专利名称：人肝脏祖先的制作方法 成熟肝脏基本的结构和功能单位是腺泡，其横断面的组织形式象围绕两个独特的血管床的轮子3-7套肝三联(每套有一个门小静脉、肝小动脉和一个胆管)位于外周、中央静脉位于中心。肝脏细胞彼此组织构成细胞板，在其两侧排列有帘式内皮膜，形成一系列的与门脉管和中央血管系统相邻近的窦状隙。最近的数据表明肝闰管(Canals of Herring)，即位于每个肝三联周围的小管，在整个区带I产生细小的小管，它们延伸并切入肝板，形成与瓶刷子相似的结构式样。(Theise，N.1999，肝脏学(Hepatology)，301425-1433)。一个称作迪塞间隙(Space of Disse)的狭窄空间，一直沿着窦状隙将内皮膜与肝脏细胞分隔开。作为这种组织结构的结果，肝脏细胞具有两个基部区(其中的每一个面向一个窦状隙)和一个顶部区。基部区接触血液并参与血浆成分的吸收和分泌，而顶部区则形成专门分泌胆汁盐的胆汁小管并通过交联网络与胆管相连。血液从门小静脉和肝小动脉流过窦状隙到达末端肝小静脉和中央静脉。基于这种循环形式，将腺泡分为三个区带区带1，门周区；区带2，腺泡中区；和区带3，中心周围区。增殖潜能、形态规范、(染色体)倍性以及大多数肝脏特异性基因与区带定位相互关联(Gebhardt，R等人，1988，FEBS Lett.，24189-93；Gumucio，J.J.，1989，Springer International，Madrid；Traber，P.等人，1988，胃肠学(Gastroenterology)，951130-43)。跨腺泡的血液成分(包括氧气)浓度梯度以及沿着从肝三联到中央静脉的血流方向承担这种区带化的一部分，例如，糖酵解和糖异生的彼此区室化。然而，门周区带形成中的间隙连结蛋白质(连结蛋白26)以及中心周围区带形成中的谷氨酰胺合成酶(这里仅列举两个例子)对这样的梯度并不敏感，而更代表了大多数组织特异性基因，并看来好象取决于微环境中对细胞或非血流变量而言为内源性的因子。除了肝脏细胞、胆管上皮细胞(胆管细胞)和内皮细胞外，位于门脉和中央静脉区段间的区域含有其它细胞类型，诸如Ito细胞和库佛细胞(Kupffer cell)。这些细胞在肝脏的疾病状态中扮演突出的角色，特别是在炎症和纤维化中，但是表面看来，它们对正常器官主要的自身稳定功能的贡献并不大。肝脏是盲肠囊(形成自前肠尾和原始横隔，它们内脏间充质的一部分)汇聚发育的结果。肝脏细胞的形成，很可能是通过成纤维细胞生长因子，始于内胚层上皮与生心中胚层的相互作用之后。接着，注定为肝脏细胞的细胞增殖并以索状方式穿入原始横隔的间充质，形成肝脏原基。上皮-间充质的直接相互作用在肝脏的这些早期发育阶段中是至关重要的，并决定哪些细胞将分别成为肝脏细胞或胆管细胞和帘式内皮膜。间充质特异性基因hlx和jumonji的突变将阻断肝脏发育，从而表明来自该组织的贡献的重要性。在肝脏发育的早期，肝脏含有原始的肝脏细胞簇(与缺乏基底膜的连续内皮和丰富的造血细胞相邻接)。由于内皮细胞转化为不连续的帘式内皮膜，所以脉管系统，特别是门脉管系统随着基底膜的产生变得更加发达。门小间隙可以提供胆管发育的触发器，并且由于它包围着门小静脉、肝小动脉和胆管，所以形成了肝三联。很可能是为了响应诸如C-CAM105、Agp 110、E-钙粘蛋白和连结蛋白这样的组织-形成分子在数量和分布上的变化，未成熟肝脏细胞快速增殖并形成实质板，同时伴有绝大部分(但不是全部)造血细胞再定位于骨髓。最近的研究提示某些造血细胞祖先存留于休眠的成年啮齿类的肝脏中，并且已从成年人类和鼠的肝脏中分离出造血干细胞(Crosbie，O.M.等人，1999，肝脏学(Hepatology)，291193-8)。在啮齿类中成熟的物理组构是在出生后的几周内完成的，在人类中是在头几年。代谢的区带化是根据不同的酶采取多少有些不同的安排而建立的，但在出生后的时期代谢的区带化变得明显起来。干细胞和定向祖先干细胞被定义为自我复制、多能，即产生的子代细胞多种命运的、能够广泛地发育，并能够再构建一种或多种组织的原始细胞。大多数关于干细胞的文献，源自有关胚胎方面的文献或者源自关于造血、表皮或肠组织方面的文献。最近，对定义进行了修改，以识别特定种类的干细胞。将具有参与所有细胞类型发育潜能的那些细胞称为全能干细胞，其中包括受精卵和上至8细胞阶段(桑椹胚)的正常胚胎细胞。胚胎干细胞也叫做“ES”细胞，包括源自胚泡中全能的正常细胞之永久细胞群，首先报道它们在二十世纪八十年代早期。ES细胞系可在体外培养并保持全能性。如果将ES细胞引入到无免疫应答宿主中的任何部位，但不包括子宫，将导致肿瘤发生，形成畸胎癌。但是，当将它们注射回到正常的胚泡中时，它们能够恢复胚胎发育并参与形成正常的但却是嵌合的小鼠。尽管已从多种物种(小鼠、大鼠、猪等)建立了ES细胞系，但只有小鼠系统，通过将培养的修饰细胞与胚泡合并、接着将该胚泡植入到假孕宿主中，已被常规地用于产生具有新表型(敲除、转基因)的动物。可以将显示ES细胞的多种特性的胚胎生殖(EG)细胞系在体外直接从原基生殖细胞群中分离出来。与ES细胞一样，当将EG细胞注射到无免疫应答的小鼠中时，EG细胞形成畸胎癌；当将EG细胞注射到胚泡中时，其对嵌合体包括生殖细胞系的形成作出了贡献。认定干细胞是多能细胞，它的遗传潜能被限制于有限种类的细胞类型、但具有广泛的生长潜能。越来越多的证据诸如来自端粒酶领域的证据提示认定干细胞并不能自我复制，也就是它们的后代具有比其亲代更小的生长潜能。认定干细胞通过将它们的遗传潜能限制在单一种命运(例如肝细胞)，产生失去多能性的子代细胞，并称其为定向祖先。在肝谱系中，有定向肝细胞祖先和定向胆管细胞祖先。最近，大量公布的实验报道了可从人的胚胎建立人ES细胞培养物。有人建议可以将这些人ES细胞注射到组织中，希望它们能够再造损坏的器官和组织。由于发现当将ES和EG细胞注射到除子宫(见上)以外的部位时形成肿瘤，所以计划将人ES细胞接种到患者中并不现实，并对患者带来产生肿瘤的严重可能性。为了克服这种僵局，某些研究小组正在努力进行这样的计划，即在限定的微环境条件下分化ES细胞，使其成为能够安全地接种到患者中的认定干细胞。例如，在产生造血祖先方面已有一些成功的措施。但是，如果将培养物接种到患者中，仍然担心培养物中残留的ES可能带来发生肿瘤的危险性。总之，在发育生物学研究将胚胎发育过程中控制决定细胞命运的谜底揭示出来之前，ES细胞仍将作为一种实验手段，而几乎没有希望用于细胞或基因治疗的临床项目。围绕肝脏干细胞的争论在肝脏的细胞生物学领域，在成年的正常肝脏中是否存在干细胞是有巨大争议的论题。以下总结了在该领域中相互竞争的几种流行的模型。斜体字表示在不同模型中的关键概念。
本领域的一些专家相信，肝脏干细胞仅存在于胚胎组织，而在成年肝脏中没有干细胞，而且所有成熟的肝脏细胞平等地参与肝脏的再生过程(法博Farber，E.，1992，见多种细胞类型在肝癌发生中的作用(The Role of Cell Types inHepatocarcinogenesis.)，S.A.E.编辑，Academic Press，New York)。法博Farber模型认为所有成熟的实质细胞在表型上是共相等的，并且在肝脏中，只是由于微环境造成了已知的生长潜能和基因表达的不均一性。Farber提出在致癌条件下，成年的实质细胞逆分化并变为肿瘤细胞。该模型统治肝脏肿瘤发生领域几十年并在肝脏再生研究中仍具有影响。
另一些专家相信所有的肝脏细胞都是干细胞(肯尼迪Kennedy，S.等人，1995，肝脏学，22160-8；Michalopoulos，G.K.等人，1997，科学(Science)，27660-6)。这些研究者相信所有的实质细胞是相互对等的，是高度可塑的，其基因表达仅由微环境支配。在适当的致癌条件下，设想成熟的实质细胞都会变为能够随后转变为肿瘤细胞的干细胞。
沉默干细胞模型是基于Willson和Leduc(Willson，J.W.等人，1958，病理细菌学杂志(J.Pathol.Bacteriol.)，76441-449)的研究建立的。正如在造血领域中，这个概念是从对肝癌发生的广泛研究中获得大多数承认的(Marceau，N.，1994，Gut.，35294-6)。这些研究者相信祖先细胞，包括双潜能祖先细胞，能够继续存在于成年组织中，但是这些研究者认为它们属于稀少的残留物或者来自胚胎发育细胞群的残余。这些研究者假设祖先在正常或再生肝脏的功能发挥中不起任何作用，但只在疾病状态中起作用(Overturf K，1999，美国病理学杂志(AmericanJournal of Pathology)，1552135-2143)。这也就是假设它们是“沉默的”，与肌肉中的星形细胞相似。由于其与众不同的细胞核形状，这些细胞被描述为“卵形细胞”。它们不大(9μm左右)，并且在细胞表面表达特征性的抗原谱。所有成熟肝脏的细胞在生长和基因表达方面被假设为是共相等的，而且基因表达的不均一性仅由细胞的微环境所决定。沉默干细胞模型的支持者强烈反对实质细胞从门周到中央周围部位移动的任何想法。肝脏细胞和其它肝祖先的重要性被认为仅与疾病状态、特别是癌症发生相关。因而，这些研究者将精力集中在用多种致癌性损害处理的动物中的候选祖先上。这些研究表明，“卵形细胞”在再生条件下或者在轻度至中度损伤的条件下不形成快速增殖细胞的可识别实体。只是在肝脏受到相当严重的损伤后，才观察到大量的增殖性卵形细胞群(Grisham，J.W.等人，1997，见干细胞(Stem Cells)，C.S.Potter编辑，Academic Press，London，233-282)。
基于肝脏细胞流动的模型(Arber，N.等人，1988，肝脏(Liver)，11347-51)，遭到了尖锐的批评，并且基本上已被忽视(Jurtle，R.L.，1995，肝脏再生与癌症发生分子和细胞机理(肝脏的再生与肿瘤的生成分子和细胞机理LiverRegeneration and CarcinogenesisMolecular and Cellular Mechanisms)，AcademicPress，New York)。该模型假定，位于每个肝三联的干细胞区室产生“流向”中央静脉的成年实质细胞。流动过程使子代细胞与独特的微环境接触，从而引起细胞表型的改变。另外，假设微环境是至关重要的表型决定基。大部分研究者不赞成该模型，因为研究表明再引入肝脏的标记供体细胞并不移动(Kennedy，S.等人，1995，肝脏学，22160-8)，而该模型却与此不一致。然而，即使在提供最确切证据以反对流动模型的那些研究中，也不清楚微环境或谱系的位置是否影响用于供体细胞的标记之表达。而且，最近Theise及其同事发现(Theise，N.，1999，肝脏学，301425-1433)，一直被怀疑与肝祖先相关的肝闰管至少在区带1中伸出遍及肝板的小管，流动肝脏假说很可能会在此之后被重新光顾。
Reid及其同事支持肝脏是一个干细胞和正在成熟的谱系系统(西格Sigal，S.H.等人，1992，美国生理学杂志(Am J Physiol.)，263G139-48)。他们提出，组织由干细胞或早期的祖先细胞群组成结构为正在成熟谱系的，类似泉涌的涌入流(fed)(布利Brill，S.等人，1993，Proceedings of the Society for ExperimentalBiology & Medicine，204261-9)。组织被定义为从“年轻到中年再到老年的不断变化的细胞”。成熟的过程伴随着细胞在大小、形态、抗原谱、生长潜能和基因表达方面的谱系位置依赖性变化。这些变化被假设为是由细胞的自主性变化之组合引起的，并不依赖于微环境及微环境诱导的变化；这里所说的微环境包括营养物、气体交换(氧气、CO2)、pH、激素、细胞-细胞相互作用及细胞外基质化学。
表1

假定生长在干细胞和早期祖先中为最快，并沿着谱系进程而衰退。该模型考虑到在成年肝脏组织中大部分细胞是多倍体，主要是四倍体和八倍体，少于三分之一的细胞是二倍体。最近的数据支持这样的概念，即组织中的大部分再生潜能源自二倍体细胞群，而且较老的细胞通过增加细胞量(以与多倍体相关的肥大性应答方式)为再生做出贡献(西格Sigal，S.H.等人，1999，American Journal ofPhysiology，276G1260-72)。所以，这些研究者支持无论是在细胞或基因治疗还是在人工生物器官，细胞生长的最佳希望存在于用组织的二倍体细胞群。
干细胞和正在成熟谱系模型与其它肝脏细胞发育模型的矛盾之处在于，它认为肝脏恶性肿瘤在绝大多数情况下是致癌性损害的非直接、而不是直接的结果。致癌性损害被认为是杀死了肝脏的大多数细胞，特别是谱系中的成熟细胞，导致对再生应答的显著诱导。所导致的祖先扩增增加了快速生长的细胞，即祖先，它可导致恶性肿瘤的第二次突变事件的危险性。因而，较老的假说，即癌是阻断的分化，或者癌是由于靶向干细胞的致癌性损害，被承认是正确的，但进行了如上所述的修改。
目前基于这样的数据，即肝脏充满了表示细胞程序性死亡或终末分化过程的特征(西格Sigal，S.H.，1995，分化(Differentiation)，5935-42)，以及发现仅存在于成年肝脏的某些肝脏细胞亚群能够进行广泛的细胞分裂(OverturfK等人，1999，美国病理学杂志(American Journal of Pathology)，1552135-2143；Tateno，C等人，2000，肝脏学，3165-74)，使得正在成熟谱系模型越来越被承认。在该模型中，祖先和成年细胞的一个亚群(假定是二倍体亚群)被再注射到活体内时，具有重建肝脏组织的能力，并能够进行广泛生长，包括克隆生长。
授予瑙顿(Naughton)的美国专利第5,559,022号公开了从肝脏分离细胞和使用梯度离心进一步将其纯化。然而，其所分离的细胞群是“嗜酸性的实质细胞群”，而不是本发明所要求保护的肝脏祖先。肝脏祖先的临床前和临床应用性因为来自肝脏的未成熟祖先细胞可能具有治疗肝脏疾病的效果，所以对分离和鉴定这类细胞群有强烈的临床和商业兴趣。每年在美国，就有大约250,000人因肝脏衰竭而住院。肝脏移植能够有效地治疗某些类型的肝脏衰竭，并且每年在美国进行大约4,100例移植。其中限制肝脏移植的一个因素是供体肝脏的可利用度，特别是受到了用于器官移植的供体肝脏必须源自脑死亡而不是心脏停滞的患者的限制。由尸体提供的肝脏一直不成功，尽管最近使用这类供体的努力已经支持这种可能性，即如果在死亡1小时内获得肝脏，就可使用它们。
对于大多数肝脏疾病，将细胞移植入肝脏是一种有吸引力的替代性疗法。相对于那些需要移植整个器官而言，细胞移植的手术过程算不上重要，因而可将其用于具有多种手术危险性的患者，诸如老年或体弱者。使用人的肝脏细胞优于源自其它哺乳类动物的肝脏细胞，这是因为潜在的病原是人源的，并可被患者更好地耐受以及在使用前可容易地对其筛选。
在进行肝脏细胞移植的尝试中，使用过未分级的成熟肝脏细胞，并已显示一定程度的效果(福克斯Fox，I.J.等人，1998，新英格兰医学杂志(New EnglandJournal of Medicine)，3381422-1426)。然而，由于这些细胞在活体内不生长，所以需要注射大量的细胞(100-200亿)才能成功。而且，引入大量成熟的大肝脏细胞(平均细胞直径30-50μ)，在注射时它们倾向于并发性地形成巨大的聚集体，从而导致潜在的致死性栓子。而且，这些细胞还引发显著的免疫排斥应答，迫使患者服用免疫抑制药物以维持以后的生存。最后，还没有成功地将成熟的肝细胞低温保藏，因而需要复杂的后勤来协调合适肝脏组织的可用性、细胞悬浮液的制备以及用于临床治疗细胞的即刻传递。分离肝脏祖先方面的进展已知从肝脏分离肝脏祖先是一项极具挑战性的工作，这是由于对肝脏细胞缺乏正选择标志。对于肝祖先的候选物，唯一可用的抗体是所制备的抗肝祖先亚群(卵形细胞)，可诱导其增殖，用于受到致癌剂损害后的那些单克隆抗体。然而，这些抗体与存在于造血细胞的抗原有交叉反应。
过去，曾尝试获得肝祖先细胞群，认为它们是用于肝脏的细胞和基因治疗之最为通用的群。授予Reid等人的美国专利5,576,207、5,789,246使用细胞表面标志和侧向散射(side scatter)流式细胞计数，以提供肝脏中限定的亚群。通过去除谱系定向细胞以及选择未成熟的肝祖先，未成熟的肝祖先为经过检测携带有OC.3-阳性(卵形细胞抗原性标志)、AFP-阳性、清蛋白-阳性和CK19-阴性(细胞角蛋白19)细胞标记的非粒细胞。已经对大鼠肝脏细胞的亚群进行了分离。前述的大鼠肝脏亚群证实有这样的特性，它们在从啮齿类肝脏分离和鉴定富集的肝祖先中很重要。
部分由于这样的争论，即关于成年期中是否有肝脏祖先，假定是人肝祖先存在与否，或者该肝脏祖先只是来自胚胎发生、在生理上沉默的残余物，所以，正如本文所公开，从成年人的肝脏分离肝脏祖先是创新和出乎意料的。因而，除了在疾病状态下，还没有对它们进行分离或研究的尝试。
对比之下，胞质蛋白质甲胎蛋白(AFP)和清蛋白在发育肝脏中的存在被认为是祖先细胞的强阳性指征。在肝脏发育的最早阶段，这些细胞能够产生既进入胆管又进入肝脏细胞谱系的子代。如果这些子代细胞定向到胆管谱系，甲胎蛋白的表达就停止了。然而，在肝脏细胞谱系中甲胎蛋白持续表达，直到围生期时被抑制为止，从而使得表达清蛋白成为成年肝脏细胞的主要特征之一。
然而，由于甲胎蛋白是细胞内蛋白质，并且只能在细胞被固定和可渗透化处理后，才能显示出来，所以将其作为鉴定活的肝祖先细胞的标志并不合适。
发明概述本发明涉及一种提供含源自人肝脏组织细胞混合物的组合物的方法，该混合物包含人肝祖先的富集群，该方法包括提供基本上是人肝脏组织的单细胞悬浮液，它包含多种大小细胞的混合物，其中包括未成熟的细胞和成熟的细胞；然后在能够去除成熟的细胞和那些相对较大的细胞的条件下缩小悬浮液的体积，而同时保留未成熟的细胞和那些相对较小的细胞，以提供包含人肝祖先的富集群，其中的人肝祖先本身、它们的后代、或者其更成熟的形式均显示出一种或多种表示甲胎蛋白、清蛋白或二者表达的标记。甲胎蛋白和清蛋白可以是全长的或者是变异体。缩小体积的过程包括利用细胞的大小、浮力密度或二者的分离。也可以基于沉降速度、流体动力学半径和沉降到平衡密度，缩小体积。或者，也可以利用表面标志对例如，抗体和植物凝集素等结合组分的粘附性进行分离。所分离的祖先可以是二倍体并且其直径可小于大约15微米。而且，这些祖先或它们的后代能够合成祖先特异的大分子，包括但不限于甲胎蛋白和清蛋白。优选地，甲胎蛋白包括编码外显子1(AFP)的多肽序列。因而，甲胎蛋白转录自大小大于2kb的mRNA，为全长的AFP mRNA。类似地，清蛋白优选地包括编码外显子1(ALB)的多肽序列。因而，该清蛋白转录自全长的mRNA。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种分离、低温保藏和使用来自人肝脏祖先的方法，其中包括处理人肝脏组织，提供包含存在于人肝脏的一种或多种细胞谱系的祖先和非祖先、并且基本上是单细胞的悬浮液；将悬浮液在缩小体积步骤中处理，从而大量地减小悬浮液中非祖先的数量，以提供富集祖先的缩小体积的悬浮液，该祖先显示与至少一种细胞谱系相关的一种或多种标志；可选地是，从缩小体积的悬浮液中选择这样的细胞，这些细胞本身、它们的后代、或其更成熟形式表达与至少一种肝细胞谱系相关的至少一种标志；可选地是，在适于最佳低温保藏的条件下将细胞悬浮；以及可选地是，用于生产生长因子和治疗患者。优选地将表达胞质蛋白质诸如甲胎蛋白的肝脏祖先选择出来。本发明中的处理和缩小体积步骤优选地包括肝细胞悬浮液的密度梯度离心或离心式淘洗，以便根据它们的浮力密度和/或大小将细胞分开，这种大小与具有较低浮力密度的一个或多个梯度分级和/或在大小上较小相关。密度梯度方法可包括区带离心和连续流式离心。
本发明的一个实施方案为通过利用与成熟的肝脏细胞相关的标志，诸如连结蛋白、与造血细胞相关的标志诸如血型糖蛋白A和CD45和/或与成熟的间充质细胞相关的标志，诸如类维生素A和von Willebrand Factor等，负选择包括成熟的肝、造血和间充质细胞在内的非祖先。
本发明者发现使用肝祖先能够克服许多与使用成熟肝细胞相关的缺点，使它们成为用于细胞和基因治疗以及用于人工生物器官的理想细胞。这些细胞较小(7-15μ)，因而最小化巨大栓子的形成。另外，这些细胞具有广泛的生长潜能，这意味着只需要更少的细胞就可在患者中重建肝脏组织。最后，这些祖先具有最少的可能引发免疫排斥的抗原性标志，提供了也许几乎不需要或不需要任何免疫抑制药物的希望。用肝脏细胞治疗包括肝脏细胞的体外处理或者移植。这些细胞，优选地包括祖先细胞在内，是以多种途径中的任何之一包括非肠道和腹膜内提供的。有效量的细胞，优选地103到1010个细胞，是需要的。更优选地，要移植105到108个细胞，最佳地大约106个细胞。
在本发明的另一个实施方案中，肝脏祖先在生产生长因子和其它蛋白质中极为有用。这些因子与它们自己的生长或者与肝脏中其它祖先(例如，造血或间充质祖先)的生长相关，并与肝祖先细胞发育为特定谱系之早期步骤相关的因子相关。这些新的生长因子可用于治疗肝脏疾病，或者控制那些是肝脏祖先的转化子的癌症。而且，肝脏祖先是基因治疗的重要靶子，其中的插入遗传性地转化肝祖先，或者将正常的肝祖先移植入个体，则正常的肝祖先促进个体的健康。
本发明的另一个方面是确定细胞表面上与甲胎蛋白在细胞内表达相互联系的独特抗原谱。以这种方式表征含有甲胎蛋白的细胞，就能够从制备自完整肝脏或者肝叶的活跃的单细胞悬浮液，通过流式细胞计数法接着富集活的肝祖先细胞。而且，人肝祖先的分离和鉴定，正如本文所述，是通过应用独特的方法、标志和参数之组合而实现的，并且本发明者是第一个使用这些手段得到本发明之独特的细胞群。
本发明的进一方面提供起源肝、造血或间充质的全肝脏细胞祖先。通过选自CD14、CD34、CD38、CD45、CD117、ICAM、血型糖蛋白A抗原性标志，和/或胞质标志诸如甲胎蛋白样免疫反应性、清蛋白样免疫反应性或二者，选择出这些细胞谱系、它们的后代或者其更成熟形式。甲胎蛋白可源自全长的mRNA(大于2kb，为通常在肝祖先中表达的形式)或者来自变异形式(小于2kb，即大约0.5、0.8、1、1.5或2kb，为通常在造血祖先中表达的形式)。本发明的肝脏祖先可分离自胎儿、新生儿、婴儿、儿童、青少年或成年人的肝脏。
为与本发明的进一方面相适应，将所分离的人肝脏祖先纯化为高度富集到基本纯的形式。这样的肝脏祖先含有肝、造血和间充质祖先。肝祖先具有发育为肝细胞、胆管细胞或其组合的能力；造血祖先具有发育为巨噬细胞、中性白细胞、粒细胞、淋巴细胞、血小板、中性白细胞嗜酸细胞、嗜碱性粒细胞或其多种组合的能力；间充质祖先具有发育为内皮细胞、基质细胞、肝星形细胞(Ito细胞)、软骨细胞、骨骼细胞或其多种组合的能力。本发明的方法可用于选择表达甲胎蛋白样免疫反应性、CD45、清蛋白样反应性、CD34、骨桥蛋白、骨骼唾液蛋白(bonesialoprotein)、胶原(I、II、III或IV型)或其组合的间充质祖先。
本发明的更进一方面提供包含有外源核酸的肝脏祖先。该外源核酸可编码至少一种目的多肽，或者能够促进至少一种目的多肽的表达。
为与本发明的再进一方面相适应，通过对受到一种或多种人疾病或功能障碍之负效应所损害的个体施用有效量的所分离的人肝脏祖先，从而提供减轻该负效应的一种方法。可采用腹膜内或者通过血管采用非肠道途径，或者直接施用于肝脏内，从而将祖先施用。可通过外科手术经门静脉、肠系膜静脉、肝动脉、肝胆管或其多种组合，有效地实现直接施用。或者，可将肝脏祖先施用于个体的异位部位内，诸如脾脏或腹膜。
通过本发明的方法，能够减轻的人疾病或功能障碍包括肝胆管炎、肝软化、肝肿大、肝硬变、肝纤维化、肝炎、急性肝衰竭、慢性肝衰竭，或者先天性代谢不正常和肝脏癌症诸如肝癌，或者肝胚细胞瘤。肝脏癌症可以是原位癌症或者转移到肝脏内的癌症。转移的肿瘤可能源自任一数目的原位，其中包括肠、前列腺、乳腺、肾脏、胰脏、皮肤、脑、肺、或其组合。
为与本发明的再进一方面相适应，提供了一种生物反应器，包括包含从人肝脏中分离的祖先的生物物质，它们的后代，它们的正在成熟或已分化的后代，或者其组合；以及培养液，诸如基础培养液；一个或多个装有生物物质或包含生物物质组分的区室；和任选地，一个或多个连接接口。而且，该生物反应器也可任选地包含细胞外基质；激素、生长因子、营养物或其多种组合；以及生物液，诸如血清、血浆或淋巴液。
该生物反应器适用于维持所述祖先处于活的、有功能的状态，并能够维持肝脏祖先从大约1周到大约55周的时间。具体地，该生物反应器适用于用作人工肝脏、制造产品、毒理学研究，或者包括涉及细胞色素P450活性的研究等代谢研究，或者药物代谢的其它类型。
为与本发明的再另一个方面相适应，本发明提供了所分离的人肝脏祖先的组合物或者从人肝脏获得的富集祖先悬浮液。所提供的细胞悬浮液处于药学可接受的载体或稀释剂中，然后将其施用于需要接受治疗的个体。本发明的组合物包含显示与发现于人肝脏的一种或多种细胞谱系中的至少一种相关的一种或多种标志的肝脏祖先，并且基本上不含有成熟细胞。更特别的是，所分离的肝脏祖先源自一种或多种全肝脏细胞谱系，包括肝、造血或间充质细胞谱系，并且这些细胞谱系本身、它们的后代或者其祖先的更成熟形式表达至少一种或多种抗原性标志CD14、CD34、CD38、CD90、或CD117、CD45、血型糖蛋白A，以及甲胎蛋白样免疫反应性、清蛋白样免疫反应性或二者的胞质标志。在进一步的实施方案中，未成熟细胞、它们的后代或更成熟形式表达骨桥蛋白、骨骼唾液蛋白、I型胶原、III型胶原、IV胶原型或其组合。
为与本发明的另一个实施方案相适应，本发明提供了肝脏祖先的细胞培养系统，其中包含所分离的人肝脏祖先、它们的后代、它们的正在成熟或已分化的后代或其多种组合。细胞培养系统还另外包含包含一种或多种胶原、一种或多种粘连蛋白质(层粘素、纤维结合素)及其它组分(诸如蛋白多糖，例如硫酸乙酰肝素蛋白多糖)的细胞外基质；或者单独一种基质组分。该基质组分包括基质组分的片段，基质模拟物，它可以是合成的或者生物可降解的物质(即微球体)，它们采用来自多种类型的细胞外基质中的一种或多种因子外包衣。该细胞培养系统还可另外包含基本或加富(enriched)培养液及其它营养物；激素、生长因子和，任选地，生物液，诸如血清、血浆或淋巴液。另外，细胞培养系统可含有一个或多个装有生物物质的诸如培养皿、板、瓶、摇瓶、transwell或其它类似容器的区室。
可将本发明的培养物或生物反应器用于一种或多种代谢的研究，包括涉及第I阶段或第II阶段生物转化酶系统的活性的研究；一种或多种转运的研究，包括涉及肝窦状隙及小管的转运系统的表达、调节和活性的研究；其它包括药物代谢方面和细胞色素P450的活性。
在本发明的更进一步的实施方案中，为粘连的细胞提供了低温保藏方法。低温保藏粘连的细胞的方法包括(a)提供粘连的细胞，以及基质或粘性增强剂；(b)将细胞悬浮于包含培养液、冰晶抑制剂、碳水化合物调节因子、铁供体、脂蛋白和类脂的低温保藏混合液中；和(c)冷却悬浮液至细胞的冰点之下。此处的冰点是指细胞变为固体物质的温度，而不管其是过冷的液体或玻璃体、微晶或巨晶物质。而且，本文公开了低温保藏混合物，其中包含培养液、冰晶抑制剂、碳水化合物调节因子、铁供体、脂蛋白和类脂。低温保藏混合物也可包含抗氧化剂诸如抗坏血酸、甘油(10％v/v)或二甲基亚砜(DMSO，10％v/v)，后两种试剂可作为冰晶形成的抑制剂。铁供体、脂蛋白和类脂可分别是转铁蛋白、高密度脂蛋白和游离脂肪酸。任选地，游离脂肪酸与清蛋白结合。低温保藏混合液可包括胶原、胶原样物质、琼脂糖、甲基纤维素或明胶，其中的胶原可以是I型胶原、III型胶原或IV型胶原。该低温保藏混合液的组分可制备于Viaspan或Univeisity of Wisconsin低温保藏溶液中。
本发明进一步的实施方案是拥有多份低温保藏的肝祖先和/或它们的后代的标本、细胞库、目录或生物储藏处。肝祖先可由上述方法分离，并且也可以是由任何可接受的方法，它提供表达全长甲胎蛋白、清蛋白或二者的肝祖先的分离的肝祖先。此储藏处可包括细胞标志索引系统。在融化后，可将储藏的细胞用于接种生物反应器、起始细胞培养或用于治疗患者。
本发明更进一步的实施方案包括甲胎蛋白变异体，它是缺失甲胎蛋白外显子1的基因或mRNA的基因产物，见下面定义。正如在本发明中所公开，甲胎蛋白变异体常常与造血祖先及其它们的后代相关，而不与肝祖先相关。本发明再进一步的实施方案包括从甲胎蛋白外显子1编码的序列得到的3至10个氨基酸的肽。
本发明的另一个实施方案包括大分子与肽的缀合物，其中的肽为来自甲胎蛋白外显子1编码序列的3至10个氨基酸之间的肽，并适于用作抗原。大分子可以是清蛋白、血蓝蛋白、酪蛋白、卵清蛋白、多聚赖氨酸例如，多聚-L-赖氨酸或多聚-D-赖氨酸和本领域已知的任何其它适合的大分子。可将抗原用于产生对甲胎蛋白特异的抗体，甲胎蛋白的表达为肝祖先的特征，而不是造血祖先或它们的后代的特征。正如本领域所公知，在存在或不存在佐剂的情况下用抗原免疫动物，或者将脾脏细胞暴露于抗原并随后融合脾脏细胞以形成杂交瘤，可产生抗体。
在本发明的另一个实施方案中，公开了从人肝脏分离祖先的方法，包括处理人肝脏组织以提供基本上为单细胞的悬浮液，其中包含在人肝脏中发现的一种或多种细胞谱系的祖先和非祖先，将悬浮液在缩小体积步骤中处理，此步骤显著地减小悬浮液中非祖先的数量，以提供祖先被富集、体积被缩小的悬浮液，该祖先显示一种或多种与一种或多种细胞谱系中的至少一种相关的标志，接着从缩小体积的悬浮液选择这样的细胞，这些细胞本身、它们的后代或者其更成熟形式表达与一种或多种细胞谱系中的至少一种相关的一种或多种标志。
附图简要说明

图1甲胎蛋白mRNA的PCR分析图2清蛋白mRNA的PCR分析图3低温保藏对胎儿肝细胞存活率的影响图4左边，通过FACS得到的甲胎蛋白免疫荧光矩形图右边，通过FACS得到的清蛋白免疫荧光的矩形5在未分级的全肝脏细胞悬浮液中表达表面标志CD14、CD34、CD38、CD45和血型糖蛋白A(GA)的细胞百分比图6胎儿的全肝脏细胞细胞表面标志和甲胎蛋白的共表达图7左上，甲胎蛋白阳性的细胞百分比右上，清蛋白阳性的细胞百分比底部，Percoll分级对甲胎蛋白和清蛋白的共表达的影响图8一个胎儿全肝脏细胞悬浮液共表达CD14、CD38和甲胎蛋白的FACS分析图9使用CD14和/或CD38筛选甲胎蛋白阳性细胞的产率图10对甲胎蛋白染色的胎儿肝祖先细胞之四个有代表性的免疫荧光视野图11CD14的筛选效果(右)差示干涉对比(differential Interference Contrast)(上)和免疫荧光视野(下)图12A通过相差显微镜观察全肝脏细胞簇图12B采用抗甲胎蛋白抗体，通过免疫荧光观察相同的全肝脏细胞簇图12CA和B的叠加图13A用Calcein染色的全肝脏细胞图13B用甲胎蛋白染色的全肝脏细胞，视野同A优选实施方案的详述I.定义在随后的描述中，广泛地使用了若干术语，以描述本发明。为了对专利说明书及权利要求书，包括术语所包含的范围，提供一个清楚和连贯的了解，提供如下定义。
甲胎蛋白样免疫反应性任何由甲胎蛋白引起的免疫反应。甲胎蛋白可以是全长的或截短的，包括异构体和甲胎蛋白的拼接变异体。
定向祖先具有单一种命运的未成熟细胞，诸如肝脏细胞的定向祖先(生成肝脏细胞)或胆管的定向祖先(生成胆管)。在分子水平上还不了解定向的过程。但仅经验性地认识到，当细胞的命运比其前辈缩窄时，就发生了定向的过程。
肝脏细胞全肝脏细胞的亚群，它包括肝细胞和胆管细胞。
全肝脏细胞(liver cells)如本文所用，术语“全肝脏细胞”指存在于正常肝脏中的所有细胞类型，不考虑它们的来源和命运。
干细胞如本文所用，术语“干细胞”指能够产生多于一种命运的子代细胞之未成熟细胞，也就是它们是多能的。全能干细胞，诸如胚胎干细胞(ES细胞)或者哺乳动物胚胎上至8细胞阶段的胚胎细胞，具有自我更新(自我保持)的能力，其中的干细胞产生与其自身完全相同的子代细胞。与此相对应，认定干细胞，诸如造血、神经元、皮肤或肝干细胞，是多能的并具有广泛的生长能力，但却怀疑其具有自我更新能力。在全能干细胞的情况下，一些子代细胞与亲代完全相同，而另一些“定向”于特定的一种或多种命运，它们的遗传潜能被限制至少于其亲代。在认定干细胞的情况下，一些子代细胞保持多能性，而另一些失去多能性，定向于单一的、特定的命运。
肝祖先这些细胞产生肝细胞和胆管细胞。肝祖先包括三个亚群“肝干细胞”、“定向肝脏细胞祖先”和定向胆管祖先，后两个为肝干细胞后代的未成熟细胞，并且具有单一种命运或者是肝脏细胞，或者是胆管细胞，但不能是二者。
肝干细胞肝祖先的一个亚群。
肝脏祖先来自肝脏的一个细胞群，包括肝祖先、造血祖先和间充质祖先。
造血生成细胞命运为淋巴细胞(B和T)、血小板、巨噬细胞、中性白细胞和粒细胞的血液细胞。
间充质生成生成细胞命运为内皮细胞、脂肪细胞、基质细胞、软骨和甚至骨骼(最后二者仅在疾病状态下于肝脏中发生)的间充质衍生物。
细胞治疗如本文所用，术语“细胞治疗”指用作自体或同种异体物质的规定细胞群的活体内或离体转移，并被移植到患者特定的靶细胞或其附近中。细胞可以在任何合适的介质、载体或稀释剂，或者任何类型的，包括微载体、珠、微粒体、小球体、囊泡等药物递送系统中被移植。
基因治疗如本文所用，术语“基因治疗”指规定的遗传物质活体内或离体转移到患者特定的靶细胞，因而改变了基因型，并且在大多数情况下，也改变那些靶细胞的表型，最终目的是为了预防或改变特定的疾病状态。基因治疗可包括离体修饰靶细胞并将细胞引入到患者中。或者，可将载体靶向活体内肝脏祖先细胞，以传递外源遗传物质和转染祖先。而且，遗传工程化的祖先细胞可用于生物反应器中治疗患者或者作为生物制品的来源物。正如本定义所陈述，根本的前提是这些治疗性的遗传操作，其设计的目的是最终预防、治疗或改变明显的或隐藏的病理状态。在大多数情况下，基因治疗操作的最终治疗目的是改变特定靶细胞群的表型。
CD“分化簇”或“共同决定簇(common determinant)”如本文所用，指被单克隆抗体识别的细胞表面分子。对于特定的谱系或正在成熟途径的细胞，某些种类CD的表达是特异的，而相同的细胞中其它种类CD的表达随激活、部位或分化状态而变化。
当术语“一种，一个(英文one)”、“一个(英文a)”或“一个(英文an)”用于本专利公开中时，它们的含义为“至少一种或一个”或“一个或更多”，除非另外指出。
H.甲胎蛋白和清蛋白作为肝谱系的诊断标志均为胞质蛋白质的甲胎蛋白(AFP)和清蛋白是肝谱系的特别可靠的标志。这些蛋白质的表达是鉴定肝脏中来自其它细胞类型的肝亚群的基础。
体外刺激人白血病细胞谱系及正常的T淋巴细胞后，它们也能够表达AFP。然而，该数据没有表明白血病细胞谱系以及激活的淋巴细胞中的AFP mRNA是否与肝脏细胞中真正的AFP mRNA完全相同。有必要确定是否可通过常规的蛋白质测定，诸如免疫荧光、western印迹等等来测量AFP或清蛋白mRNA的表达，因为RT-PCR是已知的鉴定特定RNA模板的最灵敏技术。
在此处所描述的研究之前，还没有人曾对AFP或清蛋白mRNA在人造血细胞中的形式进行过详细的研究。本发明证实了AFP和清蛋白的变异形式在造血细胞中的表达。
图1是利用针对甲胎蛋白mRNA的几个外显子的引物，通过聚合酶链式反应(PCR)对肝脏和非肝细胞的分析结果。PCR分析揭示在造血细胞中有截短的AFP。利用hAFP1、hAFP2、hAFP3和hAFP4的引物组合，进行了RT-PCR。M＝分子量标准，道1-3＝Hep3B；道10-12＝STO成纤维细胞；道13-15＝无任何RNA。注意在道2、4和8中，都有一条为截短的AFP异体形式的条带。注意到在道1和4中，有一个对全肝脏细胞特异的变异的AFP异体形式。在道3和6中观察到完整的AFP种类。为了表征hAFP mRNA的变异形式，本发明者设计了九个PCR引物，如在实施例1中所示。AFP的编码序列从外显子1延伸至外显子14。除了对AFP mRNA外显子1的引物组合外，所有的引物组合在人红白血病细胞系K562中都扩增出AFP mRNA的部分；而在人肝脏细胞系HepG2和Hep3B中所有的组合均检测到AFP mRNA。这就证实了AFP mRNA的变异形式含有从外显子2到正如在K562中所表达的外显子14，但是并不覆盖AFP的所有编码序列。该结果提示在鉴定肝脏细胞中有用的引物只是检测AFP外显子1部分的那些引物，AFP外显子1的表达更可能地是以组织特异的方式被加以限制。对肝祖先亚群而言外显子1是独特的，这个事实使得人们能够利用它，在肝和造血祖先细胞类型之间作为鉴定肝祖先细胞类型的探针。
由于在造血细胞的一些亚群中存在有AFP的截短形式，在肝和造血细胞中也都对清蛋白进行了分析。清蛋白探针的设计方式与AFP探针类似(见上)，并将其用于在肝和造血细胞谱系之间测定清蛋白在肝脏细胞谱系中的相对表达。至于AFP，在造血细胞谱系K562中，发现了一个截短的形式，并且利用针对外显子12-14的引物而检测出的一个转录本。
本发明公开了RT-PCR特异探针的设计和制备，以确定在肝和造血细胞群中，AFP和清蛋白mRNA的变异形式的表达谱。正如此处所公开，本发明证实了在造血祖先中可存在有AFP和清蛋白mRNA二者的变异形式。它意味着当使用这样的敏感测定法时，必须使用另加的标准，诸如使用针对AFP外显子1的探针，从而在肝和造血细胞群中确定出肝脏细胞群。
图2是通过针对清蛋白的几个外显子的PCR，对肝脏细胞和非肝脏细胞的分析结果。由于在造血细胞的一些亚群中存在有AFP mRNA的截短形式，在肝和造血细胞中也都对清蛋白进行了分析。清蛋白探针的设计方式与AFP探针类似(见上)，并将其用于在肝和造血细胞谱系之间测定清蛋白在肝脏细胞谱系中的相对表达。至于AFP，在造血细胞谱系K562中，发现了一个截短的形式，并且发现了针对外显子12-14的引物而检测出的一个转录本。
肝脏的发育研究证实胎儿的肝脏，在子宫内的发育期间，既是肝脏的发生器官又是造血器官。在肝脏的多种发育期期间，胎儿的肝脏含有巨量的造血细胞，特别是红细胞谱系的造血细胞。而且，越来越意识到肝脏发生系统和造血系统是相互间紧密相关的，并存在这样的可能性，即这种相互关系包括了AFP和清蛋白的联合表达(joint expression)，或者也许是联合表达该蛋白质的同型。对肝祖先亚群而言外显子1是独特的，这个事实使得人们能够鉴定本发明的肝脏祖先细胞的特定亚群。
尽管PCR分析显示，造血祖先可表达AFP以及清蛋白mRNA二者，但是mRNA的表达水平非常低。确实，当采用流式细胞计数分析测量AFP和清蛋白时，在K562中检测不到AFP和清蛋白。尽管AFP和清蛋白二者都在鉴定肝脏细胞中起着至关重要的指导作用，但是在采用流式细胞计数将它们纯化后，AFP能够特别地诊断肝祖先细胞，这是由于AFP在肝祖先中的表达强度特别高。在经过任何类型的分级分离策略后，AFP也被用来估计肝祖先的纯度。
III.人肝脏祖先的处理本发明者建立了从胎儿或成年的肝脏获得解聚的人肝脏祖先的最佳方法。成熟的全肝脏细胞的分离，通常包括酶或机械解聚组织为单细胞悬浮液，随后是采用密度梯度离心、离心式淘洗、差异性酶消化法(即肝星形细胞)的分级分离，和/或采用细胞培养(见Freshney的综述，在“动物细胞培养的基本技术手册(Culture of Animal Cells，A Mannual of Basic Technique”，1983，Alan R Liss，Inc.NY中)来选择。大多数研究者日常使用密度梯度离心，通过弃去所有的分级分离部分并只留下最终的沉淀，去除他们认为的碎片和死细胞。
所有的其他研究者使用经密度梯度分级分离后的最终沉淀，而本文所公开的方法却是独特的，这是由于它使用了密度梯度靠上的分级分离部分而没有使用沉淀部分。对密度梯度离心的新变化，正如本文所公开，就在于沉淀被弃去而保留具有较低浮力密度的细胞，即，收集位于或接近梯度顶部的细胞。本发明者发现更年轻(二倍体)和更具活力的细胞在低温保藏时出现在Percoll密度梯度的顶部或其中，而不是位于沉淀部分中。
IV.缩小体积缩小体积是富集肝脏祖先的一个过程。祖先可以是包括肝、造血和间充质的几个谱系中的任何。由于肝脏中有多种成熟细胞可以是四倍体或多倍体，所以去除一些或者全部成熟细胞，从而制备祖先的富集群是有益的。在4℃进行缩小体积步骤有利但不是必需的。
在制备了全肝脏细胞的单细胞悬浮液后，根据细胞的大小、浮力密度或二者的组合将细胞分成多个分级分离部分。根据本发明，肝脏祖先细胞的直径小于15微米。将这样小的细胞从较大的细胞或者从细胞碎片中分离的任何方法都是合适的，其中包括培养液(其可以是基本培养液或滋养培养液)的沉降速度法、梯度沉降、采用大孔径珠的色谱分离及其它。梯度介质可以是聚乙烯吡咯烷酮包衣的硅胶(Percoll)、交联的蔗糖(Ficoll)、葡聚糖或本领域人员公知的任何物质，并将其在例如，磷酸缓冲盐溶液或者Eagle基本培养液(BME)，中配为等渗液以防止细胞裂解。一般将解聚的细胞悬浮液加在梯度介质层的上面，随后进行离心，同时保持温度在4℃。或者，将细胞悬浮液加到单采血液成分装置，诸如用于分离血液组分，即血浆去除法。包括成熟的实质细胞和四倍体细胞的大细胞，要比小的祖先和二倍体细胞沉降得快，因而被去除。离心方法的设计要考虑到细胞对低氧压力的敏感性，并最大限度地减小富集细胞富所需的时间。通过这些方法，可将细胞悬浮液用于富集肝祖先。而且，缩小体积步骤可包括离心式淘洗、基于细胞表面粘附蛋白质的淘选、亲和色谱或分批处理、荧光标记、区带离心、连续流式离心、与磁性珠温育后的磁性分选，例如，复合抗体的磁性珠，或者这些方法的组合。密度梯度离心可以是不连续的梯度或者连续的密度梯度。Percoll分级分离适于立即使用、低温保藏、在培养液中建立、或者进一步富集。进一步富集可通过淘选、亲和选择、FACS分选或者本领域公知的以及上述的任何技术来实现。负选择可通过去除表达标志CD45、血型糖蛋白A或正如下面提到的其它标志的细胞来完成。正选择可通过选择表达CD14、CD34、CD38、ICAM或者其它标志的细胞，而这些标志指示全长甲胎蛋白、清蛋白或二者表达。
在进行缩小体积的另一个实施方案中，通过选择性裂解，将非祖先选择性地去除。通过将细胞悬浮液与等渗的氯化铵溶液短暂地接触，随后用培养液稀释和离心，去除红细胞“影”。并释放血红蛋白。类似地，通过使用下述的低温保藏混合物进行冰冻，非祖先被选择性和水解性地裂解。缩小体积的多种方法去除了多倍体细胞、表达与成熟肝脏细胞相关的标志的细胞、表达与成熟间充质细胞相关的标志的细胞以及这些细胞的多种组合。
V.人肝脏祖先和它们的后代的低温保藏本发明的低温保藏方法与所使用的现有技术相比，具有独特和明显不同之处。主要的区别是使用了不同的缓冲液以及低温保藏低密度的肝祖先群，因而其在密度梯度离心中是悬浮的。肝祖先在大小方面小，并且是二倍体。
非常希望将成熟的人肝细胞成功地低温保藏，但是在本领域中却从来没有实现过。一般将成功的低温保藏定义为能够在液氮温度(-160-180℃)冷冻细胞，接着将其融化，可观察到存活率大于75％并具有贴附到培养皿上的能力。使用较老的方法，啮齿类或人源的成熟肝脏细胞，在上述条件下冷冻后，具有30-40％存活率、不具贴附能力(例如，见Toledo-Pereya等人，美国专利4,242,883；Fahy等人，美国专利5,217,860；Mullon等人，美国专利5,795,711；以及Fahy等人，美国专利5,472,876)。这些专利公开的细胞存活率非常低(小于50％)，主要是处理细胞培养液(不是在细胞悬浮液中的单个细胞)并且需要在冷冻前将细胞与缓冲液进行延长的接触。
图3表示的是根据本发明的方法低温保藏的全肝脏细胞，其优秀的存活率。数据是以在处理时测量存活率与融化时测量的存活率进行对比的存活率的百分比变化表达的。这些数据显示低温保藏没有显著地影响这些细胞的存活率。在储藏期延长至超过550天时，存活率没有显著的变化。本发明的该特殊的低温保藏方法包括使用新缓冲液，新细胞群，以及任选地，将细胞以细胞外基质的形式包埋。该方法是第一次实现了融化时的存活率与冷冻前，即，在细胞分散后的即刻测量的存活率没有不同。由于组织来到时的状态以及使用酶和机械解聚法制备细胞悬浮液的影响，实际存活率有所变化；在本研究中，对胎儿肝细胞而言，平均为77％。该低温保藏方法，冷冻过程没有导致存活率的显著丧失，所得细胞在融化后在离体条件下能够贴附和扩增。
VI.人肝脏祖先的免疫选择本发明讲述一个从人肝脏分离祖先的方法，它包括提供基本上是人肝脏组织的单细胞悬浮液，并对该悬浮液进行正或负的免疫选择。免疫选择的方法可包括从悬浮液中选择那些这样的细胞，它们本身、它们的后代或者其更成熟形式表达与至少一种细胞谱系相关的至少一种标志。这些细胞谱系可以是造血、间充质、肝的细胞谱系或者这些细胞谱系的一些组合。细胞选择步骤可包括去除表达血型糖蛋白A、CD45、一种在成年全肝脏细胞特异的标志、连结蛋白32或者这些的组合的细胞。而且，选择方法可包括去除多倍体细胞、表达与成熟肝脏细胞相关的标志的细胞、表达与成熟间充质细胞相关的标志的细胞或者其组合。细胞的选择可包括选择表达CD14、CD34、CD38、ICAM或者其组合的细胞。而且，该方法可鉴定和选择表达血型糖蛋白A、CD45或者这些的组合的成熟造血细胞。而且，该选择方法可选择表达类维生素A、von Willebrand Factor、因子VIII或者其组合的成熟间充质细胞。
该免疫选择方法可与基于细胞大小、浮力密度或者其组合的缩小体积连同进行。该选择方法可选择表达与至少一种可以是造血、肝或间充质细胞谱系的细胞谱系相关的至少一种标志的细胞。细胞、它们的后代或者其更成熟形式的选择可表达与至少一种肝脏细胞谱系相关的至少一种标志。该谱系可以是实质细胞或肝脏细胞，或者胆管细胞。因而，由这些细胞表达的标志可以是CD14、CD34、CD38、CD117、ICAM或者其多种组合。
VI.细胞标志和流式细胞计数利用我们当前对肝脏祖先的定义，即，表达甲胎蛋白以及表达或者不表达清蛋白的未成熟细胞群，我们对通过使用免疫选择技术，特异地选择这些细胞的标志进行了评价。一个令人吃惊的发现是，为造血祖先的经典标志的许多标志(即，CD34)，也可鉴定肝祖先亚群。因而，针对CD34的单色分选会导致表达AFP细胞的显著富集(至少9倍)。然而，并不是所有这些AFP阳性的细胞可被证实为肝祖先。根据清蛋白阳性的百分比，我们估计80-90％的这些细胞为肝祖先，而其余的细胞或者是远未成熟的肝祖先，因而还没有表达清蛋白，或者可能是表达甲胎蛋白的造血亚群。
本发明使用了一种独特的流式细胞分选策略。通过使用AFP与清蛋白表达的组合作为限定肝脏祖先的两个独特特性，我们已经鉴定了限定肝祖先细胞的抗原标志和其它流式细胞计数参数。到目前为止，分选策略包括分选小于15μ，使用前向散射测量的小细胞、二倍体细胞(使用来自Hoechst染料33342的荧光)、使用侧向散射的无粒细胞、对一定的造血细胞抗原(例如，血型糖蛋白A、血红细胞抗原和CD45)为阴性的细胞，接着为肝脏细胞亚群和造血细胞亚群间共享的阳性标志(即，CD14和/或CD38)的分选。
在本文所描述的实验中，本发明者通过分选那些强烈地表达甲胎蛋白，微弱地表达清蛋白，以及表达CD14、CD34、CD38、CD117，或者其组合的细胞，鉴定了肝脏祖先细胞。尽管是AFP的一个截短形式，本文也描述了造血细胞也表达AFP的证据。本发明者描述了一个新细胞群及其分离、鉴定、培养的过程和使用该细胞群的方法。在分离、鉴定和培养本发明的特定细胞群方面的成功，部分地是通过使用先进的分离方法、亲和缩小体积、高速荧光激活细胞分选、更高速度准确性、以及改进的低温保藏和培养技术而实现的。
发明申请者证实了使用流式细胞分选策略和方法，从新鲜分离的细胞悬浮液和/或从融化的低温保藏全肝脏细胞纯化肝脏祖先。这些方法涉及1)用荧光探针标记的几种针对特异的细胞表面标志的抗体，染色细胞；和2)在多参数流式细胞计数技术中，使用阴性和阳性分选策略的组合。用于从人肝脏细胞群纯化特定谱系期的方法，可用在来自任何年龄供体的肝脏，这是由于这些标志似乎是谱系位置特异的。
改进的标记细胞方法，并跟以前所使用的仪器(Beckon Dickson’s FACSTARPLUS，它可以2000-6000个细胞/秒的速度分选细胞，并可进行2-4个颜色分选)相比，有显著改进的流式细胞计数仪(来自Cytomation的“一个MoFlo”流式细胞计数仪，以40000个细胞/秒的速度分选细胞，并可进行8个颜色分选)，帮助成功地分离和鉴定该新的细胞群。
图4是一个单变量FACS分选。制备用于免疫荧光分析的细胞悬浮液分析甲胎蛋白时使用结合红色染料Cy5的抗体，分析清蛋白时使用结合蓝色染料(AMCA)的抗体。经红色(AFP)和蓝色(清蛋白)荧光筛选的细胞数是三万个。结果显示出一个清晰的细胞组，其每种蛋白质都是阳性的。进一步的分析显示每种蛋白质阳性群中的大约80％代表相同的细胞(即，共表达两种蛋白质)。在细胞悬浮液中，AFP和清蛋白样免疫反应性的表达被充分地限定，有一个清晰的细胞组显示了一个与背景信号相比的清晰区别。在未分级分离的细胞悬浮液中，有6.9±0.86％的细胞表达甲胎蛋白，而清蛋白则存在于7.7±1.1％的细胞。在AFP阳性的细胞中75.6±4.9％的细胞共表达清蛋白，而80±5.5％的清蛋白阳性细胞也表达AFP。因而，大约25％表达甲胎蛋白的细胞不表达清蛋白，并且20％表达清蛋白的细胞不表达甲胎蛋白。
对于完整的细胞悬浮液(即，包括红细胞)，携带用于本研究中的主要表面标志的细胞的比例，见表2(GA＝血型糖蛋白A，为一种血红细胞上的表面标志)。表2在最初的全肝脏细胞悬浮液中CD阳性的细胞百分比以及它们当中又为AFP阳性的百分比CD14 CD34 CD38 CD45 GA未分级分离在群中的％ 3.7±0.8(8) 2.8±0.5 2.2±0.4 2.6±0.5 36.8±5AFP阳性％81.7±2.2 72.6±4.257.6±4.622.2±4.42.3±0.6
图5是在未分级分离的全肝脏细胞悬浮液中，表达表面标志CD14、CD34、CD38、CD45和血型糖蛋白A(GA)的细胞百分比。注意，为了保持刻度，GA数据以右轴标绘。图6是在最初的细胞悬浮液中表达甲胎蛋白以及其它抗原性标志的细胞百分比。平均值±SEM指甲胎蛋白(AFP)以及特异的细胞表面标志(CD14、34、38、45和血型糖蛋白A)阳性的细胞百分比。显然，血型糖蛋白A(GA)阳性细胞(即，红系细胞)代表细胞量的主要成分，但在AFP阳性细胞中却是无足轻重的部分。
图7(上部)是甲胎蛋白和清蛋白的共表达。在有或没有使用Percoll分级分离的，目的是选择性清除红细胞的胎儿全肝脏细胞悬浮液中，甲胎蛋白(左边)和清蛋白(右边)的表达。共表达清蛋白的AFP阳性细胞百分比也提高到80.5±8.2％，并且共表达AFP的清蛋白阳性细胞比例提高到89±3.1％，尽管哪一个变化在统计学上都不够显著。
图7(下部)是Percoll分级分离缩小体积对甲胎蛋白和清蛋白共表达的影响。既表达甲胎蛋白又表达清蛋白的细胞比例，以AFP或清蛋白阳性细胞百分比来表示。使用Percoll分级分离，红细胞清除和红细胞不清除的细胞数据均绘出。因而，当通过Percoll分级分离清除细胞悬浮液中的红细胞时，表达AFP的细胞比例显著地提高到12.9±1.9％，并且表达清蛋白的细胞比例显著地提高到12.1±2.3％。
本方法关于携带表面标志的细胞比例之结果见表3，并一同给出AFP染色阳性的每个亚组的比例。表3在清除红细胞后的全肝脏细胞悬浮液中CD阳性群的百分比以及它们当中又为AFP阳性的百分比CD14 CD34 CD38 CD45 GA红细胞被清除在群中的％ 7.4±1.3 3.4±0.5 4.8±0.9 8.2±0.327.5±4.7AFP阳性％ 89.8±1.377.1±2.953.5±7.232.5±1.3 1.8±0.9图8是胎儿全肝脏细胞悬浮液的针对共表达CD14、CD38和AFP的FACS分析。双变量散射图谱显示CD14(纵坐标)三色染色对CD38(横坐标)FITC染色的分布。设置了阈值，以CD14和CD38信号选择特定的细胞分组。接着，将其用于显示每一个这些亚组中AFP染色的强度。该AFP结果显示，通过选择CD38阳性或CD14阳性细胞，获得对AFP的高水平富集。从完整的细胞悬浮液(30000个细胞)所产生的AFP信号，显示在左下。在大多数情况下，AFP在通过细胞表面标志所选择出的亚组中是以连续分布存在的，并且在阳性范围内染色显示强的细胞，具有明显的优势。然而，共表达AFP的CD38阳性细胞，其分布独特。在CD38阳性细胞中，对AFP共表达的双模式分布是显而易见的，其中的两个明显不同的细胞组是显而易见的，一组对AFP阳性，另一组对AFP阴性。
这些结果显示在胎儿肝脏组织的单细胞悬浮液(即，最初的细胞悬浮液)中，甲胎蛋白(AFP)存在于7％的细胞。发现针对血型糖蛋白A(血红细胞，即红细胞上的一种抗原)的抗体可鉴定不表达AFP的细胞亚群。因而，从打算表征肝祖先的细胞中，将表达该抗原的细胞(即，红细胞)排除在外。CD38抗原鉴定出的细胞群，显著地提高了AFP阳性细胞的比例(即，相对于未分级分离样品中的比例，大于超过7倍)。根据是否有分子片段(由拼接变异体所编码)存在，这两个抗原均显示多种异体形式。已经有鉴定多种异体形式的抗体可供使用。
发现造血祖先细胞的典型标志CD34，也存在于表达AFP的许多细胞上。CD34阳性细胞的分选导致AFP阳性细胞的富集，至少超过在最初的细胞悬浮液中所存在的9倍(在CD34阳性细胞中67％在最初的细胞悬浮液中7％)。然而，富集AFP阳性细胞的最有效的单种抗体是CD14，它可将这些细胞的比例，与最初的群相比，提高超过11倍(81％7％)。
看起来，通过使用表面标志的组合，就能够将AFP阳性细胞的产率提高。因而，对AFP与所选表面标志组合共表达的程度进行了确定，以建立细胞内标志的选择可被提高的程度。数据表示为表达表面标志的AFP阳性细胞的比例(称作AFP阳性细胞的“产率”)，以及在被表面标志限定的群中出现的所有AFP阳性细胞的比例(称作对AFP阳性细胞的“富集”因子)。CD14、CD34和CD38的组合的结果，见表4，并一同给出来自单个标志的结果，以便比较。表4CD14CD34 CD38 CD14+CD38CD14+CD38富集80.6±2.6 66.7±4.7 53.8±4.5 66.9±3.568.2±3.9产率39.8±2.6 26.9±4.4 22.0±2.7 50.6±2.752.2±5.5富集表达任一(或全部两个)表面标志、同时也是AFP阳性的细胞百分比产率也表达一种或全部两种表面标志组合的所有AFP阳性细胞的百分比图9表示选择CD14和CD38是如何富集AFP阳性细胞的。通过选择对标志CD38和CD14的表面标记反应阳性的细胞，将从胎儿肝脏制备的细胞悬浮液中AFP阳性细胞的比例大幅度地提高。这两个标志的组合所产生的对含AFP细胞的富集，明显优于单独采用其中一种标志时所产生的对含AFP细胞的富集。
图10是人肝祖先细胞的荧光显微镜图。将来自胎儿肝脏的典型肝祖先细胞染色以测定AFP的含量。细胞的大小表明早期祖先和更晚期的肝祖先均存在。对AFP染色阳性的细胞，其形态是可变的，并且涵盖了来自胎儿肝脏(而不是成年肝脏)细胞悬浮液中细胞大小和形态的所有范围。最大的AFP阳性细胞，大约12-15μ，也比成熟肝脏细胞(大小范围在20-50μ)小许多。
图11是通过AFP的表达选择出的典型细胞。对CD14染色阳性的细胞(右边)是肝胚细胞所特有的性质。对表明标志染色阴性的细胞较小，在大小和形态上与早期肝祖先相一致。在所有情况下，一定比例的AFP阳性细胞没有显示用于本研究的任何表面抗体的表达。这些AFP阳性“无效”细胞的形状，见图11，在该图中，可将它们与从相同悬浮液分选的CD14阳性/AFP阳性的细胞形状进行比较。很清楚，虽然所有两种细胞类型都是AFP阳性，表面抗原染色阴性的细胞一致地比CD14阳性细胞小和更不复杂。
因而，很可能用于分选肝祖先的标志为血型糖蛋白A-、CD45-、ICAM+，以及一种或多种CD14+、CD34+、CD38+、CD117+、二倍体、无粒细胞(通过侧向散射)、小于15μ(通过前向散射)。所分选的这些细胞的表型为小细胞(小于15μ)、几乎没有细胞质(高细胞核/细胞质比)、清蛋白+和/或AFP+++。
VII.通过共聚焦显微镜表征在胎儿和成人肝脏中的表达甲胎蛋白的细胞共聚焦显微镜用于获得来自人胎儿及成年、表达甲胎蛋白的细胞的图像。该方法使得人们能够观察这些细胞的形态和大小并直接显示细胞内蛋白质，诸如AFP和ALB的位置以及膜表面标志诸如CD34和CD38的位置。
图12是表达甲胎