专利名称：人肝脏祖先的制作方法成熟肝脏基本的结构和功能单位是腺泡，其横断面的组织形式象围绕两个独特的血管床的轮子3-7套肝三联(每套有一个门小静脉、肝小动脉和一个胆管)位于外周、中央静脉位于中心。肝脏细胞彼此组织构成细胞板，在其两侧排列有帘式内皮膜，形成一系列的与门脉管和中央血管系统相邻近的窦状隙。最近的数据表明肝闰管(Canalsof Herring),即位于每个肝三联周围的小管,在整个区带I产生细小的小管，它们延伸并切入肝板，形成与瓶刷子相似的结构式样。(Theise, N. 1999,肝脏学(Hepatology), 30 1425-1433)。一个称作迪塞间隙(Space of Disse)的狭窄空间，一直沿着窦状隙将内皮膜与肝脏细胞分隔开。作为这种组织结构的结果，肝脏细胞具有两个基部区(其中的每一个面向一个窦状隙)和一个顶部区。基部区接触血液并参与血浆成分的吸收和分泌，而顶部区则形成专门分泌胆汁盐的胆汁小管并通过交联网络与胆管相连。血液从门小静脉和肝小动脉流过窦状隙到达末端肝小静脉和中央静脉。基于这种循环形式，将腺泡分为三个区带区带1，门周区；区带2，腺泡中区；和区带3，中心周围区。增殖潜能、形态规范、(染色体)倍性以及大多数肝脏特异性基因与区带定位相互关联(Gebhardt, R 等人，1988, FEBS Lett. , 241 :89-93 ；Gumucio, J. J. , 1989,Springer International, Madrid ；Traber, P.等人，1988,胃肠学(Gastroenterology),95:1130-43)。跨腺泡的血液成分(包括氧气)浓度梯度以及沿着从肝三联到中央静脉的血流方向承担这种区带化的一部分，例如，糖酵解和糖异生的彼此区室化。然而，门周区带形成中的间隙连结蛋白质(连结蛋白26)以及中心周围区带形成中的谷氨酰胺合成酶(这里仅列举两个例子)对这样的梯度并不敏感，而更代表了大多数组织特异性基因，并看来好象取决于微环境中对细胞或非血流变量而言为内源性的因子。除了肝脏细胞、胆管上皮细胞(胆管细胞)和内皮细胞外，位于门脉和中央静脉区段间的区域含有其它细胞类型，诸如Ito细胞和库佛细胞(KupfTer cell)。这些细胞在肝脏的疾病状态中扮演突出的角色，特别是在炎症和纤维化中，但是表面看来，它们对正常器官主要的自身稳定功能的贡献并不大。肝脏是盲肠囊(形成自前肠尾和原始横隔，它们内脏间充质的一部分)汇聚发育的结果。肝脏细胞的形成，很可能是通过成纤维细胞生长因子，始于内胚层上皮与生心中胚层的相互作用之后。接着，注定为肝脏细胞的细胞增殖并以索状方式穿入原始横隔的间充质，形成肝脏原基。上皮-间充质的直接相互作用在肝脏的这些早期发育阶段中是至关重要的，并决定哪些细胞将分别成为肝脏细胞或胆管细胞和帘式内皮膜。间充质特异性基因hlx和jumonji的突变将阻断肝脏发育，从而表明来自该组织的贡献的重要性。在肝脏发育的早期，肝脏含有原始的肝脏细胞簇(与缺乏基底膜的连续内皮和丰富的造血细胞相邻接)。由于内皮细胞转化为不连续的帘式内皮膜，所以脉管系统，特别是门脉管系统随着基底膜的产生变得更加发达。门小间隙可以提供胆管发育的触发器，并且由于它包围着门小静脉、肝小动脉和胆管，所以形成了肝三联。很可能是为了响应诸如C_CAM105、Agp 110、E-钙粘蛋白和连结蛋白这样的组织-形成分子在数量和分布上的变化，未成熟肝脏细胞快速增殖并形成实质板，同时伴有绝大部分(但不是全部)造血细胞再定位于骨髓。最近的研究提示某些造血细胞祖先存留于休眠的成年啮齿类的肝脏中，并且已从成年人类和鼠的肝脏中分离出造血干细胞(Crosbie, 0. M.等人，1999,肝脏学(Hepatology), 29 :1193-8)。在啮齿类中成熟的物理组构是在出生后的几周内完成的，在人类中是在头几年。代谢的区 带化是根据不同的酶采取多少有些不同的安排而建立的，但在出生后的时期代谢的区带化变得明显起来。干细胞和定向祖先干细胞被定义为自我复制、多能，即产生的子代细胞多种命运的、能够广泛地发育，并能够再构建一种或多种组织的原始细胞。大多数关于干细胞的文献，源自有关胚胎方面的文献或者源自关于造血、表皮或肠组织方面的文献。最近，对定义进行了修改，以识别特定种类的干细胞。将具有参与所有细胞类型发育潜能的那些细胞称为全能干细胞，其中包括受精卵和上至8细胞阶段(桑椹胚)的正常胚胎细胞。胚胎干细胞也叫做“ES”细胞，包括源自胚泡中全能的正常细胞之永久细胞群，首先报道它们在二十世纪八十年代早期。ES细胞系可在体外培养并保持全能性。如果将ES细胞引入到无免疫应答宿主中的任何部位，但不包括子宫，将导致肿瘤发生，形成畸胎癌。但是，当将它们注射回到正常的胚泡中时，它们能够恢复胚胎发育并参与形成正常的但却是嵌合的小鼠。尽管已从多种物种(小鼠、大鼠、猪等)建立了 ES细胞系，但只有小鼠系统，通过将培养的修饰细胞与胚泡合并、接着将该胚泡植入到假孕宿主中，已被常规地用于产生具有新表型(敲除、转基因)的动物。可以将显示ES细胞的多种特性的胚胎生殖(EG)细胞系在体外直接从原基生殖细胞群中分离出来。与ES细胞一样，当将EG细胞注射到无免疫应答的小鼠中时，EG细胞形成畸胎癌；当将EG细胞注射到胚泡中时，其对嵌合体包括生殖细胞系的形成作出了贡献。认定干细胞是多能细胞，它的遗传潜能被限制于有限种类的细胞类型、但具有广泛的生长潜能。越来越多的证据诸如来自端粒酶领域的证据提示认定干细胞并不能自我复制，也就是它们的后代具有比其亲代更小的生长潜能。认定干细胞通过将它们的遗传潜能限制在单一种命运(例如肝细胞)，产生失去多能性的子代细胞，并称其为定向祖先。在肝谱系中，有定向肝细胞祖先和定向胆管细胞祖先。最近，大量公布的实验报道了可从人的胚胎建立人ES细胞培养物。有人建议可以将这些人ES细胞注射到组织中，希望它们能够再造损坏的器官和组织。由于发现当将ES和EG细胞注射到除子宫(见上)以外的部位时形成肿瘤，所以计划将人ES细胞接种到患者中并不现实，并对患者带来产生肿瘤的严重可能性。为了克服这种僵局，某些研究小组正在努力进行这样的计划，即在限定的微环境条件下分化ES细胞，使其成为能够安全地接种到患者中的认定干细胞。例如，在产生造血祖先方面已有一些成功的措施。但是，如果将培养物接种到患者中，仍然担心培养物中残留的ES可能带来发生肿瘤的危险性。总之，在发育生物学研究将胚胎发育过程中控制决定细胞命运的谜底揭示出来之前，ES细胞仍将作为一种实验手段，而几乎没有希望用于细胞或基因治疗的临床项目。围绕肝脏干细胞的争论在肝脏的细胞生物学领域，在成年的正常肝脏中是否存在干细胞是有巨大争议的论题。以下总结了在该领域中相互竞争的几种流行的模型。斜体字表示在不同模型中的关键概念。本领域的一些专家相信，肝脏干细胞仅存在于胚胎组织，而在成年肝脏中没有干 细胞，而且所有成熟的肝脏细胞平等地参与肝脏的再生过程(法博Farber，E.，1992，见多种细胞类型在肝癌发生中的作用(The Role of Cell Types inHepatocarcinogenesis.)，S. A. E.编辑，Academic Press, New York)。法博Farber模型认为所有成熟的实质细胞在表型上是共相等的，并且在肝脏中，只是由于微环境造成了已知的生长潜能和基因表达的不均一性。Farber提出在致癌条件下，成年的实质细胞逆分化并变为肿瘤细胞。该模型统治肝脏肿瘤发生领域几十年并在肝脏再生研究中仍具有影响。另一些专家相信所有的肝脏细胞都是干细胞(肯尼迪Kennedy，S.等人，1995，肝脏学，22 :160-8 ；Michalopoulos, G. K.等人，1997，科学(Science)，276 :60-6)。这些研究者相信所有的实质细胞是相互对等的，是高度可塑的，其基因表达仅由微环境支配。在适当的致癌条件下，设想成熟的实质细胞都会变为能够随后转变为肿瘤细胞的干细胞。沉默干细胞模型是基于Willson和Leduc (Willson，J.W.等人，1958，病理细菌学杂志(J. Pathol. Bacteriol. )，76 :441-449)的研究建立的。正如在造血领域中，这个概念是从对肝癌发生的广泛研究中获得大多数承认的(Marceau，N.，1994，Gut. ,35 :294-6)。这些研究者相信祖先细胞，包括双潜能祖先细胞，能够继续存在于成年组织中，但是这些研究者认为它们属于稀少的残留物或者来自胚胎发育细胞群的残余。这些研究者假设祖先在正常或再生肝脏的功能发挥中不起任何作用，但只在疾病状态中起作用(Overturf K，1999，美国病理学杂志(AmericanJournal of Pathology), 155 :2135-2143)。这也就是假设它们是“沉默的”，与肌肉中的星形细胞相似。由于其与众不同的细胞核形状，这些细胞被描述为“卵形细胞”。它们不大(9 左右)，并且在细胞表面表达特征性的抗原谱。所有成熟肝脏的细胞在生长和基因表达方面被假设为是共相等的，而且基因表达的不均一性仅由细胞的微环境所决定。沉默干细胞模型的支持者强烈反对实质细胞从门周到中央周围部位移动的任何想法。肝脏细胞和其它肝祖先的重要性被认为仅与疾病状态、特别是癌症发生相关。因而，这些研究者将精力集中在用多种致癌性损害处理的动物中的候选祖先上。这些研究表明，“卵形细胞”在再生条件下或者在轻度至中度损伤的条件下不形成快速增殖细胞的可识别实体。只是在肝脏受到相当严重的损伤后，才观察到大量的增殖性卵形细胞群(Grisham, J. W.等人，1997，见干细胞(Stem Cells)，C. S. Potter 编辑，Academic Press,London,233-282)。基于肝脏细胞流动的模型(Arber, N.等人，1988,肝脏(Liver), 11 :347-51),遭到了尖锐的批评，并且基本上已被忽视(Jurtle, R. L. , 1995,肝脏再生与癌症发生分子和细胞机理(肝脏的再生与肿瘤的生成分子和细胞机理LiverRegeneration andCarcinogenesis Molecular and Cellular Mechanisms), AcademicPress, New York)。该模型假定，位于每个肝三联的干细胞区室产生“流向”中央静脉的成年实质细胞。流动过程使子代细胞与独特的微环境接触，从而引起细胞表型的改变。另外，假设微环境是至关重要的表型决定基。大部分研究者不赞成该模型，因为研究表明再引入肝脏的标记供体细胞并不移动(Kennedy，S.等人，1995，肝脏学，22 :160-8)，而该模型却与此不一致。然而，即使在提供最确切证据以反对流动模型的那些研究中，也不清楚微环境或谱系的位置是否影响用于供体细胞的标记之表达。而且，最近Theise及其同事发现(Theise,N. , 1999,肝脏学，30 :1425-1433)，一直被怀疑与肝祖先相关的肝闰管至少在区带I中伸出遍及肝板的小管，流动肝脏假说很可能会在此之后被重新光顾。Reid及其同事支持肝脏是一个干细胞和正在成熟的谱系系统(西格Sigal, S.H.等人，1992，美国生理学杂志(Am J Physiol. )，263 :G139_48)。他们提出，组织由干细胞或早期的祖先细胞群组成结构为正在成熟谱系的，类似泉涌的涌入流(fed)(布利Brill, S.等人，1993, Proceedings of the Society for ExperimentalBiology&Medicine,204 :261-9)。组织被定义为从“年轻到中年再到老年的不断变化的细胞”。成熟的过程伴随着细胞在大小、形态、抗原谱、生长潜能和基因表达方面的谱系位置依赖性变化。这些变化被假设为是由细胞的自主性变化之组合引起的，并不依赖于微环境及微环境诱导的变化；这里所说的微环境包括营养物、气体交换(氧气、CO2)、pH、激素、细胞-细胞相互作用及细胞外基质化学。表I本发明涉及一种人肝脏祖先。分离和低温保藏人肝脏祖先的多种方法，其中包括处理人肝脏组织以提供基本上是单细胞的悬浮液，该悬浮液包含存在于人肝脏的一种或多种细胞谱系的祖先和非祖先；将悬浮液进行缩小体积处理，该步骤显著地减少悬浮液中非祖先的数量从而提供富集祖先的悬浮液，这些祖先显示与一种或多种细胞谱系中的至少一种相关的一种或多种标志；然后从所述的缩小体积悬浮液选择这样的细胞，这些细胞本身、它们的后代或者其更成熟形式表达与一种或多种细胞谱系中的至少一种相关的一种或多种标志。