一种开裂铁皮石斛蒴果种胚的无菌去毒培养方法[0002]铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是传统名贵珍稀中药材,具有益胃生津、滋阴清热等独特功效，常用与热病伤津、病后虚热等多等症状。现代药理研究表明铁皮石斛在治疗糖尿病、免疫调节、抗肿瘤等方面有很好的疗效。铁皮石斛药用价值、保健价值高，然而因野生铁皮石斛自然坐果率极低，加之其种子自然条件下萌发率极低，其野生资源己非常稀少，现在国内对于铁皮石斛的人工培育已经取得一定进展，生产中人工培育主要通过铁皮石斛的蒴果进行增值培养。[0003]铁皮石斛一般于4月中下旬开始开花，5月中下旬为盛花期。授粉成功后的蒴果进过120d的生长发育，蒴果变成黄绿色，基本成熟。随着成熟度的增加，水分的散失，蒴果会自动开裂散出黄色种胚。目前蒴果的保存时间只能达到30d左右。现阶段对于开裂散落出的种胚无法进行无菌去毒播种，例如专利号200310112012.5,200810104220.3、200910036502.9,201110203343.4等进行无菌播种去毒处理时所采用的蒴果均为未开裂的铁皮石斛蒴果。由于铁皮石斛坐 果率不高，加之蒴果使用周期短，因此石斛蒴果的有无已经成为现阶段制约石斛组培行业可持续发展的决定性因素。
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种开裂铁皮石斛蒴果种胚的无菌去毒培养方法，此方法简单实用，操作性强，利用率高、萌发率高。解决了开裂石斛蒴果难以利用的行业难题，大大延长了石斛种胚的播种时限，为石斛组培工厂的顺利运转提供了保障。[0005]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种开裂铁皮石斛蒴果种胚的无菌培养方法，其特征在于包括以下步骤:[0006]I)将开裂的铁皮石斛蒴果进行表面清理；[0007]2)将表面清理过的开裂果荚或种胚进行去毒处理:
[0008]将种胚置于超净工作台中紫外照射l(Tl5min，然后在无菌条件下将种胚转移入无菌西林瓶中，之后用质量百分浓度65~75%的酒精浸泡清洗3(T60s，然后用无菌滤网将种胚滤出，再用吸有质量百分浓度0.5^1.5%安替福民的无菌吸管将种胚用转移入无菌西林瓶中，浸没消毒l(Tl5min后将种胚用无菌滤网滤出，然后用无菌水将种胚转移入无菌西林瓶中，用无菌水反复冲洗3飞次；
[0009]3)最后用无菌水以微滴方式将种胚转移入播种培养基中进行无菌播种培养。
[0010]作为优选，所述步骤2)中酒精的浓度为质量百分浓度70%，酒精浸泡过程中需翻转混匀摇动。
[0011]作为优选，所述步骤2)中所述无菌滤网采用160-200目不锈钢无菌滤网。[0012]再优选，所述步骤2)中的安替福民的质量百分浓度为1%。
[0013]最后，所述步骤3)的具体过程为:用无菌水以微滴方式将去毒处理过的种胚转移入播种培养基中，:1/3~1/2MS液体培养基+萘乙酸(NAA) 0.5^1.0mg/L+6-苄氨基腺嘌呤(BA) 1.0-2.0mg/L+活性炭(AC)0.5^1.5g/L(技术含义是液体培养基中大含量元素浓度减到1/3~1/2，并添加下面物质，使液体培养基中萘乙酸浓度0.5^1.0mg/L, 6-苄氨基腺嘌呤浓度1.0-2.0mg/L，活性炭浓度0.5~1.5g/L)，播种后暗培养3_5d后，置于光照100(Tl500LUX，温度25±1°C，光照时间12-14h/d的条件下进行培养。
[0014]与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明的培养方法简单实用，操作性强，种胚利用率高、萌发率高，有效地解决了开裂石斛蒴果难以利用的行业难题，大大延长了石斛种胚的播种时限，为石斛组培工厂的顺利运转提供了保障。

[0015]以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0016]实施例一:
[0017]将开裂的铁皮石斛蒴果进行表面清理。将表面清理过的开裂果荚或种胚粉置于超净工作台中紫外照射lOmin。超净工作台技术含义是工作台的洁净度达到百级(目前生物接种设备中的最高级别)，即每立方米内的菌落数为百个，一般室内的洁净度为百万级即每立方空间菌落数为百万个。然后在无菌条件下将种胚转移入无菌西林瓶中，之后用70%的酒精浸泡清洗30s，然后通过160目不锈钢无菌滤网将种胚滤出，再用吸有1%安替福民的无菌吸管将种胚用转移入无菌西林瓶中，浸没消毒lOmin，将种胚用160目不锈钢无菌滤网滤出，然后用无菌水转移入无菌西林瓶中，用无菌水反复冲洗3次。用无菌水以微滴方式将去毒处理过的种胚转移入播种培养基中，播种培养基为:1/2MS+NAA0.5mg/L+BAl.0mg/L+AC0.5g/L，播种后按培养3d后，置于光照1000-1500LUX，温度25 土 1°C，光照时间12h/d的条件下进行培养，培养30天后，发现萌发率为98%，污染率为1.0%。
`[0018]实施例二:
[0019]将表面清理过的开裂果荚或种胚粉置于超净工作台中紫外照射12min。然后在无菌条件下将种胚转移入无菌西林瓶中，之后用70%的酒精浸泡清洗45s，然后通过180目不锈钢无菌滤网将种胚滤出，再用吸有1%安替福民的无菌吸管将种胚用转移入无菌西林瓶中，浸没消毒12min，将种胚用180目不锈钢无菌滤网滤出，然后用无菌水转移入无菌西林瓶中，用无菌水反复冲洗4次。用无菌水以微滴方式将去毒处理过的种胚转移入播种培养基中，播种培养基为:1/2MS+NAA0.8mg/L+BAl.5mg/L+ACl.0g/L,播种后按培养4d后，置于光照1000-1500LUX，温度25±1°C，光照时间13h/d的条件下进行培养，培养30天后，发现萌发率为96%，污染率为0.8%。
[0020]实施例三:
[0021]将表面清理过的开裂果荚或种胚粉置于超净工作台中紫外照射15min。然后在无菌条件下将种胚转移入无菌西林瓶中，之后用70%的酒精浸泡清洗60s，然后通过200目不锈钢无菌滤网将种胚滤出，再用吸有1%安替福民的无菌吸管将种胚用转移入无菌西林瓶中，浸没消毒15min，将种胚用200目不锈钢无菌滤网滤出，然后用无菌水转移入无菌西林瓶中，用无菌水反复冲洗5次。用无菌水以微滴方式将去毒处理过的种胚转移入播种培养基中，播种培养基为:1/2MS+NAA1.0mg/L+BA2.0mg/L+ACl.5g/L，播种后按培养5d后，置于光照1000-1500LUX，温度25土1°C，光照时间14h/d的条件下进行培养，培养30天后，统计发现萌发率为92%，污染率为0.5%。`