专利名称：肝脏的类器官、其用途以及获得它们的培养方法肝脏的基本结构单位是肝小叶。每个小叶由肝细胞板组成，所述肝细胞板内衬有向中央输出静脉呈放射状排列的血窦毛细血管。肝小叶大致呈六边形，六个角中的每一个由存在的肝门三联体(门静脉、胆管和肝动脉)划分。尽管肝细胞是主要的肝脏薄壁细胞类型，它们与胆管上皮细胞(cholangiocyte)(胆管上皮细胞(biliary epithelial cell))、内皮细胞、窦内皮细胞、库普弗(Kupffer)细胞、自然杀伤细胞和肝星形细胞协同起作用。该复杂的结构是肝功能的关键。肝脏干细胞的存在仍然是有争议的。一方面，某种损伤发生时，肝脏中的组织维持和肝脏再生并非由干细胞而是由成熟细胞(肝细胞或胆管上皮细胞)的分裂驱动的。然而，抑制肝细胞增殖的肝脏受损模型同样表明该器官响应于损伤而再生的能力。这表明可以将肝脏看作是具有兼性干细胞的器官。目前，从肝细胞或通过胚胎干细胞(ES)或诱导性多能干细胞的分化而获得的肝脏培养物不能更长时间的扩增和自我更新。最近，在小肠中鉴定出特异性表达于循环的隐窝基底柱状(CBC)细胞中的基因Lgr5，所述隐窝基底柱状细胞是散布于Paneth细胞之间的小细胞(Barker et al.，2007.Nature449:1003-1007)。利用将GFP/他莫昔芬(tamoxifen)诱导的Cre重组酶盒整合至Lgr5基因座的小鼠，甚至是在Cre诱导14个月之后，通过世系追踪评估表明，Lgr5+CBC细胞构成能够产生上皮细胞的全部细胞类型的多能干细胞。 最近发现除了 Lgr5,还有Lgr6而非Lgr4是成体干细胞特有的标志物。Lgr5表达于大脑、肾脏、肝脏、视网膜、胃、肠、胰腺、乳腺、毛囊、卵巢、肾上腺髓质和皮肤的干细胞中，而Lgr6表达于大脑、肺、乳腺、毛囊和皮肤的干细胞中。在此我们开发了培养成体肝脏祖细胞和获得肝脏的类器官的方法，所述肝脏的类器官表现出更长时间的维持，能够分化成肝细胞和胆管上皮细胞谱系，并且维持分离的肝脏碎块的基本生理机能。发明简述本发明提供了用于获得肝脏的类器官的方法，其中所述方法包括在第一“扩增”培养基(在此又被称为EM)中培养细胞，优选地，接着在第二“分化”培养基(在此又被称为DM)中培养细胞。肝脏的类器官可以通过培养单个Lgr5+干细胞，含有至少一个Lgr5+干细胞的细胞群和/或肝脏碎块获得。在此，其中“培养基中的细胞”是指如下含义:包括单个Lgr5+干细胞，含有至少一个Lgr5+干细胞的细胞群和/或肝脏碎块。在一个实施方案中，扩增培养基包含EGF、Wnt激动剂、FGF和烟酰胺。优选地，Wnt激动剂是R-spondinl，因而扩增培养基被称为“ERFNic”。特别优选的扩增培养基还包含HGF 且被称为 “ERFHNic”。在一个实施方案中，分化培养基包含EGF、TGF-0抑制剂、FGF和Notch抑制剂。在一个实施方案中，TGF-β抑制剂是Α83-01和/或Notch抑制剂是DAPT。该分化培养基在此被称为“EAFD”，并且是本发明优选的分化培养基。任选地，FGF可由HGF替代，或可选择地，分化培养基中可同时含有或不含FGF和HGF。还可以添加地塞米松。在优选实施方案中，细胞最初可以培养于还包含Wnt和Noggin的扩增培养基中，例如含有EGF、Noggin、R-spondin和Wnt，以及任选地FGF、HGF和烟酰胺的“ENRW”培养基。本发明人发现该培养基对于开始几日刺激细胞的初期扩增是最佳的。因而，该第一扩增培养基在此有时又被称为EM1。在一些实施方案中，大约I日、2日、3日、4日、5日、6日、7日或更久，例如2周、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更久，14个月或更久之后，将如七和Noggin去除。然后可以在如以上所述不含Wnt或Noggin的本发明的扩增培养基中扩增细胞。该第二扩增培养基在此有时又被称为EM2。在一些实施方案中，在EM2中培养细胞大约I日、2日、3日、4日、5日、6日、7日或更长的时间，如3、4、5、10、20或更多周。然后可以将培养基更换为如以上所述的最佳分化培养基，其包含TGF- β抑制剂和Notch抑制剂。通常，分化培养基不含fct激动剂、R-spondin或烟酰胺。这促进细胞向成熟肝细胞和胆管上皮细胞分化。这些细胞适合于移植到人或动物。本发明还提供了肝脏的类器官。本申请首次描述了离体培养肝脏的类器官。 发明详述第一方面，本发明提供了获得和/或培养肝脏碎块或肝脏的类器官的方法，其中所述方法包括:在存在培养基的条件下，与细胞外基质相接触培养上皮干细胞和/或含有所述上皮干细胞的分离的组织碎块，所述培养基包含添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基:作为促细胞分裂生长因子的表皮生长因子和FGF，所述FGF能够结合FGFR2或FGFR4且优选FGFlO,烟酰胺，以及优选地,Wnt激动剂，优选R-spondin 1、R_spondin2、R_spondin3或R-spondin4和/或Wnt_3a。优选地,还添加HGF。例如，在一个实施方案中，本发明提供了获得和/或培养肝脏碎块或肝脏的类器官的方法，其中所述方法包括:在存在培养基的条件下，与细胞外基质相接触培养上皮干细胞和/或含有所述上皮干细胞的分离的组织碎块，所述培养基包含添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基:BMP抑制剂，Wnt激动剂，作为促细胞分裂生长因子的表皮生长因子、FGF(其能够结合FGFR2或FGFR4，优选FGF10)和HGF，胃泌素，烟酰胺，B27，N2和N-乙酰半胱氨酸。本发明人惊奇地发现，本发明的方法允许培养上皮干细胞和/或来自含有所述干细胞的肝脏的分离的碎块，同时保留了保持未分化表型和自我维持能力的干细胞的存在。更令人惊奇地是，观测到本发明的方法允许单个分离的上皮干细胞在缺乏干细胞壁龛时长成肝脏的类器官。干细胞存在于人和小鼠成体的许多器官中。虽然成体干细胞在个体组织中的精确特性可能存在很大差异，成体干细胞共有至少以下特性:它们保持未分化的表型；其后代可向相关组织中存在的全部谱系分化；它们终生保持自我维持的能力；以及它们能够使相关组织受损后再生。干细胞存在于特化的部位，干细胞壁龛，其提供了维持所述干细胞群的适当的细胞间接触和信号。上皮干细胞能够形成组成上皮细胞的不同细胞类型。一些诸如皮肤或肠的上皮细胞表现出快速的细胞更新，表明存在的干细胞必定连续地增殖。另一些诸如肝脏或胰脏的上皮细胞在正常条件下表现出非常缓慢的更新。可以通过许多不同的实验方案来进行肝脏上皮干细胞的分离。虽然本发明人并不希望受任何特定理论的束缚，在此假设组织受损时存在于肝脏内的干细胞群负责肝脏再生。认为激活时负责该受损-应答再生的细胞群表达标志物Lgr5。通过用肝毒性化合物CC14注射敲入Lgr5-LacZ的小鼠来模拟肝脏损伤，本发明人首次证实肝脏损伤诱导Lgr5表达于肝脏中活跃再生的位置处(参见实施例4)。本发明人还表明注射fct激动剂R-spondin引起肝管中的Wnt信号通路表达上调。虽然本发明人并不希望受任何特定理论的束缚，在此假设再生干细胞/祖细胞在肝脏损伤之后可以由fct信号通路激活。如果需要的话，如在此所述，可以接着从肝脏/肝脏碎块中分离Lgr5阳性细胞。因而本发明提供了从肝脏获得/分离Lgr5+细胞的方法，包括诱导肝脏损伤或通过例如用R-spondin刺激Wnt信号通路。这是有用的，因为在一些实施方案中，Lgr5+细胞是体外获得肝脏的类器官的起点(虽然本发明的培养基的应用允许通过添加诸如R-spondin的Wnt激动剂来产生Lgr5+细胞，因而为了实施本发明，从肝脏获得Lgr5+细胞并非是必需的)。还提供了通过该方法获得的Lgr5+细胞。在一些实施方案中，这样的细胞优选不表达星形细胞标志物，例如SMA。相反地,这样的细胞优选表达一种或多种肝脏祖细胞标志物或干细胞标志物，如Sox9。优选地，与成体肝脏相比，一种或多种肝脏祖细胞标志物或干细胞标志物(如Sox9)的表达在所述细胞中上调。本发明还提供了用于再生肝脏的方法，包括刺激Wnt信号通路。这样的方法在治疗肝脏病症中是有用的。可以在体内、离体的分离的肝脏或者体外的肝脏碎块或肝细胞群中，通过损伤或通过刺激fct信号通路在肝细胞中进行Lgr5表达的诱导。在离体或体外进行Lgr5表达诱导的实施方案中，可以将Lgr5阳性细胞通过任何合适的方法给予有需要的患者，例如通过注射或通过植入。在一些实施方案中，将植入的细胞包含于生物相容的基质中。在一些实施方案中，在治疗中使用之前，将细胞离体扩增。在本发明的优·选方法中，将所述上皮干细胞从肝脏碎块或肝脏胆管分离，更优选地，从胆管组织分离。胆管组织的分离方法是本领域技术人员来所熟知的。例如，胆管可如在此所附的实施例中所描述的从肝脏分离。简而言之，可以在冷(4-10° C)的培养基，优选改进型DMEM/F12 (Invitrogen)中清洗成体肝脏组织，然后将组织破碎成大约5mm的块，然后再用冷解离缓冲液(含有胶原酶、分散酶和FBS的DMEM培养基)清洗。优选地，用解离缓冲液于大约37° C下孵育组织碎块约2h。然后，可以用IOml移液管将组织碎块充分悬浮于IOml冷(4-10° C)的分离缓冲液中。优选地，将含有死细胞的第一上清液丢弃，并且优选用解离缓冲液(如10-15ml)悬浮沉淀。进一步充分悬浮组织碎块之后，上清液中富集了胆管。可以以这种方法获得含有胆管的上清液，并且在显微镜下收集胆管并将其保存于冷培养液(DMEM+5-10%FBS)中。可以重复该方法，直到收集了至少10-20个胆管/孔。然后，可以将分离的胆管沉淀。优选地，分离的胆管以大约20个胆管/孔的比率接种于50ul基质胶(matrigel)中。与成熟的肝细胞在死亡之前短时间内汇合生长相反，本发明分离的肝脏上皮干细胞自我更新且无限期地生长。已发现自我更新的细胞群是能够在其表面表达Lgr5的细胞群。Lgr5阴性细胞不会自我更新。术语“自我更新”应当理解为表示细胞自我繁殖同时保持本发明细胞的原始增殖和分化特性的能力。这样的细胞通过分裂增殖形成克隆，所述克隆进一步分裂成克隆并由此无需外部干预而扩增成细胞群的大小，而不会进化成分化潜能更受限的细胞。优选的方法基于本发明的肝脏干细胞在其表面表达Lgr5和/或Lgr6的事实；这些蛋白属于大的G蛋白偶联受体(GPCR)超家族(参见例如W02009/022907，其内容全部并入本文)。Lgr亚家族在携带对配体结合重要的大的富含亮氨酸的胞外域上是独特的。因而优选的方法包括如前所述的由所述上皮组织制备细胞悬浮液，将所述细胞悬浮液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物(如抗体)相接触，将Lgr5和/或Lgr6结合化合物分离，以及从所述结合化合物中分离干细胞。优选的是，从分离的胆管中手动产生含有上皮干细胞的单细胞悬浮液。优选地，将通过手动破坏这种方法产生的小的类器官碎块以大约1:6的比率分开。如果必要的话，可以在胰蛋白酶中以大约1:2稀释率短时间(仅2或3分钟)孵育这样的碎块。已发现在此阶段，用胰蛋白酶处理上皮干细胞得到非常低的存活率:如果将细胞分成独立的细胞，那么只有表达Lgr5的那些细胞存活。这部分非常少(大约占总细胞群的12%)。优选的Lgr5和/或Lgr6结合化合物包括抗体,如特异性识别且结合Lgr5或Lgr6的细胞外结构域的单克隆抗体，如包括小鼠和大鼠单克隆抗体的单克隆抗体(参见例如W02010/016766，其内容整体并入本文)。利用这样的抗体，例如借助于本领域技术人员所了解的磁珠或通过荧光激活细胞分选术，可以分离表达Lgr5和/或Lgr6的干细胞。利用本发明的方法，分离表达Lgr5和/或Lgr6的一个单细胞且将本发明的方法应用其上是可能的。因此，肝脏的类器官可源自一个单细胞。干细胞壁龛
优选地，在模拟所述干细胞天然存在的至少一部分细胞壁龛的微环境中培养分离的干细胞。可以通过在生物材料的存在下培养所述干细胞而模拟这种细胞壁龛，所述生物材料如代表控制干细胞命运的关键调控信号的基质、支架和培养基底。这样的生物材料包括天然的、半合成的和合成的生物材料，和/或其混合物。支架提供了二维或三维的网状物。适合于这种支架的合成材料包括选自多孔固体、纳米纤维和水凝胶的聚合物，所述水凝胶如，例如肽，包括自组装的肽，由聚乙二醇磷酸酯、聚乙二醇延胡索酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚纤维素醋酸酯和/或它们的共聚物组成的水凝胶(参见例如Sahaet al., 2007.Curr Opin Chem Biol.11 (4):381 - 387;Saha et al., 2008.BiophysicalJournal95:4426 - 4438; Little et al.，2008.Chem.Revl08, 1787 - 1796)。如技术人员所熟知的，机械性能如，例如支架的弹性，影响干细胞的增殖、分化和迁移。优选的支架包括生物可降解的(共)聚合物，其在植入受试者之后由天然存在的成分取代，例如以促进组织再生和/或创伤愈合。更优选地，所述支架在植入受试者之后基本上不引起免疫应答。所述支架补充有天然、半合成或合成的配体，其提供了干细胞增殖和/或分化和/或迁移所需的信号。在优选实施方案中，所述配体包括确定的氨基酸片段。所述合成聚合物的实例包括Phironic F127嵌段共聚物表面活性剂(BASF),以及Ethisorb (Johnson andJohnson)。
细胞壁龛部分由干细胞和周围细胞以及由细胞在所述壁龛中产生的细胞外基质(ECM)决定。在本发明的优选方法中，将分离的肝脏碎块或分离的胆管或上皮干细胞附着于ECM。ECM由多种多糖、水、弹性蛋白和糖蛋白组成，其中所述糖蛋白包括月父原蛋白、桌蛋白(entactin/nidogen)、纤连蛋白和层粘连蛋白。ECM由结缔组织细胞分泌。已知包含不同组分的不同类型的ECM，包括不同种类的糖蛋白和/或糖蛋白的不同组合。所述ECM可通过在去除这些细胞并添加分离的肝脏碎块或分离的胆管或分离的上皮干细胞之前，通过在容器中培养产生ECM的细胞如成纤维细胞来提供。产生细胞外基质的细胞的实例是主要产生胶原蛋白和蛋白聚糖的软骨细胞，主要产生IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、间质前胶原蛋白和纤连蛋白的成纤维细胞，以及主要产生胶原蛋白(1、III和V型)、硫酸软骨素蛋白多糖、透明质酸、纤连蛋白和肌腱蛋白-C的结肠肌纤维母细胞。可选择地，通过商购提供所述ECM。商购可获得的细胞外基质的实例是细胞外基质蛋白(Invitrogen)和来自Engelb reth-Holm-Swarm (EHS)小鼠肉瘤细胞的基膜制剂(如Matrigel (BDBiosciences))。可以使用合成的细胞外基质材料,如ProNectin (Sigma Z378666)。如果需要的话，可以使用细胞外基质材料的混合物。利用ECM培养干细胞提高干细胞的长期存活和未分化的干细胞的持续存在。缺乏ECM时，不能更久的培养干细胞培养物且未观测到未分化的干细胞的持续存在。此外，ECM的存在允许培养三维的组织类器官，其在缺乏ECM时无法培养。一般将细胞外基质材料涂布于细胞培养皿，但是(另外地或可选择地)可以以溶液提供。可以使用约lmg/ml,或约I μ g/cm2至约250 μ g/cm2或约I μ g/cm2至约150 μ g/cm2的纤连蛋白溶液来涂布细胞培养皿。在一些实施方案中，用纤连蛋白以8 μ g/cm2至125 μ g/cm2涂布细胞培养皿。本发明方法中使用的优选ECM包含至少两种不同的糖蛋白，如两种不同类型的胶原蛋白或胶原蛋白和层粘连蛋白。ECM可以是合成的水凝胶细胞外基质或天然存在的ECM。更优选的ECM由Matrigel (BD Biosciences)提供,其包含层粘连蛋白、巢蛋白和胶原蛋白IV0本发明的组合物可包含血清或可以不含血清和/或不含血清替代物，如本文其他地方所述。优选地，培养基和细胞制备物符合FDA生物产品要求标准的在线GMP工艺以确保产品的连续性。培养基本发明中使用的细胞培养基包括受本文所提供的限制的任何合适的细胞培养基。细胞培养基一般包含许多成分，其对于支持所培养细胞的维持是必需的。考虑到以下公开的内容，本领域技术人员容易配制合适的成分组合。本发明的培养基通常是含有标准细胞培养成分的营养液，所述细胞培养成分如氨基酸、维生素、无机盐、碳源和缓冲液，如下文中更详细的描述。本发明的培养基一般在去离子蒸馏水中配制。一般在使用之前通过例如紫外光、加热、辐射或过滤来灭菌本发明的培养基以防止污染。可将培养基冷冻(如于-20° C或-80° C)以储存或运输。培养基可包含一种或多种抗生素以防止污染。培养基可具有内毒素，其含量低于0.1内毒素单位/ml或者0.05内毒素单位/ml。本领域众所周知确定培养基内毒素含量的方法。优选的细胞培养基是用基于碳酸盐的缓冲液缓冲至pH7.4(优选具有pH7.2-7.6或至少pH7.2且不高于pH7.6)的限定的合成培养基，同时在含有5%至10%的CO2,或至少5%且不超过10%的CO2，优选5%的CO2的空气中培养细胞。本领域技术人员根据普通常识可以理解，可在本发明的细胞培养基中用作基本培养基的培养基种类。可能适合的细胞培养基可商购获得，并且包括但不限于:达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)，最小必需培养基(MEM)，Knockout-DMEM(KO-DMEM)，Glasgow最小必需培养基(G-MEM)，伊格尔基本培养基(BME)，DMEM/Ham’s F12，改进型DMEM/Ham’s F12,伊思考夫改良杜尔贝可培养基和最小基本培养基(MEM)，Ham’s F-10, Ham’ s F_12，199培养基，以及RPMI1640培养基。优选的细胞培养基选自补充有谷氨酰胺、胰岛素、青霉素/链霉素和转铁蛋白的DMEM/F12和RPMI1640。在进一步优选的实施方案中，使用改进型DMEM/F12或改进型RPMI，其对于无血清培养物是最佳的且已含有胰岛素。在这种情况下，优选地，所述改进型DMEM/F12或改进型RPMI培养基补充有谷氨酰胺和青霉素/链霉素。.
在一些实施方案中，基本培养基包含改进型DMEM F12、羟乙基哌嗪乙磺酸、青霉素/链霉素、谷氨酰胺、N乙酰半胱氨酸、B27、N2和胃泌素。在一些实施方案中，培养由包含N2和胃泌素以及青霉素/链霉素的基本培养基开始，但是之后取出这些成分。例如，在一些实施方案中，N2和胃泌素 以及青霉素/链霉素存在于本发明的EMl培养基中，但是不存在于EM2或DM中。例如，在一些实施方案中，N2和胃泌素以及青霉素/链霉素存在于本发明的EMl和EM2培养基中，但不存在于DM中。在特别优选的实施方案中，基本培养基是改进型DMEM/F12或DMEM变型，所述DMEM变型中补充有青霉素/链霉素、N2、B27、谷氨酰胺和胃泌素。在优选实施方案中，基本培养基包含胃泌素。在一些实施方案中，基本培养基还包含NAc和/或B27。进一步优选的是，所述细胞培养基补充有纯化的天然、半合成和/或合成的生长因子，并且不含不明确的成分，如胎牛血清或小牛血清。各种不同血清替代物的制剂可以通过商购得到且是本领域技术人员所熟知的。使用血清替代物时，根据常规技术可以使用按培养基体积计约1%至约30%的血清替代物。扩增培养基(EM2):本发明一方面提供了细胞培养基，其包含添加以下成分的动物或人细胞的基本培养基或由添加以下成分的动物或人细胞的基本培养基组成:作为促细胞分裂生长因子的表皮生长因子和FGF，所述FGF能够结合FGFR2或FGFR4且优选FGF10，烟酰胺，以及优选地，Wnt激动剂，优选R-spondinl。该培养基被称为EM2。优选地，Wnt激动剂是R-spondinl。包含EGF、R-spondinl、FGF和烟酰胺的培养基在此被称为ERFNiC。在一些实施方案中，EM2培养基不含Noggin，更优选地，不含BMP-抑制剂。在一些实施方案中，EM2培养基不含Wnt，例如Wnt-3a。在一些实施方案中，除FGF之外还存在HGF。包含除FGF之外的HGF的优选培养基是 ERFHNic (EGF+R-spondin (优选 R-spondinl) +FGF (优选 FGF10) +HGF+ 烟酰胺)。本发明人发现，ERFHNic培养基是长期扩增细胞的最佳培养基。缺乏HGF时，细胞在培养基中保持存活不超过三个月。进一步地，与存在HGF所培养的细胞相比，缺乏HGF时，10代之后，细胞显示生长不利，如由更低的增殖率所证实的。具体地，15代之后，缺乏HGF的细胞不会以与存在HGF的细胞相同的速率长成类器官。因而，发现HGF对于在长期培养中维持良好的增殖率是必需的。因而本发明提供了利用本发明的ERFHNic培养基培养细胞至少2周，至少I个月，至少2个月，更优选地，至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少15个月、至少20个月、至少24个月、至少25个月、至少30个月或更久，例如3年或更久。在实践中，本发明的一些实施方案包括利用E2持续细胞的大约20-30代。例如，细胞可以分裂20-30次，一般一周一次。优选地，细胞会以每周约4倍或一周2次群体倍增的速率扩增。本发明进一步提供了利用本发明的ERFHNic培养基培养细胞至少10代，例如，至少11、至少12、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少60代，或者15至35代，例如大约20-30代。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂如Α83-01也存在于ΕΜ2培养基中。这在培养人细胞或类器官时特别有用。在一些实施方案中，Α83-01以400至600ηΜ的浓度存在，例如450-550ηΜ、470_530ηΜ或大约500ηΜ。在ΕΜ2中存在TGF-β抑制剂的实施方案中，优选不存在Notch抑制剂。扩增培养基(EMl):一方面，本发明提供了细胞培养基，其包含添加以下成分的动物或人细胞的基本培养基或由添加以下成分的动物或人细胞的基本培养基组成:EGF，BMP抑制剂，R-spondin和Wnt。优选地，BMP抑制剂是Noggin，并且EMl培养基被称为“ENRW” (EGF，Noggin,R-spondin和Wnt)。该培养基被称为EMl。本发明人发现包含Wnt和Noggin的培养基对于刺激细胞初期扩增是理想的。因而，在一些实施方案中，EMl培养基只使用I代或I周，但是同样设想EMl培养基可 使用大约一年，因为其对细胞无害。因而，在一些实施方案中，从第O日至第10日使用EMl培养基培养细胞，例如第0-7日，第0-6日，第0-5日，第0-4日，第0-3日，第0-2日，第0-1日，其中第O日是细胞从其来源组织分离的那一日，第I日是随后的那一日，或者使用EMl培养基培养细胞I周或更久，例如2、3、4周或更久，或者1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更久。在一些实施方案中，EMl培养基仅在培养的第一日或者前两日使用。在一些实施方案中，使用EMl培养基持续I代或多代，例如，1、2、3、4、5、6、
7、8、9、10、15、20、25、30或更多代，例如，20-30代。在一些实施方案中，在冷冻步骤或任何其他运输步骤之后使用EMl培养基，所述运输步骤涉及不与最佳生长结合的培养基或温度变化。EMl培养基补充有一种或多种选自以下的化合物:FGF、HGF、烟酰胺、胃泌素、B27、N-乙酰半胱氨酸和N2。在从冷冻库存或单细胞开始培养的情况下，EMl培养基优选补充有ROCK抑制剂。Y27632是用于本发明中的优选的ROCK抑制剂。因而，在一个实施方案中提供了细胞培养基，其包含添加以下成分的动物或人细胞的基本培养基或由添加以下成分的动物或人细胞的基本培养基组成:表皮生长因子，能够结合FGFR2或FGFR4的FGF，优选FGF10以及HGF，这些作为促细胞分裂生长因子，胃泌素，烟酰胺，B27, N2和N-乙酰半胱氨酸，并且优选地，BMP抑制剂,优选Noggin ；以及Wnt 激动剂，优选 R-spondinl 和 / 或 Wnt_3a。还可以将B27 (Invitrogen), N-乙酰半胱氨酸(Sigma)和 N2 (Invitrogen),胃泌素(Sigma)以及烟酰胺(Sigma)添加至以上所限定的培养基中，并且认为其可刺激细胞增殖。在本发明的背景下，烟酰胺在此又被称为“Nic”。“N2 补充剂”可购自 Invitrogen, Carlsbad, CA ;www.1nvitrogen.com;目录号 17502-048 ;以及 PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria ;www.paa.com;目录号F005-004 ；Bottenstein&Sato, PNAS, 76(1):514-517, 1979。N2 补充剂由 PAA LaboratoriesGmbH以100倍的液体浓缩液提供，其包含500μ g/ml人转铁蛋白，500 μ g/ml牛胰岛素，
0.63 μ g/ml黄体酮，1611 μ g/ml腐胺和0.52 μ g/ml亚硒酸钠。可将N2补充剂以浓缩液添加至培养基中，或在添加至培养基之前稀释。其可以I倍终浓度或其他终浓度来使用。N2补充剂的使用是将转铁蛋白、胰岛素、黄体酮、腐胺和亚硒酸钠并入本发明的培养基中的方便方式。“B27 补充剂”(购自 Invitrogen, Carlsbad, CA;www.1nvitrogen.com;当前目录号 17504-044 ；以及 PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria; www.paa.com;目录号F01-002 ；Brewer et al., J Neurosci Res.，35 (5): 567-76，1993)可用于配制培养基，所述培养基包含生物素、胆固醇、亚油酸、亚麻酸、黄体酮、腐胺、视黄醇、视黄醇乙酸酯、亚硒酸钠、三碘甲状腺原氨酸(T3)、DL-a-生育酚(维生素E)、白蛋白、胰岛素以及转铁蛋白。B27补充剂由PAA Laboratories GmbH以50倍的液体浓缩液提供，除其它成分外其包含生物素、胆固醇、亚油酸、亚麻酸、黄体酮、腐胺、视黄醇、视黄醇乙酸酯、亚硒酸钠、三碘甲状腺原氨酸(T3)、DL-α-生育酚(维生素E)、白蛋白、胰岛素以及转铁蛋白。这些成分中至少亚麻酸、视黄醇、视黄醇乙酸酯和三碘甲状腺原氨酸(T3)是核激素受体激动剂。可将B27补充剂以浓缩液添加至培养基中，或在添加至培养基之前稀释。其可以I倍终浓度或其他终浓度来使用。B27补充剂的使用是将生物素、胆固醇、亚油酸、亚麻酸、黄体酮、腐胺、视黄醇、视黄醇乙酸酯、亚硒酸钠、三碘甲状腺原氨酸(T3)、DL-a-生育酚(维生素E)、白蛋白、胰岛素和转铁蛋白并入本发明的培养基中的方便方式。

BMP抑制剂优选添加至基本培养基的成分是BMP抑制剂。BMP作为二聚配体结合至由两种不同受体丝氨酸/苏氨酸激酶，I型和II型受体组成的受体复合物。II型受体使I型受体磷酸化，导致该受体激酶的活化。随后I型受体使特异受体底物(SMAD)磷酸化，致使信号转导通路引起转录活性。BMP抑制剂定义为结合BMP分子以形成复合物的因子，其中所述BMP活性例如通过阻止或抑制BMP分子与BMP受体的结合而被中和。可选择地，所述抑制剂是担当拮抗剂或逆转激动剂的因子。这种类型的抑制剂与BMP受体结合并阻止BMP与所述受体的结合。后面这种因子的实例是抗体，其结合BMP受体并阻止BMP与抗体结合受体的相结合。可将BMP抑制剂以这样的量添加至培养基中，如在相同细胞类型中所评估的，相对于缺乏所述抑制剂时的BMP活性水平，该量有效抑制细胞中BMP依赖性活性O最多90%，优选最多80%，更优选最多70%，更优选最多50%，更优选最多30%，更优选最多10%，更优选0%。如本领域技术人员所熟知，BMP活性可通过测定BMP的转录活性来确定，例如如Zilberberg et al., 2007.BMC Cell Biol.8:41 中所示例的。已知几类天然的BMP结合蛋白，包括Noggin(Peprotech),腱蛋白和包含腱蛋白结构域的腱蛋白样蛋白(R&D systems)，卵泡抑素和包含卵泡抑素结构域的卵泡抑素相关蛋白(R&D systems)，DAN和包含DAN半胱氨酸-结(knot)结构域的DAN样蛋白(R&Dsystems),硬化蛋白 /SOST (R&D systems),核心蛋白聚糖(decorin, R&D systems),以及α -2 巨球蛋白(R&D systems)。在本发明的方法中优选使用的BMP抑制剂选自Noggin、DAN和DAN-样蛋白(包括Cerberus和Greml in (R&D systems))。这些可扩散的蛋白能够以不同程度的亲和力结合BMP配体并抑制它们接近信号受体。在基本培养基中添加这些BMP抑制剂中的任何一种阻止了干细胞损失。
优选的BMP抑制剂是Noggin。在本发明培养基的背景下，Noggin在此又被称为“N”。优选地，将Noggin以至少10ng/ml,更优选至少20ng/ml,更优选至少50ng/ml,更优选至少100ng/ml的浓度添加至基本培养基中。更加优选的浓度是大约100ng/ml或正好100ng/ml。在培养干细胞期间，可以将所述BMP抑制剂在需要时(例如每日或隔日)添加至培养基中。优选地，将BMP抑制剂每隔一日添加至培养基中。虽然需要时(例如每日或隔日)可更换培养基，但是优选每隔三日更换。Wnt激动剂可添加至基本培养基的另一成分是Wnt激动剂。在本发明培养基的背景下，Wnt激动剂在此又被称为“W”。Wnt信号通路由Wnt蛋白结合至卷曲蛋白(Frizzled)受体家族成员的细胞表面受体时发生的一系列事件来限定。这导致Dishevelled家族蛋白的活化,所述Dishevelled家族蛋白抑制蛋白复合物包括轴蛋白(axin)、GSK-3和蛋白APC降解细胞内β_连环蛋白(β-catenin)。所得到的富集的核β _连环蛋白增强了通过TCF/LEF家族转录因子的转录。将Wnt激动剂定义为细胞中激活TCF/LEF-介导的转录的因子。因而Wnt激动剂选自结合并激活卷曲蛋白受体家族成员的真正的Wnt激动剂,包括任何及全部的Wnt家族蛋白，细胞内连环蛋白降解的抑制剂以及TCF/LEF的激活剂。将所述Wnt激动剂以这样的量添加至培养基中，如在相同细胞类型中所评估的，相对于缺乏所述分子时的所述fct活性水平，该量有效刺激细胞中Wnt活性至少10%、更优选至少20%、更优选至少30%、更优选至少50%、更优选至少70%、更优选至少90%、更优选至少100%。如本领域技术人员所熟知，可以通过测定fct的转录活性来确定Wnt活性，例如通过pTOPFLASH和pFOPFLASH Tcf荧光素酶报告构建体(Korinek et al.，1997.Science275:1784 - 1787)。Wnt激动剂可包括分泌型糖蛋白，其包括Wnt-l/Int-1 ;Wnt_2/Irp (Int-Ι相关蛋白)；Wnt_2b/13 ；ffnt-3/Int-4 ；ffnt-3a (R&D systems) ；ffnt-4 ；ffnt-5a ；ffnt-5b ；ffnt-6(Kirikoshi H et al.2001.Biochem Biophys Res Com283:798-805) ；ffnt-7a(R&Dsystems) ；ffnt-7b ；ffnt-8a/8d ；ffnt-8b ；ffnt-9a/14 ；ffnt-9b/14b/15 ；ffnt-10a ；Wnt-10b/12 ;Wnt-ll ;以及 Wnt-16。人 Wnt 蛋白的概况由 “THE WNT FAMILY OF SECRETEDPROTEINS，，，R&D Systems Catalog, 2004 提供。另外的Wnt激动剂包括分泌型蛋白的R-spondin家族，其与Wnt信号通路的激活和调控相关，且由 4个成员(R-spondinl (NU206, Nuvelo, San Carlos, CA)、R_spondin2 ((R&Dsystems)、R_spondin3 和 R-spondin-4)组成；以及 Norrin (又被称为 Norrie 病蛋白或NDP) (R&D systems),其是分泌型调控蛋白，由于以高亲和力结合卷曲蛋白_4受体而类似Wnt蛋白起作用并诱导Wnt信号通路的激活(Kestutis Planutis et al.(2007)BMC CellBiol.8:12)。
可以将模拟R-spondin活性的化合物用作本发明的Wnt激动剂。最近发现R-spondin与Lgr5相互作用。因而，Lgr5激动剂如激动型抗_Lgr5抗体是可用于本发明中的Wnt激动剂的例子。在本发明培养基的背景下，R-spondin在此又被称为“R”。最近被鉴定的Wnt信号通路的小分子激动剂氨基嘧啶衍生物同样作为Wnt激动剂被明显包括(Liu et al.(2005) Angew Chem Int Ed Engl.44, 1987-90)。已知的GSK抑制剂包括小干扰RNA(siRNA;CelI Signaling)、锂(Sigma)> kenpaullone(Biomol International;Leost, M.et al.(2000)Eur.J.Biochem.267，5983 - 5994)、6_ 溴靛玉红-30-丙酮肟(Mei jer, L.et al.(2003) Chem.Biol.10，1255 - 1266)、SB216763 和 SB415286 (Sigma-Aldrich)，以及防止 GSK-3 与轴蛋白相互作用的FRAT家族成员和FRAT衍生的肽。综述由Meijer et al., (2004), Trends inPharmacological Sciences25, 471-480提供，在此通过引用并入。测定GSK-3抑制水平的方法和测定是本领域人员所熟知的，包括例如Liao et al2004, Endocrinology, 145(6):2941-9)中所描述的方法和测定。在优选实施方案中，所述Wnt激动剂选自Wnt家族成员、R-spondinl_4(例如，R-spondinl或R_spondin4)、Norrin以及GSK抑制剂中的抑制或多种。本发明人发现将至少一种Wnt激动剂添加至基本培养基对于肝脏上皮干细胞或分离的胆管或分离的肝脏碎块的增殖是重要的。在进一步优选的实施方案中，所述Wnt激动剂包括R-spondinl或由R-spondinl组成。优选地，将R-spondin I以至少200ng/ml、更优选至少300ng/ml、更优选至少500ng/ml的浓度添加至基本培养基中。还更优选的R-spondinl浓度是大约500ng/ml或正好500ng/ml。在培养干细胞期间，可将所述Wnt家族成员在需要时(例如每日或隔日)添加至培养基中。优选地，将fct家族成员每隔一日添加至培养基中。虽然需要时(例如每日或隔日)可更换培养基，但是优选每隔三日更换。在优选实施方案中，Wnt激动剂选自R-spondin、Wnt_3a和Wnt_6。更优选地，R-spondin和Wnt_3a都用作Wnt激动剂。该组合是特别优选的，因为令人惊奇地，该组合对类器官形成具有协同效应。优选的浓度对于R-spondin是l-500ng/ml,例如l-10ng/ml、10-100ng/ml、l_50ng/ml、10-200ng/ml、200 至 500ng/ml、30ng/ml,对于 Wnt3a 是 lOOng/ml至 lOOOng/ml,例如 lOOng/ml 或 1000ng/ml。优选地，Wnt激动剂是Wnt配体,例如，如Wnt3a,并且可以新鲜添加至培养基中。可选择地，Wnt配体通过用表达所述Wnt配体的合适的表达构建体感染细胞系转染或者感染细胞系而表达于细胞系中。培养所述细胞系并在适当的时间间隔收获包含分泌型fct配体的培养基。例如，细胞在其一达到汇合且停止生长时就产生fct3a。将来自未用所述表达构建体转染或感染的细胞的培养基用作对照。收获并检测条件培养基，例如在荧光素酶表达受TCF反应元件控制的试验中来检测诸如Wnt3a的Wnt激动剂的存在(Korinek et al.、1997.Science275:1784 - 1787)。在再生组织的培养物中使用时，将培养基稀释。如本领域人员所熟知的，有时添加过量的Wnt配体与添加过少的Wnt配体一样，对于培养是有害的。因此，条件培养基的实际稀释度将取决于试验中确定 的fct配体的量。促细胞分裂生长因子
添加至基本培养基的又一成分是促细胞分裂生长因子的组合，其选自表皮生长因子(EGF，(优选来自P印rotech)，能够结合FGFR2或FGFR4的成纤维细胞生长因子(FGF)，以及肝细胞生长因子(HGF)(同样优选来自Peprotech)。能够结合FGFR2 (FGF受体)或FGFR4的FGF优选FGF4、FGF7或FGFlO (优选来自P印rotech)，最优选FGFlO。优选使用全部3种EGF、FGF和HGF。在本发明培养基的背景下，EGF在此又被称为“E”，FGF在此又被称为“F”，以及HGF在此又被称为“H”。EGF对于各种培养的外胚层和中胚层细胞是有效的促细胞分裂因子，并且对体内和体外特定细胞和细胞培养中一些成纤维细胞的分化具有深刻的影响。EGF前体作为膜结合分子存在，其被蛋白水解切割以形成刺激细胞的53个氨基酸的肽激素。EGF通过结合至定位EGF受体的质膜发挥其对靶细胞的作用。EGF受体是跨膜蛋白酪氨酸激酶。EGF结合至受体导致激酶的活化以及随后的受体自磷酸化。自磷酸化对于受体与其底物的相互作用是必需的。由EGF激活的信号转导通路包括磷脂酰肌醇通路,导致蛋白激酶C的活化并增加细胞内Ca2+浓度，以及致使MAP激酶活化的ras通路。这些通路参与调控细胞增殖，分化和存活(Herbst, 2004，Int Journal of radiationoncology, 59, 2, S21-S26)。优选地,将EGF以5至500ng/ml或至少5且不高于500ng/ml的浓度添加至基本培养基中。优选的浓度是至少10、20、25、30、40、45或50ng/ml且不高于500、450、400、350、300、250、200、150或100ng/ml。更优选的浓度是至少50且不高于100ng/ml。甚至更优选的浓度是约50ng/ml或50ng/ml。FGF10是属于成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族的蛋白。FGF家族成员具有广泛的促细胞分裂和细胞存活活性，并且参与多种生物学过程，包括胚胎发育、细胞生长、形态发生、组织修复、肿瘤生长和入侵。FGF通过与细胞表面酪氨酸激酶受体(FGFR)相互作用来刺激细胞。已鉴定出四种密切相关的受体(FGFR1 - FGFR4)。已显示FGFRl - FGFR3基因编码多种亚型，并且这些亚型可能是确定配体特异性的关键。大部分FGF结合多于一种受体(Ornitz J Biol Chem.1998Feb27; 273 (9): 5349-57)。然而，FGF10 和 FGF7 在 FGF 中是独特的，因为它们仅与特 异的FGFR2亚型(被称为FGFR2b，其仅由上皮细胞专门表达)相互作用(Igarashi, J Biol Chem.1998273 (21): 13230-5)。FGF10 是优选的能够结合 FGFR2 或FGFR4 的 FGF。肝细胞生长因子/离散因子(HGF/SF)是通过结合至原癌性c_Met受体之后激活酪氨酸激酶信号级联来调控细胞生长、细胞运动和形态发生的形态发生因子。对于FGF10和HGF可以使用相同的浓度。对于FGF10，优选的浓度是20、50、100、500ng/ml,不高于 500ng/ml。对于 HGF,优选的浓度是 1、10、20、50ng/ml,不高于 50ng/ml。培养干细胞期间，需要时(例如，每日或每隔一日)优选将所述促细胞分裂生长因子(即EGF、FGF10和HGF)的组合添加至培养基中。优选的是每隔一日添加。虽然需要时(例如每日或每隔一日)可以更换培养基，但是优选每隔三日更换。在一些实施方案中，诸如A83-01的TGF-β抑制剂也存在于EMl培养基中。这在培养人细胞或类器官时是特别有用的。在一些实施方案中，A83-01以400-600nM，例如450-550nM、470-530nM或大约500nM.的浓度存在。在EMl中存在TGF-β抑制剂的实施方案中，优选不存在Notch抑制剂。本发明优选的扩增培养基
实施例中描述了优选的培养基和利用这些培养基的方法。例如，细胞培养基可包含添加了以下成分的基本培养基或由添加了以下成分的基本培养基组成=EGF和R-spondinl，并补充有FGF10，HGF和烟酰胺；例如，EGF(50ng/ml)和R-spondinl (lug/ml)，并补充有 FGFlO (100ng/ml)，HGF (25_50ng/ml)和烟酰胺(1-1OmM)。本发明人发现，该培养基对于长期扩增细胞是优选的。因此，该细胞培养基优选用作本发明的EM2。优选地，基本培养基补充有B27，N2和200ng/ml N-乙酰半胱氨酸。在一些实施方案中，基本培养基是改进型DMEM/F12。然而，可以使用任何其他合适的基本培养基。实施例中描述了另一优选的细胞培养基和使用该培养基的方法，优选地，所述培养基包含补充有以下成分的改进型DMEM/F12或由补充有以下成分的改进型DMEM/F12组成:B27、N2、200ng/ml N-乙酰半胱氨酸、50ng/ml EGF> I μ g/ml R-spondinl、IOnM 胃泌素、lOOng/ml FGF10、IOmM烟酰胺和50ng/ml HGF以及50%Wnt条件培养基，以及优选I O-1 OOng/ml Noggin。Wnt条件培养基包含改进型DMEM、P/S、B27、N2以及还有FCS。用Wnt3A表达质粒转染的293T细胞产生Wnt。几日之后获得整个培养基(即具有分泌的fct)并用作Wnt来源。因此，本发明提供了细胞培养基，其包含添加了以下成分的人或动物细胞的基本培养基或由添加了以下成分的人或动物细胞的基本培养基组成:表皮生长因子，能够结合FGFR2或FGFR4的FGF，优选FGF10以及HGF，这些作为促细胞分裂生长因子，胃泌素、烟酰胺、B27、N2和N-乙酰半胱氨酸，以及优选地，BMP抑制剂，更优选Noggin,和Wnt 激动剂，更优选 R-spondinl 和 / 或 Wnt_3a。因而本发明包括第一优选的培养基，其包含添加了以下成分的人或动物细胞的基本培养基或由添加了以下成分的人或动物细胞的基本培养基组成:作为促细胞分裂生长因子的表皮生长因子、FGF10和HGF，胃泌素、烟酰胺、B27、N2和N-乙酰半胱氨酸，BMP抑制剂，更优选Noggin,和Wnt 激动剂，更优选 R-spondinl 和 Wnt_3a。该培养基可以用作本发明的EMl细胞培养基来刺激细胞的初期扩增。在一些实施方案中，用作EMl细胞培养基的培养基包含本发明的EM2培养基的全部成分且另外包含Wnt-3a和Noggin。在补充有N-乙酰半胱氨酸，B27和N2的基本培养基的实施方案中，以下成分优选添加至培养基中:EGF、R-spondinl、胃泌素、FGF10、烟酰胺和HGF以及Wnt-条件培养基。优选地，基本培养基补充有依照以上所述量的N-乙酰半胱氨酸、EGF、R-spondinl、胃泌素、FGF10、烟酰胺和HGF以及Wnt条件培养基。例如，在一些实施方案中，基本培养可补充有150ng/ml至250ng/mlN-乙酰半胱氨酸；优选地，基本培养基补充有大约或正好200ng/ml N-乙酰半胱氨酸。例如，在一些实施方案中，基本培 养基可补充有40ng/ml至60ng/ml EGF ;优选地，基本培养基补充有大约或正好50ng/ml EGF。例如，在一些实施方案中，基本培养基可补充有0.5 μ g/ml至1.5 μ g/ml R-spondinl ;优选地,基本培养基补充有大约或正好I μ g/ml R-spondinl。例如,在一些实施方案中，基本培养基可补充有5nM至15nM胃泌素；优选地，基本培养基补充有大约或正好IOnM胃泌素。例如，在一些实施方案中，基本培养基可补充有25-200ng/ml FGF10，例如70ng/ml至130ng/ml FGFlO ;优选地，基本培养基补充有大约或正好100ng/ml FGF10。例如，在一些实施方案中，基本培养基可补充有5mM至15mM烟酰胺；优选地，基本培养基补充有大约或正好IOmM烟酰胺。例如，在一些实施方案中，基本培养基可补充有25ng/ml至100ng/ml HGF,例如35ng/ml至65ng/ml HGF ;优选地，基本培养基补充有大约或正好50ng/ml HGF。例如，在一些实施方案中，基本培养基可补充有35%至65%Wnt条件培养基；优选地，基本培养基补充有大约或正好50%Wnt条件培养基。在一些实施方案中，胃 泌素和N2中的一种或两种并不存在于细胞培养基中。优选地，基本培养基是改进型DMEM/F12。优选地，该第一培养基(例如，EM1、EM2或者EMl和EM2 二者)在本发明培养方法的开始两周使用。然而，其可用于更短的时间段，例如1、2、3、5、7或10日，或者更长的时间段，例如3、4、5、10、20周或更久，5个月或更久，例如，6、7、8、9、10、11、12个月或更久。分化培养基(DM):另一方面，提供了第二细胞培养基，其包含添加了以下成分的人或动物细胞的基本培养基或由添加了以下成分的人或动物细胞的基本培养基组成:EGF、TGF-β抑制剂和Notch抑制剂。本发明人发现，该培养基对于分化细胞是有用的。用于分化细胞的培养基在此可被称为DM。优选地，第二细胞培养基还包含FGF和/或HGF。在一个实施方案中，第二培养基包含添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基或由添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基组成:作为促细胞分裂生长因子的表皮生长因子，FGF10和HGF ；Notch抑制剂；以及TGF-β 抑制剂。在一个实施方案中，TGF-β抑制剂是Α83-01和/或Notch抑制剂是DAPT。在另一实施方案中，DM细胞培养基还包含地塞米松。优选的第二细胞培养基和利用该培养基的方法描述于实施例中，所述培养基包含添加了以下成分的基本培养基或由添加了以下成分的基本培养基组成:50ng/ml EGF、100ng/ml FGF10、50nM A8301和IOuM DAPT0与任何其他合适的基本培养基一样，改进型DMEM/F12可用作基本培养基。在一些实施方案中，第二细胞培养基不含R-spondin或Wnt。在一些实施方案中，第二细胞培养基不含fct激动剂。在一些实施方案中，第二细胞培养基不含烟酰胺。在一些实施方案中，第二细胞培养基不含BMP抑制剂。本发明人发现，R-spondinl和烟酰胺都抑制成熟肝细胞标志物CYP3A11的表达却促进成肝母细胞标志物白蛋白的表达。因此，为了增强细胞分化成更成熟的肝脏命运，本发明人从细胞培养中去除R-spondin和烟酰胺。本发明人还发现特异性胆管转录因子的表达在含有R-spondinl的扩增培养基中高度上调，表明培养物基因表达不平衡地偏向更多的胆管细胞命运。Notch和TGF-β信号通路影响体内胆管细胞命运。实际上，缺失Rbpj (实现活性Notch信号通路所必需的)导致异常的小管发生(Zong Y.Development2009),而向肝脏外植体添加TGF-β利于体外胆管分化(Clotman F.Genes and Development2005) 0由于Notch和TGF-β信号通路在肝脏培养物中都高度上调(图9)，本发明人推测抑制胆管细胞命运可能触发细胞向更多的肝细胞表型分化。发现向优选不含R-spondin或Wnt的分化培养基中添加TGF-β抑制剂(如Α8301)和Notch抑制剂(如DAPT)增强成熟肝细胞标志物的表达，并且增加肝细胞样细胞的数量(例如，参见实施例2)。Notch是可通过多重蛋白水解切割而激活的跨膜表面受体，其中的一种由具有蛋白酶活性的蛋白复合体(被称为Y-分泌酶)切割。Y-分泌酶是在膜内实施其切割活性的蛋白酶。Y-分泌酶是多元复合酶，并且由至少四种不同的蛋白组成，即早老蛋白(早老蛋白I或2)、nicastrin, PEN-2和APH-1。早老蛋白是Y -分泌酶的催化中心。配体结合Notch受体时经过构象变化，这允许通过金属蛋白酶ADAM蛋白酶作用而脱落胞外域。在这之后紧接着是Y-分泌酶复合体作用，其导致Notch细胞内结构域(NI⑶)的释放。NICD易位至细胞核与CSL(C-启动子结合因子/重组信号序列结合蛋白Jk /无毛阻抑物(Supressor-of-Hairless)/Lagl)相互作用。NIO)的结合将CSL由转录阻遏物转化为致使Notch靶基因表达的激活剂。在本发明的背景下可使用的优选的Notch抑制剂实例是:Y-分泌酶抑制剂，如DAPT或二苯并氮卓(dibenzazepine，DBZ)或苯二氮卓(benzodiazepine, BZ)或LY-411575,这些是能够减少配体介导的Notch活化的抑制剂(例如通过Notch的显性阴性配体或通过显性阴性Notch或通过能够至少部分阻断Notch配体与Notch之间的相互作用的抗体)，或者ADAM蛋白酶的抑制剂。TGF-β信号通路参与许多细胞功能，包括细胞生长，细胞命运和细胞凋亡。信号通路一般由TGF-β超家族配体与II型受体的结合开始，这募集I型受体并使其磷酸化。然后I型受体使SMAD磷酸化，其充当细胞核内的转录因子，并调控靶基因的表达。可选择地，TGF-β信号通路可激活MAP激酶信号通路，例如通过ρ38ΜΑΡ激酶。TGF-β超家族配体包括骨形态发生蛋白(ΒΜΡ)，生长分化因子(GDF)，抗穆勒氏管激素(AMH)，激活素，nodal以及TGF- β。TGF- β抑制剂是降低TGF- β信号通路活性的因子。本领域已知许多破坏TGF- β信号通路的方式，其可与本发明结合使用。例如，TGF-β信号通路可由以下方式破坏:通过小干扰RNA策略抑制TGF-β表达；抑制弗林蛋白酶(furin，使TGF-β激活的蛋白酶)；通过生理学抑制剂抑制通路，如由Noggin、DAN或DAN-样蛋白抑制BMP ;用单克隆抗体中和TGF-β 受体激酶1(又被称为激活素受体样激酶^1^5)31^4、41^6、41^7或其他TGF-β相关的受体激酶的小分子抑制剂抑制；通过过表达其生理学抑制剂Smad7或通过利用硫氧还蛋白作为Smad锚着蛋白使Smad不能活化来抑制Smad2和Smad3信号通路(Fuchs, 0.1nhibition of TGF-Signaling for the Treatment of Tumor Metastasis andFibrotic Diseases.Current Signal Transduction Therapy, Volume6, NumberI, January2Oil, pp.29-43(15))。已知确定物质是否是TGF-β抑制剂的多种方法，并且这些方法可与本发明结合使用。例如，细胞检测可在用在包含驱动荧光素酶报告基因的人PA1-1启动子或Smad结合位点的报告基因构建体稳定转染的细胞中。相对于对照组的荧光素酶活性的抑制可用作化合物活性的测量标准(De Gouville et al., Br J Pharmacol.2005May; 145 (2): 166 - 177)
ο
根据本发明，TGF-β抑制剂可以是蛋白、肽、小分子、小干扰RNA、反义寡核苷酸、适体或抗体。抑制剂可以是天然存在的或合成的。可用于本发明中的优选小分子TGF-β抑制剂的实例包括列于表I中的小分子抑制剂:表I靶向受体激酶的小分子TGF- β抑制剂


本发明涉及肝脏的类器官、其用途以及获得它们的方法。