 O. 005g/L、玉米浆 O. 005g/L、柠檬酸 20g/ L 和CaCO3 10 g/L，在温度为28°C、转速为500 rpm，通气量为I: O. 8条件下培养200小时，培养液用板框过滤机过滤，收集滤液，得发酵液。c.聚苹果酸提取
将步骤b所得发酵液中加入相当于发酵液体积5倍的体积分数为95%的乙醇溶液，40C冷冻24小时，转速为4500rpm离心20分钟，收集沉淀，得到聚苹果酸。本实施例中，聚苹果酸产量为38.76 g/L，获得的聚苹果酸用体积分数为95%的乙醇洗涤3次后，将沉淀溶解在浓度为2 M硫酸中，在80°C条件下水解12小时，得到苹果酸，苹果酸产量为43. 97g/L。实施例2
生产聚苹果酸的方法，具体步骤为 a.种子活化
将出芽短梗霉FMT1801 CCTCC NO: M 2012223接种于种子培养基中，接种量按照出芽短梗霉FMT1801种子液与种子培养基的体积比为1:800，种子培养基配方为葡萄糖100 g/L、硝酸铵 5 g/L,KH2PO4 O. 3g/L,ZnSO4 O. 3g/L, MgSO4 O. 3g/L、玉米浆 3 g/L、柠檬酸 15 g/L和CaCO3 50g/L在温度为28°C、转速为300 rpm条件下震荡培养36小时，得活化种子液。b.发酵
将步骤a所得活化种子液接种于含50mL发酵培养基的摇瓶中，接种量按照活化种子液与发酵培养基的体积比为1:10，发酵培养基配方为葡萄糖200 g/L、硝酸铵5 g/L、KH2P04
O.3g/L,ZnSO4 0.3g/L、MgS04 O. 3g/L、玉米浆 3g/L、柠檬酸钠 12 g/L 和 CaCO3 50 g/L，在温度为30°C、转速为300rpm条件下震荡培养150小时，培养液用板框过滤机过滤，收集滤液，得发酵液。c.聚苹果酸提取
将步骤b所得发酵液中加入相当于发酵液体积4倍的体积分数为95%的乙醇溶液，40C冷冻36小时，转速为5000rpm离心5分钟，收集沉淀，得到聚苹果酸。本实施例中，聚苹果酸产量为40. 67g/L，获得的聚苹果酸用体积分数为95%的乙醇洗涤3次后，将沉淀溶解在浓度为2 M硫酸中，在80°C条件下水解12小时，得到苹果酸，苹果酸产量为46. 14 g/L。实施例3
生产聚苹果酸的方法，具体步骤为 a.种子活化将出芽短梗霉FMT1801 CCTCC NO: M2012223接种于种子培养基中，接种量按照出芽短梗霉FMT1801种子液与种子培养基的体积比为1:500，种子培养基配方为葡萄糖80g/L、硝酸铵 4 g/L,KH2PO4 O. 2g/L,ZnSO4 O. 2g/L, MgSO4 O. 2g/L、玉米浆 2g/L 和 CaCO3 40 g/L 在温度为25°C、转速为180rpm条件下震荡培养96小时，得活化种子液。b.发酵
将步骤a所得活化种子液接种于含50mL发酵培养基的摇瓶中，接种量按照活化种子液与发酵培养基的体积比为1:10，发酵培养基配方为葡萄糖150g/L、硝酸钠4 g/L、KH2PO4O. 2g/L, ZnSO4 O. 2g/L, MgSO4 O. 2g/L、玉米浆 2g/L、柠檬酸母液 20 g/L 和 CaCO3 40 g/L,在温度为23°C、转速为180 rpm条件下震荡培养96小时，培养液用板框过滤机过滤，收集滤液，得发酵液。c.聚苹果酸提取
将步骤b所得发酵液中加入相当于发酵液体积3倍的体积分数为95%的乙醇溶液，40C·冷冻12小时，转速为3500rpm离心45分钟，收集沉淀，得到聚苹果酸。·本实施例中，聚苹果酸产量为46. 54g/L，获得的聚苹果酸用体积分数为95%的乙醇洗涤3次后，将沉淀溶解在浓度为2 M硫酸中，在80°C条件下水解12小时，得到苹果酸，苹果酸产量为52. 79g/L。本实施例中，柠檬酸母液为柠檬酸发酵液经钙盐法提取工艺，柠檬酸结晶后剩余的液体，柠檬酸母液中含柠檬酸60wt%，以及残糖、蛋白、色素及Ca2+、Fe3+、S042-等离子。实施例4
生产聚苹果酸的方法，具体步骤为 a.种子活化
将出芽短梗霉FMT1801 CCTCC NO: M2012223接种于种子培养基中，接种量按照出芽短梗霉FMT1801种子液与种子培养基的体积比为1:100，种子培养基配方为葡萄糖60g/L、硝酸铵 2 g/L、KH2PO4 O. 05g/L、ZnSO4 O. 05g/L, MgSO4 O. 05g/L、玉米浆 O. 05g/L 和 CaCO3 20g/L在温度为25°C、转速为250 rpm条件下震荡培养48小时，得活化种子液。b.发酵
将步骤a所得活化种子液接种于含50mL发酵培养基的摇瓶中，接种量按照活化种子液与发酵培养基的体积比为1:20，发酵培养基配方为葡萄糖100 g/L、硝酸钾2 g/L、KH2P04
O.05g/L, ZnSO4 O. 05g/L,MgSO4 O. 05g/L、玉米浆 O. 5g/L、柠檬酸 I g/L 和 CaC0320 g/L，在温度为25°C、转速为220 rpm条件下震荡培养144小时，培养液用板框过滤机过滤，收集滤液，得发酵液。c.聚苹果酸提取
将步骤b所得发酵液中加入相当于发酵液体积2倍的体积分数为95%的乙醇溶液，40C冷冻24小时，转速为4000rpm离心30分钟，收集沉淀，得到聚苹果酸。本实施例中，聚苹果酸产量为41. 7g/L，获得的聚苹果酸用体积分数为95%的乙醇洗涤3次后，将沉淀溶解在浓度为2 M硫酸中，在80°C条件下水解12小时，得到苹果酸，苹果酸产量为47. 3g/L。实施例5
生产聚苹果酸的方法，具体步骤为a.种子活化
将出芽短梗霉FMT1801 CCTCC NO: M2012223接种于种子培养基中，接种量按照出芽短梗霉FMT1801种子液与种子培养基的体积比为1:1000，种子培养基配方为葡萄糖70 g/L、硝酸铵 3 g/L、KH2PO4 O. I g/L, ZnSO4 O. 15g/L，MgSO4 O. lg/L、玉米浆 lg/L 和 CaCO3 30 g/L在温度为25°C、转速为220 rpm条件下震荡培养48小时，得活化种子液。b.发酵
将步骤a所得活化种子液接种于含5L发酵培养基的IOL发酵罐中，接种量按照活化种子液与发酵培养基的体积比为1:10，发酵培养基配方为葡萄糖120 g/L、硝酸钾3 g/L、KH2PO4 O. I g/L, ZnSO4 O. 15g/L、MgS04 O. lg/L、玉米浆 lg/L、柠檬酸钠 lg/ L 和 CaCO3 30 g/L，在温度为25°C、转速为1000 rpm，通气量为I: I. 6条件下培养96小时，培养液用板框过滤机过滤，收集滤液，得发酵液。c.聚苹果酸提取
将步骤b所得发酵液中加入相当于发酵液体积2倍的体积分数为95%的乙醇溶液，40C冷冻24小时，在3000rpm条件下离心20分钟，收集沉淀，得到聚苹果酸。本实施例中，聚苹果酸产量为48. 48g/L，获得的聚苹果酸用体积分数为95%的乙醇洗涤3次后，将沉淀溶解在浓度为2 M硫酸中，在80°C条件下水解12小时，得到苹果酸，苹果酸产量为55g/L。实施例6
生产聚苹果酸的方法，具体步骤为
a.种子活化
将出芽短梗霉FMT1801 CCTCC NO: M2012223接种于种子培养基中，接种量按照出芽短梗霉FMT1801种子液与种子培养基的体积比为1:100，种子培养基配方为葡萄糖60g/L、硝酸铵 2 g/L、KH2PO4 O. 05g/L、ZnSO4 O. 05g/L, MgSO4 O. 05g/L、玉米浆 O. 05g/L 和 CaCO3 20g/L在温度为25°C、转速为250 rpm条件下震荡培养48小时，得活化种子液。b.发酵
将步骤a所得活化种子液接种于含50mL发酵培养基的摇瓶中，接种量按照活化种子液与发酵培养基的体积比为1:15，发酵培养基配方为葡萄糖100 g/L、硝酸钾2 g/L、KH2P04
O.05g/L,ZnSO4 O. 05g/L,MgSO4 O. 05g/L、玉米浆 O. 5g/L 和 CaC0320 g/L，在温度为 25°C、转速为220 rpm条件下震荡培养144小时，培养液用板框过滤机过滤，收集滤液,得发酵液。c.聚苹果酸提取
将步骤b所得发酵液中加入相当于发酵液体积2倍的体积分数为95%的乙醇溶液，40C冷冻24小时，转速为4000rpm离心30分钟，收集沉淀，得到聚苹果酸。本实施例为对比实施例，聚苹果酸产量为30. 86 g/L，获得的聚苹果酸用体积分数为95%的乙醇洗涤3次后，将沉淀溶解在浓度为2 M硫酸中，在80°C条件下水解12小时，得到苹果酸，苹果酸产量为35.01 g/L。由实施例f 5与实施例6相比聚苹果酸的产量均有提高，其中实施例5提高最为明显，提高了 57. 1%，其次为实施例3提高了 50. 8%，实施例I、实施例2和实施例4分别提高了 25. 6%、31. 8%和48. 5%，其机理为添加的柠檬酸或柠檬酸盐能够提高出芽短梗霉胞内的ATP，打破聚苹果酸合成的瓶颈，提高聚苹果酸的产量。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述， 但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。


本发明公开了提高聚苹果酸产量的培养基，含有1-20g/L的柠檬酸或柠檬酸盐，能够为芽短梗霉在发酵过程中提供外源能源供体，提高细胞内ATP的供应量，从而提高聚苹果酸的产量，最高能提高57.1%；本发明公开的培养基能够用于出芽短梗霉发酵产生聚苹果酸，具有很好的经济效益。