分离的肾细胞及其用途[0001]本申请是申请日为2009年11月12日、中国申请号为200980153736.X、发明名称为“分离的肾细胞及其用途”的发明申请的分案申请。[0002]相关申请[0003]本申请根据35U.S.C.§ 119(e)要求2008年11月12日提交的美国临时申请N0.61/114，025、2008年11月12日提交的美国临时申请N0.61/114，030、2008年12月5日提交的美国临时申请N0.61/201，056、2008年12月8日提交的美国临时申请N0.61/201，305和2008年12月10日提交的美国临时申请N0.61/121，311的优先权，这些申请的全部内容通过引用并入本文。本申请的主题与2009年11月12日提交的美国临时申请N0.61/260, 833相关，该申请的公开内容通过引用并入本文。[0005]在美国，有超过1900万的慢性肾病(CKD)患者，该疾病往往是由包括肥胖症、糖尿病和高血压在内的代谢障碍所致。数据检索显示，慢性肾病发病率的增加源于由高血压和非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)所继发的肾衰竭的发展(美国肾病数据系统(UnitedStates Renal Data Service(USRDS)):用于CKD和 ESRD 的费用(Costs of CKD and ESRD)第223-238页(2007)，由美国国立卫生研究院国立糖尿病、消化与肾病研究所(NationalInstitute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases) Bethesda, MD 编著)所述两种疾病在全球范围内也呈上升趋势。已证实肥胖症、高血压和血糖控制不良是肾损害的独立危险因素，引起肾小球和肾小管损害并引起蛋白尿和其它全身可检测到的肾过滤功能的改变(Aboushwareb 等，World J Urol, 26:295-300, 2008 ；Amann, K.等，Nephrol DialTransplant, 13:1958-66，1998)。对于处于1_3进行期的CKD患者，通过改变生活方式和旨在控制一种或多种潜在病情的药物介入进行控制；而对于处于4-5期的CKD患者，则通过透析和药物疗法进行控制，该药物疗法通常包括抗高血压药、红细胞生成刺激剂(ESA)、补充铁和维生素D。根据美国肾病数据系统(USRDS)，晚期肾病(ESRD)患者每个月在注射型红细胞生成刺激剂(ESA)、维生素D补充剂和铁补充剂上的平均费用超过$600(美国肾病数据系统:用于CKD和ESRD的费用第223-238页(2007)，由美国国立卫生研究院国立糖尿病、消化与肾病研究所Bethesda，MD编著)。再加上用于透析的年平均费用($65，405)，用于维持每位患者的医疗费用上升至每年超过$72，000 (美国肾病数据系统:用于CKD和ESRD的费用第223-238页(2007)，由美国国立卫生研究院国立糖尿病、消化与肾病研究所Bethesda，MD编著)-该数值仅反映了标准治疗的费用，并不包括其它并发症的治疗、紧急治疗或辅助治疗(例如放置用于透析通路的血管移植物)的费用。2005年，用于CKD和ESRD的联合医疗保健费用总计 为$620亿-占该年所有医疗保健支出的19% (美国肾病数据系统:用于CKD和ESRD的费用第223-238页(2007)，由美国国立卫生研究院国立糖尿病、消化与肾病研究所Bethesda，MD编著)。虽然对于4_5期患者而言，肾移植作为先行措施以避免透析或当透析已不足以控制病情时是有效的方案，但在美国，可受益于全肾移植的5期CKD患者人数(>400, 000)远超过任何指定年份可获得的合适供体肾的数量(~16，000) (Powe, NR等，Am J Kidney Dis，53:S37-45，2009)。因此，需要新的治疗模式来延缓或降低对透析的依赖性并填补由供体肾短缺留下的空白。[0006]进行性肾病是由初期疾病损伤(如，高血压)和随后对该损伤适应不良的肾反应联合所致。此类反应包括产生促炎性和促纤维化细胞因子和生长因子。因此，延缓CKD恶化的一种策略为改善炎性和纤维化反应以及通过肾组织的修复和/或再生来减轻或逆转肾溃变。[0007]慢性肾衰竭常见于人类以及一些驯养的动物中。肾衰竭的患者不仅经受肾功能丧失(尿毒症)，而且会由于骨髓不能经由红细胞生成而产生足量的红细胞(RBC)而发展成贫血症。红细胞稳态取决于由驻留于肾脏中的特化间质成纤维细胞产生的促红细胞生成素(EPO)和骨髓中的靶红系祖细胞响应EPO并生成更多RBC的能力。肾衰竭的贫血源于肾脏中的EPO的生成的量的降低和尿毒症因素对骨髓中EPO作用的负面影响。[0008]迄今为止，治疗慢性肾衰竭的临床方法包括用于恢复肾过滤和尿液生成的透析和肾移植，以及用于恢复红细胞团块的重组EPO或EPO类似物的全身性递送。透析延长了中期至晚期肾衰竭患者的生存期，但却导致严重的生活质量问题。肾移植对于晚期肾衰竭患者而言是非常理想(并且往往是唯一)的方案，但优质的供体肾的供应不能满足肾衰竭群体的需求。用于治疗贫血的含重组EPO的丸剂现已与严重的下游健康风险相关，致使FDA对该药物发出黑框警告(black box warning),并且需要进一步研究用于恢复此群体中红细胞稳态的替代疗法。临床前研究已检测了经由基因治疗方法所产生的EPO生成细胞的体内功效和安全性。这些研究表明，可通过EPO生成细胞的体内递送来瞬时刺激红细胞生成和RBC数量。然而，迄今为止，这些方法均未提供可调的红细胞稳态或长期的体内功能性。因此，HCT和RBC数量通常增加超过正常值，导致真性红细胞增多症和其它并发症。与治疗相关的并且相比重组EPO递送提供更多优势的EPO生成细胞的递送不仅必须增加HCT，而且还应恢复红细胞稳态，同时保持正调节机制和负调节机制未受损。需要指出的是，虽然EPO缺乏性贫血常见于肾病患者中，但是其发病也可由其它病情引起，包括心力衰竭、多器官系统功能衰竭和其它慢性疾病。[0009]肾是由许多不同的特化细胞类型(10种以上)构成的独特器官，这些细胞类型均从间介中胚层起源发育，但在成熟时却形成形态学上和功能上不同的区室以及解剖单元，这些解剖单元协同作用以过滤血液、产生尿液、调节酸碱及电解质平衡和调节内分泌功能，诸如产生促红细胞生成素(Epo)、维生素D、肾素和血管紧张素。肾的细胞区室在稳态功能方面具有很大的相互依赖性，这在下列实例中重点描述。入球小动脉细胞与髓袢升支粗段(the thick ascending limb of the loop of Henle)中的特化肾小管细胞(致密斑)协同作用，以调节流经肾小球的血流(Castrop, H.Acta Physiol (Oxf), 189:3-14，2007)。肾小球的有孔内皮细胞、足细胞和基底膜与特化的近端肾小管细胞对来自肾小球滤液的蛋白质所进行的受体介导的内吞和重吸收相配合，以此实现肾对蛋白质的处理(Jarad，G&Miner, JH.Curr Opin Nephrol Hypertens, 18:226-32，2009)。由肾小管细胞生成的活性维生素D通过直接或间接机制调节间质细胞的稳态，这些机制控制细胞外基质的沉积、间质细胞向肌成纤维细胞的转化以及上皮-间充质细胞转化(Tan, X等，J Steroid Biochem MolBiol, 103:491-6, 2007)。无论具体实例如何，肾中细胞间的相互作用至少部分地取决于空间和结构关系。在细胞水平上，CKD的进展可涉及由细胞机能不全或稳态细胞间相互作用的缺失而导致的特定细胞类型的缺失或一种或多种细胞类型的功能丧失。因此，治疗CKD的有效再生方法必须通过恢复细胞组织和细胞间通讯来对稳态进行部分重建。
[0010]已设想通过增强特定的肾功能(例如肾小管转运或Epo生成)来降低与CKD进展相关的发病率和死亡率。大多数基于细胞的肾病治疗方法侧重于用干细胞或祖细胞类型对急性肾衰竭(ARF)进行治疗干预(Hopkins, C等，JPathol, 217:265-81，2009)。目前存在许多临床前研究，其涉及在诱发ARF之前或之后便立即递送各种细胞类型，包括肾内或全身性递送 MSC (Humphreys BD&Bonventre JV, Annu Rev Med2008, 59:311-325)、内皮祖细胞(EPC) (Chade AR 等，Circulation2009, 119:547-557 ;Patschan D 等，Curr OpinPharmacol2006, 6:176-183)以及胎儿细胞或组织原基(Hammerman MR, Curr Opin NephrolHypertens2001, 10:13-17 ；Kim SS 等，Stem Cells2007, 25:1393-1401 !Marshall D 等，Exp Physiol2007, 92:263-271 ；Yokoo T 等，J Am Soc N印hrol2006, 17:1026-1034)。将包含肾小管细胞的体外中空纤维过滤装置进行测试作为治疗人类A RF的传统透析的辅助(Ding,F&Humes, HD.Nephron Exp Nephrol, 109:ell8-22, 2008 ；Humes, HD 等，KidneyInt, 66:1578-88, 2004 ;Humes, HD 等，Nat Biotechnol, 17:451-5，1999)。还对心血管外科手术继发性ARF发作的高危患者群体进行了经肾动脉移植间充质干细胞的临床试验(ffestenfelder, C.Experimental Biology.New Orleans, LA, 2009)。针对基于细胞的 CKD治疗干预而进行的临床前研究数量有限(Chade，AR等，Circulation, 119:547-57，2009 ；Eliopoulos, N 等，J Am Soc Nephrol, 17:1576-84，2006 ;Kucic, T 等，Am J Physiol RenalPhysiol, 295:F488-96, 2008)。已在啮齿动物中对胎儿肾原基+/-间充质干细胞的组合进行了研究(Yokoo, T 等，Transplantation, 85:1654-8，2008 ;Yokoo, T 等，J Am SocNephrol, 17:1026-34, 2006)，其中移植到合适环境(如网膜)的整个胎儿肾组织显然可发展成为功能有限的肾结构。然而，MSC作为胎儿肾组织原基组分的治疗作用并不明确，并且用于治疗目的之人体胎儿肾组织的来源面临着许多操作和伦理的挑战。在其它研究中，将来源于健康供体骨髓的细胞移植到经辐射的C0L4A3(-/_)小鼠体内，该小鼠为患有肾小球性肾炎、蛋白质流失和纤维样变性的奥尔波特综合征(Alport Syndrome)模型,其中所述细胞通过用没有胶原基因突变的健康细胞替换渗漏肾小球足细胞从而部分延缓了模型中综合征的进展(Prodromidi, EI 等,Stem Cells, 24:2448-55，2006，Sugimoto, H 等，ProcNatl Acad Sci U S A, 103:7321-6，2006)。认为细胞移植有助于使sCREAT、BUN和钠的水平稳定，而在研究24中，未治疗的/肾受损对照组没有给出比较结果。Chade等采用单侧肾动脉狭窄的猪模型对损伤6周后于肾内递送的自体EPC的效果进行检验(Chade AR等，Circulation2009, 119:547-557)。EPC在某种程度上改善了肾小管_间质纤维化，显著改善了肾小球硬化症并改善了肾血流量，但在治疗后未观察到血压的变化(Chade AR等，Circulation2009, 119:547-557)。迄今为止，对基于细胞的CKD疗法的体内功效进行检验的研究已产生即时和 /或局部效应，且很少有研究同时收集到功能的全身性和组织学证据。少数研究提供对进行性CKD模型干预后的临床相关益处的证据，这些研究提出了有关基于细胞的疗法完全恢复肾功能潜力的问题。然而，稳定肾功能并延缓进展的再生疗法能够解决此患者群体范围内未得到满足的医疗需求。
[0011]进行性CKD的体内可再生模型对于评价候选疗法的治疗潜力而言必不可少。虽然ARF模型数目众多并且包括多种化学物质或局部缺血/再灌流诱发的肾小管损伤，但未经显著干预的进行性和晚期CKD模型较少。在大鼠中进行两步5/6肾切除手术再生地产生了晚期和进行性肾衰竭状态，导致全身地和组织学上地可检出的疾病，这些疾病伴有CKD的若干关键特征，包括高血压、肾小球滤过率(GFR)降低、血清肌酸酐(sCREAT)和BUN升高、肾小球和肾小管_间质纤维化、高脂血症、高磷酸盐血症和贫血(Kaufman, JM等,KidneyInt, 6:10-7, 197422 ;Platt，R 等，Clin Sci(Lond), 11:217—31，1952 ；Ormrod, D&Miller, T.Nephron, 26:249-54，1980 ；Brenner, BM.Am J Physiol, 249:F324_37, 1985)。这些临床相关特征的存在，连同技术再现性和商业可用性为本文所述研究模型的选择提供了基础。
[0012]因此，需要显著并持久增强肾功能的新治疗模式，以延缓病情发展和改善此患者群体的生活质量，并减轻医疗保健体系的年度费用负担。再生医疗技术可提供CKD的下一代治疗方案。
[0013]发明概述
[0014]在一个方面，本发明提供了一种人肾细胞混合物，其包括第一细胞群、B2和第二细胞群，其中B2包括分离的肾小管细胞富集群，并且其中第二细胞群包括促红细胞生成素(EPO)生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。在一些实施方案中，混合物还包括第三细胞群。在一个实施方案中， B2细胞群还包括集合管上皮细胞。在一个实施方案中，B2细胞群具有耐低氧性。在一个实施方案中，B2细胞群能够通过HAS-2 (透明质酸合酶-2)的表达在体外和体内生成和/或刺激生成高分子量类型的透明质酸(HA)。在另一个实施方案中，B2细胞群具有碘克沙醇耐受性。在某些实施方案中，B2细胞群的密度介于约1.045g/mL和约1.052g/mL之间。在其它实施方案中，第二细胞群为B4细胞群。在一个实施方案中，B4细胞群的密度介于约1.063g/mL和约1.091g/mL之间。在某些其它实施方案中，第二细胞群为B3细胞群。在一个实施方案中，B3细胞群的密度介于约1.052g/mL和约1.063g/mL之间。在其它实施方案中，混合物包括B2细胞群和B3细胞群。
[0015]在其它实施方案中，混合物缺乏惰性或不需要的组分。在一个实施方案中，混合物不包括或缺乏BI细胞群。在一个实施方案中，BI细胞群包括集合管和肾小管系统的大颗粒细胞，其密度小于~1.045g/mL。在某些其它实施方案中，混合物不包括或缺乏B5细胞群。在一个实施方案中，混合物不包括密度大于~1.091g/mL的B5细胞群，B5细胞群包括低颗粒度和低成活力的细胞碎片和小细胞。
[0016]在某些实施方案中，细胞混合物可稳定和/或改善和/或恢复肾功能。在一个实施方案中，混合物能够吸收受体介导的白蛋白。在其它实施方案中，细胞混合物能够表达氧可调促红细胞生成素(EPO)。在其它实施方案中，混合物含有能够在体外和体内生成和/或刺激生成高分子量类型的透明质酸(HA)的HAS-2表达细胞。在一个实施方案中，经由体内递送，混合物能够提供再生刺激。在其它实施方案中，经由体内递送，混合物够减轻肾小球滤过、肾小管重吸收、尿液生成和/或内分泌功能的衰退，使这些功能稳定或改善。
[0017]在所有实施方案中，第一细胞群和第二细胞群可源自肾组织或培养的肾细胞。在一个实施方案中，B2通过选自下列各项的肾小管细胞标记物的表达来表征:巨蛋白(megalin)、cubilin、透明质酸合酶2 (HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、神经钙黏着蛋白(Ncad)、上皮钙黏着蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1 (Acipl)、水通道蛋白-2 (Acip2)、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rab 17)、GATA结合蛋白3 (Gata3)、含FXYD域离子转运调节子4(Fxyd4)、溶质载体家族9 (钠/氢交换剂)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员Bl(Aldh3bl)、醛脱氢酶I家族成员A3(Aldhla3)和钙蛋白酶_8 (Capn8)。在另一个实施方案中，B2还通过集合管标记物水通道蛋白_4(Aqp4)标记物的表达来表征。
[0018]在所有实施方案中，B4可通过选自PECAM、VEGF, KDR、HIFla的血管标记物的表达来表征。在某些其它实施方案中，B4可通过肾小球标记物Podocin(Podn)或Nephrin(Neph)的表达来表征。在另一个实施方案中，B4可相对于未分化的(UNFX)B2和B3细胞群表征为氧可调EPO富集群。在另一个实施方案中，B4通过选自下列各项的标记物的表达来表征:趋化因子(C-X-C基序)受体4 (Cxcr4)、内皮素B型受体(Ednrb)、V型胶原a 2 (Col5a2)、钙黏着蛋白5(Cdh5)、组织纤溶酶原激活因子(Plat)、血管生成素2(Angpt2)、激酶插入域蛋白受体(Kdr)、富含半胱氨酸的酸性分泌性蛋白(骨粘连蛋白)(Sparc)、丝甘蛋白(Srgn)、TIMP金属肽酶抑制因子3 (Timp3)、维耳姆斯瘤I (Wtl)、无翅型MMTV整合位点家族成员4 (Wnt4)、G蛋白信号转导调节子4(Rgs4)、血小板-内皮细胞粘附分子(Pecam)和促红细胞生成素(Epo)。
[0019]在所有实施方案中，B3可通过选自下列各项的标记物的表达来表征:水通道蛋白7 (Aqp 7)、含FXYD域的离子转运调节子2 (Fxyd2)、溶质载体家族17 (磷酸钠)成员3 (Slcl7a3)、溶质载体家族 3 成员 I (Slc3al)、紧密连接蛋白(claudin) 2 (Cldn2)、napsinA天冬氨酸肽酶(Napsa)、溶质载体家族2 (易化葡萄糖转运蛋白)成员2 (Slc2a2)、丙氨酰(膜)氨肽酶(Anpep)、跨膜蛋白27 (Tmem27)、酰基辅酶A合成酶介质链家族成员2(Acsm2)、谷胱甘肽过氧化物酶3 (Gpx3)、果糖-1，6- 二磷酸酶I (Fbpl)和丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶2(Agxt2)。在某些其它实施方案中，B3通过血管表达标记物血小板内皮细胞粘附分子(Pecam)和肾小球表达标记物podocin (Podn)来表征。
[0020]在一个方面，本发明提供了一种人肾细胞混合物，其包括第一细胞群、B2和第二细胞群，其中B2包括分离的肾小管细胞富集群，并且其中第二细胞群包括表达血管表达标记物血小板内皮细胞粘附分子(Pecam)和肾小球表达标记物podocin(Podn)的一个或多个细胞群。
[0021]在另一个方面，本发明提供了一种分离的人肾细胞富集群，其包括B2细胞群，其中B2包括分离的肾小管细胞富集群。在一个实施方案中，B2细胞群能够通过HAS-2 (透明质酸合酶-2)的表达在体外和体内生成和/或刺激生成高分子量类型的透明质酸(HA)。在某些实施方案中，B2细胞群不包括密度小于~1.045g/mL的BI细胞群，BI细胞群包括集合管和肾小管系统的大颗粒细胞。在另一个实施方案中，B2细胞群不包括密度介于约1.052g/mL和约1 .063g/mL之间的B3细胞群，B3细胞群包括促红细胞生成素(EPO)生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。在另一个实施方案中，B2细胞群不包括密度介于约1.063g/mL和约1.091g/mL之间的B4细胞群。在另外一个实施方案中，B2细胞群不包括密度大于~1.091g/mL的B5细胞群，B5细胞群包括低颗粒度和低成活力的细胞碎片和小细胞。
[0022]在另一个方面，本发明提供了一种制备人B2细胞群的方法，其包括:a)将包括非富集异质 性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下；和b)提取包括B2细胞群的第一细胞组分。在一个实施方案中，相比非富集细胞群时，通过本发明方法得到的B2细胞群包括较大比例的肾小管细胞以及较小比例的EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。在另一个实施方案中，该方法还包括步骤a)和步骤b)之间的步骤，该步骤包括:将细胞悬液与密度梯度接触以分离一种或多种细胞组分，其中第一细胞组分在离心后存在于比密度介于约1.045g/mL和约1.052g/mL之间的梯度中。
[0023]在另一个方面，本发明提供了一种制备人B4细胞群的方法，其包括:a)将包括非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下；和《提取包括B4细胞群的第一细胞组分。在一个实施方案中，相比非富集细胞群时，通过本发明方法得到的B4细胞群包括较大比例的EPO生成细胞、血管细胞和肾小球细胞以及较小比例的非EPO生成细胞、非血管细胞和非肾小球细胞。在另一个实施方案中，该方法还包括步骤a)和步骤b)之间的步骤，该步骤包括:将细胞悬液与密度梯度接触以分离一种或多种细胞组分，其中第一细胞组分在离心后存在于比密度介于约1.063g/mL和约1.091g/mL之间的梯度中。
[0024]在另一个方面，本发明提供了一种制备人B3细胞群的方法，其包括:a)将包含非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下；和b)提取包括B3细胞群的第一细胞组分。在另一个实施方案中，该方法还包括步骤a)和步骤b)之间的步骤，该步骤包括:将细胞悬液与密度梯度接触以分离一种或多种细胞组分，其中第一细胞组分在离心后存在于比密度介于1.052g/mL和约1.063g/mL之间的梯度中。
[0025]在另一个方面，本发明还提供了一种制备B2细胞制剂的方法，其包括:a)将包含非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下山)将细胞悬液施加到流式细胞仪中，该流式细胞仪能够同时测量细胞群内一个或多个单个细胞的前向散射和侧向散射；c)从细胞群中选出 细胞亚群；d)分选来自细胞群的细胞亚群；和e)将B2细胞亚群与细胞群分离，其中相对于所述细胞群的大部分而言，B2细胞亚群通过高前向散射和高侧向散射来表征。
[0026]在另一个方面，本发明还提供了一种制备B4细胞制剂的方法，其包括:a)将包括非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下山)将细胞悬液施加到流式细胞仪中，该流式细胞仪能够同时测量细胞群内一个或多个单个细胞的前向散射和侧向散射；c)从细胞群中选出细胞亚群；d)分选来自细胞群的细胞亚群；和e)将B4细胞亚群与细胞群分离，其中相对于所述细胞群的大部分而言，B4细胞亚群通过低前向散射和低侧向散射来表征。在所有实施方案中，前向散射对应于细胞尺寸。在所有实施方案中，侧向散射对应于细胞颗粒度。
[0027]在另一个方面，本发明提供了一种用于向有需要的受试者提供稳定和/或改善的肾功能的可植入构建体，其包括:a)生物材料，其包括一种或多种生物相容性的合成聚合物或天然存在的蛋白质或肽；和b)哺乳动物肾细胞的混合物，其包括用生物材料包覆、沉积在其上或其中、截留于其中、悬浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式与其结合的第一细胞群、B2和第二细胞群。在一个实施方案中，用生物材料包覆、沉积在其上或其中、截留于其中、悬浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式与其结合的第二细胞群为B4。在另一个实施方案中，用生物材料包覆、沉积在其上或其中、截留于其中、悬浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式与其结合的第二细胞群为B3。在另一个实施方案中，用生物材料包覆、沉积在其上或其中、截留于其中、悬浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式与其结合的混合物还包括第三细胞群。在某些实施方案中，用生物材料包覆、沉积在其上或其中、截留于其中、悬浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式与其结合的混合物包括B3和B4。在所有实施方案中，混合物可源自哺乳动物肾组织或培养的肾细胞。在一个实施方案中，构建体包括被构建为适于截留和/或附着混合物的三维(3-D)多孔生物材料的生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括被构建为适于包埋、附着、悬浮或包覆哺乳动物细胞的液体或半液体凝胶的生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括被构建为由呈水凝胶形式的主要为高分子量类型的透明质酸(HA)构成的生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括由呈多孔泡沫形式的主要为高分子量类型的透明质酸构成的生物材料。在另外一个实施方案中，构建体包括由大小范围为5.1kDA至2X106kDA以上的HA分子构成的生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括由具有介于约50微米至约300微米之间的孔的聚乳酸基泡沫构成的生物材料。在另外一个实施方案中，构建体包括源自自体肾样本的一个或多个细胞群。在一个实施方案中，肾样本为肾活组织检查样本。在另外一个实施方案中，构建体包括源自非自体肾样本的一个或多个细胞群。在一个实施方案中，构建体提供红细胞稳态。[0028]在另一个方面，本发明提供了一种治疗有需要的受试者的肾病的方法，其包括:a)对受试者施用包含哺乳动物肾细胞混合物的组合物，所述哺乳动物肾细胞混合物包括第一细胞群、B2和第二细胞群；和《确定来自受试者的试样的肾功能指标水平与对照组的指标水平不同，其中指标水平的差值指示受试者的一种或多种肾功能衰退的减轻、稳定或改善。在某些实施方案中，所述方法包括含有第三细胞群的细胞混合物。在一个实施方案中，第二细胞群为B4或B3。在另一个实施方案中，第三细胞群为B4或B3。在某些实施方案中，待由本发明方法治疗的肾病伴随有促红细胞生成素(EPO)缺乏。在某些实施方案中，EPO缺乏为贫血。在一些实施方案中，EPO缺乏或贫血继发于受试者的肾衰竭。在一些其它实施方案中，EPO缺乏或贫血继发于选自下列的疾病:慢性肾衰竭、原发性EPO缺乏、化学疗法或抗病毒疗法、非骨髓癌、HIV感染、肝病、心力衰竭、类风湿性关节炎或多器官系统衰竭。在某些实施方案中，用于该方法的组合物还包括包含一种或多种生物相容性的合成聚合物和/或天然存在的蛋白质或肽的生物材料，其中混合物用生物材料包覆、沉积在其上或其中、截留于其中、悬浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式与其结合。
[0029]在另一个方面，本发明提供了本发明的细胞制剂及其混合物或可植入构建体用于制备治疗有需要的受试者的肾病、贫血或EPO缺乏的制剂的用途。
[0030]在一个方面，本发明提供了一种选定的肾细胞群，其在约1%至约5%的氧含量下暴露约12至约24小时后可通过密度梯度离心来分离，所述梯度包括密度为约1.045g/mL至约1.052g/mL的部分，其中细胞群(i)在离心后保留于密度介于1.045g/mL至约1.052g/mL之间的梯度中；(ii)包括肾小管细胞群，其通过至少一种肾小管细胞标记物的表达来表征；(iii)包括肾小管细胞亚群，其能够转运受体介导的白蛋白；(iv)能够在递送至有患肾病风险或患有肾病的受试者时调节一种或多种肾功能。
[0031]在另一个方面，本发明提供了一种选定的肾细胞群，其在约1%至约5%的氧含量下暴露约12至约24小时后可通过密度梯度离心来分离，所述梯度包括密度为约1.063g/mL至约1.091g/mL的部分,其中细胞群(i)在离心后保留于密度介于约1.063g/mL至约1.091g/mL之间的梯度中；(ii)包括氧可调促红细胞生成素(EPO)表达细胞、肾小球细胞和血管细胞；(iii)能够在递送至有患肾病风险或患有肾病的受试者时调节一种或多种肾功能；和(iv)能够在联合施用时通过权利要求65所述的肾细胞群增强对一种或多种肾功能的调节。
[0032]在另一个方面，本发明提供了一种肾细胞群，其中将所述细胞进行如下操作:i)置于经组织培养处理的标准塑料盘上进行贴壁培养，其中初始密度为25，000个细胞/厘米2，培养基由高含量葡萄糖DMEM和完全补充KSFM培养基的1:1混合物组成，其中含5%的胎牛血清，在37°C和21%的氧气条件下培养24-72小时；ii)用相同培养基更换50-100%的培养基，并在37°C和2%的氧气条件下培养18-24小时；iii)经由胰蛋白酶消化来收集，再悬浮，并用不含血清的KSFM培养基或PBS洗涤；iv)加载到制备好的密度梯度中，所述梯度包含限定密度介于1.045g/mL至约1.052g/mL之间的层，并包含密度较大的至少一层和密度较小的至少一层，其中梯度在15mL圆锥管中制备,液体总体积不小于5mL且不大于14mL，并且加载到该梯度中的细胞数目至少为5000万但不超过I亿；v)通过在800x G下连续离心20-30分钟来迫使细胞通过梯度；在介于1.045g/mL和1.052g/mL之间的密度处分段；和/或通过选自下列各项的标记物表征:巨蛋白、cubilin、透明质酸合酶2 (HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、N-钙黏着蛋白(Ncad)、E-钙黏着蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1 (Aqpl)、水通道蛋白_2(Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rab17)、GATA结合蛋白3 (Gata3)、含FXYD域的离子转运调节子4 (FxycM)、溶质载体家族9 (钠/氢交换剂)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员BI (Aldh3bl)、醛脱氢酶I家族成员A3(Aldhla3)、钙蛋白酶-8 (CapnS)和水通道蛋白_4 (Aqp4)标记物；和/或能够使患有肾病的免疫相容受试者的一种或多种肾功能 的衰退减轻，使其稳定或改善。
[0033]在另一个方面，本发明提供了一种肾细胞群，其中将所述细胞进行如下操作:i)置于经组织培养处理的标准塑料盘上进行贴壁培养，其中初始密度为25，000个细胞/厘米2，培养基由高含量葡萄糖DMEM和完全补充KSFM培养基的1:1混合物组成，其中含5%的胎牛血清，在37°C和21%的氧气条件下培养24-72小时；ii)用相同培养基更换50-100%的培养基，并在37°C和2%的氧气条件下培养18-24小时；iii)经由胰蛋白酶消化来收集，再悬浮，并用不含血清的KSFM培养基或PBS洗涤；iv)加载到制备好的密度梯度中，所述梯度包含限定密度介于1.063g/mL至约1.091g/mL之间的层，并包含密度较大的至少一层和密度较小的至少一层，其中梯度在15mL圆锥管中制备,液体总体积不小于5mL且不大于14mL,并且加载到该梯度中的细胞数目至少为5000万但不超过I亿；V)通过在800x G下连续离心20-30分钟来迫使细胞通过梯度；在介于1.063g/mL和约1.091g/mL之间的密度处分段；和/或通过选自下列各项的标记物表征:VEGF、KDR、HIFla、Podocin (Podn)或Nephrin (Neph)、趋化因子(C-X-C基序)受体4 (Cxcr4)、内皮素B型受体(Ednrb)、V型胶原a2(Col5a2)、钙黏着蛋白5(Cdh5)、组织纤溶酶原激活因子(Plat)、血管生成素2(Angpt2)、激酶插入域蛋白受体(Kdr)、富含半胱氨酸的酸性分泌性蛋白(骨粘连蛋白)(Sparc)、丝甘蛋白(Srgn)、TIMP金属肽酶抑制因子3(Timp3)、维耳姆斯瘤I (Wtl)、无翅型MMTV整合位点家族成员4(Wnt4)、G蛋白信号转导调节子4(Rgs4)、血小板-内皮细胞粘附分子(Pecam)和促红细胞生成素(Epo);和/或能够使患有肾病的免疫相容受试者的一种或多种肾功能的衰退减轻，使其稳定或改善。
[0034]在一个方面，本发明提供了分离的促红细胞生成素(EPO)生成肾细胞群。在一个实施方案中，该细胞群为分离的EPO生成哺乳动物细胞富集群。在另一个实施方案中，该细胞群为分离的促红细胞生成素(EPO)生成哺乳动物细胞富集群，其相比包含促红细胞生成素(EPO)生成哺乳动物细胞群的非富集群而言，其包含较大比例的EPO生成细胞。
[0035]该细胞群可源自肾组织或培养的肾细胞。该细胞群可源自得自受试者的肾样本。该样本可为来源于得自受试者的肾样本的肾组织或培养的肾细胞。在另一个实施方案中，该细胞群相比包含EPO生成哺乳动物细胞的非富集群而言包含较大比例的EPO生成细胞。在另一个实施方案中，该细胞群相比包含促红细胞生成素(EPO)生成哺乳动物细胞的非富集群而言包含较小比例的肾小管细胞。
[0036]在所有实施方案中，该细胞群可富集EPO生成细胞。在所有实施方案中，该细胞群可富集非EPO生成细胞。在所有实施方案中，该细胞群可富集肾小管细胞。
[0037]在另一个方面，本发明提供了在某些培养条件下生物应答的促红细胞生成素(EPO)生成细胞的细胞群。在另一个实施方案中，当相对于在非低氧条件下培养的细胞群而将细胞群在低氧条件下培养时，生物应答为EPO表达的诱导。在另一个实施方案中，当相对于在非低氧条件下培养的细胞群而将细胞群在低氧条件下培养时，生物应答为EPO表达的增加。在一些实施方案中，低氧培养条件包括但不限于相对于在氧含量未降低的条件下培养的细胞群而言，将细胞群的培养体系中的可用氧含量降低。在另一个实施方案中，可用氧含量的降低约小于5%,而氧含量未降低的条件为大气氧含量(约21%)。在另一个实施方案中，相比在大于或等于21%的氧含量下试验的培养物而言，可在低于大气水平(21%)的氧含量下观察到EPO表达的增加。在另一个实施方案中，当将细胞在约小于5%的氧气(即低氧培养条件)下培养时，并且将诱导水平和/或增加的表达与在大气氧含量(约21%)(即非低氧培养条件)下培养的细胞进行比较时，可观察到EPO表达的诱导和/或增加。在一个实施方案中，对低氧条件生物应答的EPO表达通过低氧诱导因子HIF来调节。在另一个实施方案中，对低氧条件生 物应答的EPO表达通过HIFla来调节。在另一个实施方案中，对低氧条件生物应答的EPO表达通过低氧诱导因子HIF2 a来调节。
[0038]在一个实施方案中，当相对于未经灌流培养的细胞群而将细胞群经由灌流培养时，生物应答为EPO表达的诱导。在另一个实施方案中，相对于未经灌流培养的细胞群而言，生物应答为EPO表达的增加。在一些实施方案中，灌流条件包括但不限于对流体进行短暂、间歇或连续的循环或搅拌，使得动力经由流体流动传递至细胞。在另一个实施方案中，所进行的灌流培养条件应使得细胞群在可提供允许形成三维结构的骨架和/或空间的材料中或其上培养。
[0039]在另一个方面，本发明提供了包含本文所述细胞群的肾细胞的混合物或组合。在一个实施方案中，细胞混合物包括富集EPO生成细胞的第一细胞群和未富集EPO生成细胞的第二细胞群。在另一个实施方案中，第二细胞群可包含一种或多种类型的肾源细胞，其可包括但不限于下列一种或多种细胞:源自肾小管的细胞、源自肾小球的细胞、源自间质组织的细胞、源自集合管的细胞、源自结缔组织的细胞、源自血液的细胞或源自血管的细胞。在另一个实施方案中，第二细胞群富集肾小管细胞。
[0040]在所有实施方案中，本文所述的肾小管细胞可通过肾小管细胞标记物的表达来表征，所述肾小管细胞标记物可包括但不限于下列各项的一种或多种:透明质酸合酶
2(HAS2)、CYP2D25 (维生素D325-羟化酶)、巨蛋白、cubilin、神经钙黏着蛋白、上皮钙黏着蛋白、水通道蛋白-1、水通道蛋白-2、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含FXYD域的离子转运调节子4 (Fxyd4)、溶质载体家族9 (钠/氢交换剂)成员
4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员BI (Aldh3bl)、醛脱氢酶I家族成员A3 (Aldhla3)和钙蛋白酶-8 (Capn8)。
[0041]在一个方面，本发明提供了分离的哺乳动物肾小管细胞富集群。在一个实施方案中，分离的细胞群富集肾小管细胞并包含至少一些EPO生成哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，该细胞群相比包含肾小管细胞的非富集群而言具有较大比例的肾小管细胞。在另一个实施方案中，分离的哺乳动物肾小管细胞富集群相比包含肾小管细胞的非富集群而言包含较大比例的肾小管细胞和至少一些EPO生成哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，相比未分化的异质性混合物或相比EPO生成细胞富集群而言，哺乳动物肾小管细胞富集群相对缺乏EPO生成细胞。
[0042]在所有实施方案中，本文所述的肾细胞群或肾细胞群混合物的来源类型可为自体的、同种异体的、同系的(自体的或同基因的)及其任意组合。例如，在一些实施方案中，细胞混合物可包含(i)源自自体源的第一细胞群和源自自体源的第二细胞群；或(ii)源自自体源的第一细胞群和源自同种异体源的第二细胞群。
[0043]在另一个方面，本发明提供了产生富集EPO生成细胞的细胞群的方法。在一个实施方案中，该方法包括下列步骤:a)由机械分离或酶消化的哺乳动物肾组织制备具有非富集异质性啮齿动物肾细胞群的细胞悬液；b)将细胞悬液与密度梯度接触，以基于浮力密度分离一种或多种细胞组分；c)将步骤b)的细胞悬液离心以限定一种或多种细胞组分；和
d)提取包含富集细胞 群的第一细胞组分，其中富集细胞群相比非富集细胞群具有较大比例的EPO生成细胞和较小比例的非EPO生成细胞。在另一个实施方案中，密度梯度包括比密度介于约1.025g/mL和约1.035g/mL之间或小于约1.045g/mL的层。在另一个实施方案中，步骤d)的第一细胞组分在离心后存在于比密度介于约1.025g/mL和约1.035g/mL之间或小于约1.045g/mL的梯度中。在另一个实施方案中，离心步骤(c)还产生至少一种附加细胞组分，其未富集所述EPO生成富集细胞群。在另一个实施方案中，该方法还包括步骤e)提取至少一种附加细胞组分。在另一个实施方案中，密度梯度包括比密度介于约1.062g/mL和约1.088g/mL之间的层。在另一个实施方案中，附加细胞组分在离心后存在于比密度介于约1.062g/mL和约1.088g/mL之间的梯度中。
[0044]在另一个实施方案中，该方法包括下列步骤:a)由培养的包含至少一些表达或能够表达EPO的细胞的非富集异质性哺乳动物细胞群制备细胞悬液；b)使细胞悬液与密度梯度接触，以基于浮力密度分离一种或多种细胞组分；c)将步骤b)的细胞悬液离心，以限定一种或多种细胞组分；和d)提取包含富集细胞群的第一细胞组分，其中相比非富集细胞群，富集细胞群具有较大比例的EPO生成细胞和较小比例的非EPO生成细胞。在一个实施方案中，步骤a)的细胞悬液得自培养的非富集异质性啮齿动物细胞群。在此实施方案中，密度梯度包括比密度介于约1.073g/mL和约1.091g/mL之间的层。在一个实施方案中，步骤d)的第一细胞组分在离心后存在于比密度介于约1.073g/mL和约1.091g/mL的梯度中。在另一个实施方案中，离心步骤(c)还产生至少一种附加细胞组分，其未富集所述EPO生成富集细胞群。在另一个实施方案中，该方法还包括步骤e)提取至少一种附加细胞组分。在另一个实施方案中，密度梯度包括比密度介于约1.041g/mL和约1.062g/mL之间的层。在另一个实施方案中，附加细胞组分在离心后存在于比密度介于约1.041g/mL和约1.062g/mL之间的梯度中。
[0045]在一些实施方案中，富集细胞群富集EPO生成细胞，而缺乏非EPO生成细胞。在其它实施方案中，富集细胞群富集间质成纤维细胞，而缺乏肾小管细胞和集合管细胞。在另一个实施方案中，富集细胞群富集EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。在另一个实施方案中，离心步骤(c)还产生至少一种附加细胞组分，其未富集所述富集细胞群。在一些实施方案中，相比非富集细胞群而言，附加细胞组分包含较大比例的非EPO生成细胞和较小比例的EPO生成细胞。在一个实施方案中，相比第一细胞组分而言，至少一种附加细胞组分具有较小比例的EPO生成细胞。在另一个实施方案中，相比第一细胞组分而言，附加细胞组分包含较大比例的肾小管细胞。
[0046]在一些实施方案中，产生富集EPO生成细胞的细胞群的方法中所使用的密度梯度为碘克沙醇密度梯度。
[0047]在另一个方面，本发明提供了使用流式细胞术产生促红细胞生成素EPO生成细胞富集群的方法。在一个实施方案中，该方法包括下列步骤:a)由机械分离或酶消化的哺乳动物肾组织制备包含非富集异质性肾细胞群的细胞悬液山)将细胞悬液施加到流式细胞仪中，该流式细胞仪能够同时测量细胞群内一个或多个单个细胞的前向散射和侧向散射；c)从细胞群中选出细胞亚群；d)分选来自细胞群的细胞亚群；和e)将细胞亚群与细胞群分离，其中相对于整个细胞群而言，细胞亚群通过低前向散射和低侧向散射来表征。
[0048]在另一个实施方案中，该方法包括下列步骤:a)由培养的包含至少一些表达或能够表达EPO的细胞的哺乳动物细胞群制备细胞悬液；b)将细胞悬液施加到流式细胞仪中，该流式细胞仪能够同时测量细胞群内一个或多个单个细胞的前向散射和侧向散射；c)从细胞群中选出细胞亚群；d)分选来自细胞群的细胞亚群；和e)将细胞亚群与细胞群分离，其中相对于整个细胞群而言，细胞亚群通过低前向散射和低侧向散射来表征。
[0049]在另一个实施方案中，前向散射对应于细胞尺寸。在一个实施方案中,侧向散射对应于细胞粒度。本发明的其它实施方案提供了富集的细胞组分，其:i)富集EPO生成细胞而缺乏非EPO生成细胞；或ii)富集生成EPO的特化间质皮质成纤维细胞而缺乏上皮细胞细胞。在另一个实施方案中，选择步骤c)包括产生所述未富集细胞群的至少一种附加组分。在另一个实施方案中，相比EPO富集组分而言，一种或多种附加组分包含较小比例的EPO生成细胞。
[0050]在本发明的另一方面，所述方法包括进一步体外培养的步骤。在一个实施方案中，在分离后将富集细胞群进行体外培养。在另一个实施方案中，该培养步骤包括在适于支持所述细胞群生长和/或维持的培养基中，在适于哺乳动物细胞培养的玻璃或塑料表面上采用二维单层培养。在其它实施方案中，培养步骤包括在适于细胞维持和/或生长的三维(3D)支架上培养细胞。在另一个实施方案中，支架包含一种或多种生物相容性的合成聚合物或天然存在的蛋白质或肽。在另一个实施方案中，支架被构建为适于截留或附着哺乳动物细胞的多孔支架。在其它实施方案中，支架被构建为适于包埋、附着或包覆哺乳动物细胞的凝胶。
[0051] 在另一个方面，本发明提供了包括在灌流条件下进行培养步骤的方法。在一个实施方案中，灌流条件包括但不限于对流体进行短暂、间歇或连续的循环或搅拌，使得动力经由流体流动传递至细胞。在另一个实施方案中，所进行的灌流培养条件应使得细胞群在可提供允许形成三维结构的骨架和/或空间的材料中或之上培养。
[0052]在另一个方面，本发明提供了包括在低氧条件下进行培养的步骤的方法。在一些实施方案中，低氧培养条件包括但不限于相对于在氧含量未降低的条件下培养的细胞群而言，将细胞群的培养体系中的可用氧含量降低。在另一个实施方案中，可用氧含量的降低约小于5%,而氧含量未降低的条件为大气氧含量(约21%)。在另一个实施方案中,低氧条件以氧含量小于21% (大气)为代表。
[0053]在另一个方面，本发明提供了包括对细胞群中的EPO表达进行测量的步骤的方法。在所有实施方案中，EPO表达为EPO mRNA表达。在所有实施方案中，可检测和/或检测出EPO表达。在另一个实施方案中，相对于未经灌流培养的细胞群而言，EPO表达在经由灌流培养的细胞群中诱导。在其它实施方案中，相对于在非低氧条件下培养的细胞群而言，EPO表达在低氧条件下培养的细胞群中诱导。在另一个实施方案中，相对于未经灌流培养的细胞群而言，经灌流培养的细胞群中可检测到的EPO表达较高。在其它实施方案中，相对于在非低氧条件下培养的细胞群而言，低氧条件下培养的细胞群中可检测到的EPO表达较高。在另一个实施方案中，当将细胞在约小于5%的氧气(即，低氧培养条件)下培养，并且将诱导水平和/或增加的表达与在大气氧含量(约21%)(即，非低氧培养条件)下培养的细胞进行比较时，可观察到EPO表达的诱导和/或增加。在另一个实施方案中，在低于21%氧气(大气)的条件下培养细胞时可观察到EPO表达的增加。
[0054]在另一个方面，本发明提供了包含本文所述的一个或多个细胞群的可植入构建体。在一个实施方案中，本发明提供了一种用于向有需要的受试者提供促红细胞生成素(EPO)生成细胞群 的可植入构建体，其中该构建体包括:a)支架，其包含一种或多种生物相容性的合成聚合物或天然存在的蛋白质或肽；和幻富集EPO生成哺乳动物细胞的第一细胞群，其沉积在支架表面上或表面中。
[0055]在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于向有需要的受试者提供促红细胞生成素EPO生成细胞群的可植入构建体，其中该构建体包括:a)多孔支架，其包含一种或多种生物相容性的合成聚合物或天然存在的蛋白质或肽；和b)细胞混合物，其包含i)富集EPO生成哺乳动物细胞的第一细胞群，和ii)富集非EPO生成细胞的第二细胞群，其中细胞混合物沉积在支架表面上和/或支架孔内。在一些实施方案中，相对于第二细胞群而言，第一细胞群中的EPO表达较高。在另一个实施方案中，第二细胞群包含一种或多种肾源细胞类型，其可包括但不限于下列一种或多种细胞:源自肾小管的细胞、源自肾小球的细胞、源自间质组织的细胞、源自结缔组织的细胞、源自集合管的细胞、源自血液的细胞或源自血管的细胞。在另一个实施方案中，第二细胞群富集肾小管细胞。本发明的一些实施方案提供了富集肾小管细胞的细胞群，所述肾小管细胞通过肾小管细胞标记物的表达来表征，所述肾小管细胞标记物包括但不限于下列蛋白的一种或多种:巨蛋白、cubilin、神经钙黏着蛋白、上皮钙黏着蛋白、水通道蛋白-1和水通道蛋白_2。
[0056]在一个实施方案中，本发明所提供的肾细胞混合物可包括源自本文所述类型的肾组织源的细胞群。在其它实施方案中，第一细胞群和第二细胞群源自肾组织或培养的肾细胞。在另一个实施方案中，相比包含促红细胞生成素(EPO)生成哺乳动物细胞的非富集群而言，第一细胞群包含较大比例的EPO生成细胞。在另一个实施方案中，除了 EPO生成细胞外，第一细胞群还包含肾小球细胞和血管细胞。在另一个实施方案中，相比第二细胞群而言，第一细胞群包含较大比例的EPO生成细胞。本发明的其它实施方案包括第一细胞群，相比促红细胞生成素(EPO)生成哺乳动物细胞的非富集群而言，该第一细胞群包含较小比例的肾小管细胞。在其它实施方案中，相比第二细胞群而言，第一细胞群包含较小比例的肾小管细胞。在一些实施方案中，用细胞和生物材料配合。在一个实施方案中，将支架或生物材料构建为三维(3-D)多孔支架。在另一个实施方案中，3-D多孔支架适于截留或附着哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，将支架或生物材料构建为适于包埋、附着或包覆哺乳动物细胞的液体或半液体凝胶。在一个实施方案中，适用于本发明构建体的细胞群源自自体或非自体肾样本。在另一个实施方案中，样本为肾活组织检查样本。
[0057]在另一个方面，本发明提供了对需要富集EPO生成细胞的细胞群的受试者进行治疗的方法。在一个实施方案中，治疗有需要的促红细胞生成素(EPO)缺乏的受试者的方法包括对受试者施用组合物的步骤，该组合物包含富集EPO生成哺乳动物细胞的第一细胞群。在另一个实施方案中，第一细胞群富集EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。在一个实施方案中，EPO缺乏为贫血。在另一个实施方案中，EPO缺乏或贫血继发于受试者的肾衰竭。在另一个实施方案中，EPO缺乏或贫血继发于选自下列的疾病:慢性肾衰竭、原发性EPO缺乏、化学疗法或抗病毒疗法、非骨髓癌、HIV感染、肝病、心力衰竭、类风湿性关节炎或多器官系统裳竭。[0058]在另一个实施方案中，治疗有需要的肾病受试者的方法包括对受试者施用组合物的步骤，该组合物包含富集EPO生成哺乳动物细胞的第一细胞群。在另一个实施方案中，第一细胞群富集EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。
[0059]在一些实施方案中，向有需要的受试者施用的组合物还包含未富集EPO生成细胞的第二肾细胞群。在其它实施方案中，所述组合物还包括多孔支架，该多孔支架包含一种或多种生物相容性的合成聚合物和/或天然存在的蛋白质或肽，其中第一细胞群沉积在支架表面上和/或支架的孔内。在另一个实施方案中，该组合物还包括多孔支架，该多孔支架包含一种或多种生物相容性的合成聚合物和/或天然存在的蛋白质或肽，其中第一细胞群和第二细胞群沉积在支架表面上和/或支架孔内。在另一个实施方案中，第一细胞群和/或第二细胞群源自哺乳动物肾组织或培养的哺乳动物肾细胞。在其它实施方案中，第一细胞群和/或第二细胞群源自自体或非自体肾样本。在一个实施方案中，样本为肾活组织检查样本。
[0060]在一个实施方案中，第二细胞群富集肾小管细胞。在另一个实施方案中，肾小管细胞通过肾小管细胞标记物的表达来表征，所述肾小管细胞标记物可包括但不限于下列蛋白的一种或多种:巨蛋白、cubilin、神经钙黏着蛋白、上皮钙黏着蛋白、水通道蛋白-1和水通道蛋白-2。
[0061]在所有的实施方案中，第二细胞群包含选自下列的一种或多种肾源细胞类型:源自肾小管的细胞、源自肾小球的细胞、源自间质组织的细胞、源自集合管的细胞、源自结缔组织的细胞、源自血液的细胞或源自血管的细胞。在所有实施方案中，相对于异质性未分化群或第一细胞群而言，第二细胞群相对缺乏肾小球细胞、血管细胞和氧应答EPO生成细胞。
[0062]在另一个方面，本发明包括为有需要的受试者提供红细胞稳态的方法。在一个实施方案中，该方法包括下列步骤:a)对受试者施用组合物，该组合物包含富集EPO生成哺乳动物细胞的第一细胞群；和b)确定来自受试者的样本中红细胞生成功能指标水平与对照组的指标水平不同，其中指标水平的差值指示受试者的红细胞稳态。
[0063]在另一个实施方案中，该方法包括下列步骤:a)对受试者施用组合物，该组合物包含富集EPO生成哺乳动物细胞的第一细胞群和未富集EPO生成细胞的第二细胞群；和b)确定来自受试者的样本中红细胞生成功能指标水平与对照组的指标水平不同，其中指标水平的差值指示受试者的红细胞稳态。
[0064]在另一个方面，本发明包括改善有需要的受试者的肾功能的方法。在另一个实施方案中，该方法包括下列步骤:a)对受试者施用组合物，该组合物包含富集EPO生成哺乳动物细胞的第一细胞群；和b)确定来自受试者的样本中肾功能指标水平与对照组的指标水平不同，其中指标水平的差值指示受试者的肾功能得到改善。在另一个实施方案中，所述组合物还包括多孔支架，该多孔支架包含一种或多种生物相容性的合成聚合物和/或天然存在的蛋白质或肽，其中第一细胞群沉积在支架表面上和/或支架孔内。
[0065]在另一个实施方案中，该方法包括下列步骤:a)对受试者施用组合物，该组合物包含富集EPO生成哺乳动物细胞的第一细胞群和未富集EPO生成细胞的第二细胞群；和b)确定来自受试者的样本中肾功能指标水平与对照组的指标水平不同，其中指标水平的差值指示受试者的肾功能得到改善。在另一个实施方案中，所述组合物还包括多孔支架，该多孔支架包含一种或多种生物相容性的合成聚合物和/或天然存在的蛋白质或肽，其中第一细胞群和第二细胞群沉积在支架表面上和/或支架孔内。
[0066]在其它实施方案中，第一细胞群和/或第二细胞群源自哺乳动物肾组织或培养的哺乳动物肾细胞。在另一个实施方案中，第一细胞群和/或第二细胞群源自自体或非自体肾样本。在另一个实施方案中，样本为肾活组织检查样本。 [0067]在一个实施方案中，第一细胞群富集低氧应答EPO生成细胞。在另一个实施方案中，第一细胞群富集低氧应答EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。
[0068]在一个实施方案中，第二细胞群富集肾小管细胞。在另一个实施方案中，肾小管细胞通过肾小管细胞标记物的表达来表征，所述肾小管细胞标记物可包括但不限于以下物质的一种或多种:透明质酸合酶2(HAS2)、CYP2D25 (维生素D325-羟化酶)、巨蛋白、cubilin、神经钙黏着蛋白、上皮钙黏着蛋白、水通道蛋白-1、水通道蛋白-2和水通道蛋白-4。在另一个实施方案中，第二细胞群富集肾小管细胞并包含集合管的上皮细胞。在另一个实施方案中，第二细胞群相对富集肾小管细胞，包含集合管上皮细胞，而相对缺乏低氧应答EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。
[0069]附图简述
[0070]图1示出突出患病肾组织相比正常肾组织的纤维化的Gomori Trichrome染色。
[0071]图2示出患慢性肾病的猪的细胞中促红细胞生成素基因的氧调节表达。
[0072]图3示出增殖培养物中的小管样结构。
[0073]图4示出培养的功能性肾小管细胞对受体介导的白蛋白吸收。
[0074]图5示出EPO表达在分离后比在初始人肾组织中相对更高。
[0075]图6示出培养的人肾细胞中对EPO基因表达的保留水平。
[0076]图7示出大气(21%)氧含量下的3D培养物中动态培养的(+)ΕΡ0表达的结果。
[0077]图8示出低(2%)氧含量下的3D培养物中动态培养的(+)ΕΡ0的表达。
[0078]图9示出长期培养物中动态培养的(+)肾小管基因的表达。[0079]图10示出低氧培养物(相对常氧培养物)中的EPO表达。
[0080]图11示出体外动态3D培养物对EPO表达的刺激。
[0081]图12A-12B示出从2D培养物和3D培养物中收集的细胞裂解物(图12A)和条件培养基(图12B)中定量靶蛋白的ELISA结果。
[0082]图13示出H&E染色的接种OPLA和I型胶原支架(灌流或静态培养(7)天后染色)，其通过标准技术固定在10%福尔马林缓冲液中并经石蜡包埋。进行H&E染色以检验细胞的存在和形态。灌流支架中的细胞含量高于静态支架中的细胞含量，相比OPLA支架，I型胶原支架中的细胞含量明显更高。灌流I型胶原支架中的细胞形成相比静态I型胶原支架中更为显著。
[0083]图14A-14H示出(灌流或静态)培养(7)天后OPLA和I型胶原支架的扫描式电子显微照片(SEM)。注意到灌流(相比静态)具有更高的细胞含量，并且在I型胶原支架灌流(相比静态)条件下具有优良的细胞形成和互联性。
[0084]图15示出通过添加裂解缓冲液(Qiagen)从支架或2D培养物分离的mRNA的RT-PCR结果。对于3D支架，利用电匀浆化(polytron)来确保RNA的充分裂解与释放。用对目标靶基因特异的内含子跨越引物对纯化的mRNA进行RT-PCR分析(泳道1_7:各3D结构(灌流)/5日培养物；泳道8-10:各2D结构/5日培养物；泳道11-17:各初始细胞群(接种前)；泳道18-19:2D培养物/4日培养物；泳道21:宏观解剖的新鲜组织)。
[0085]图16示出三种不同接种的支架中的代谢活性。
[0086]图17A-17D示出原代肾细胞的灌流和静态3D培养物对葡萄糖和谷氨酰胺的消耗。
[0087]图18示出治疗后的啮齿动物平均存活率(天)。
[0088]图19示出整个研究过程中的啮齿动物体重。
[0089]图20图示了治疗前至死亡期间的重量增量。
[0090]图21示出每周平均血清BUN浓度。
[0091]图22示出每周平均血清肌酸酐浓度。
[0092]图23示出中期时的相对BUN/个体大鼠数据。
[0093]图24示出中期时的相对血清肌酸酐/个体大鼠数据。
[0094]图25示出每周中期时的平均HCT、相对HCT (个体大鼠数据)。
[0095]图26A示出中期时的相对HCT (个体大鼠数据)。
[0096]图26B和26C示出肾切除术后的血清肌酸酐(图26B)和血细胞比容(图26C)。
[0097]图27示出每周的平均RBC#。
[0098]图28示出中期时的相对RBC#/个体大鼠数据。
[0099]图29A-29E示出最终血清电解质浓度。
[0100]图30示出相对血清磷(最终)/个体大鼠数据。
[0101]图31A-31D示出最终血清蛋白浓度。
[0102]图32A-32B示出相对血清白蛋白&蛋白总量(最终)/个体大鼠数据。
[0103]图33A-33D示出最终血清肝功能。
[0104]图34A-34C示出最终血清胆固醇、三酸甘油酯和葡萄糖。
[0105]图35A-35C示出相对血清胆固醇、三酸甘油酯、葡萄糖(最终)/个体大鼠数据。
[0106]图36A-36C 示出最终 Hb、MCH 和 MCHC。[0107]图37示出最终相对[Hb]/个体大鼠数据。
[0108]图38示出最终WBC计数。
[0109]图39示出最终WBC组成。
[0110]图40A-40B示出最终网织红细胞。
[0111]图41A-41B示出最终血小板数据。
[0112]图42示出游泳试验结果。
[0113]图43示出每个试验组的代表性H&E-染色的骨髓组织切片。上图显示，与对照组相t匕，肾切除+细胞注入组的骨髓细胞含量和骨髓与红细胞的比率看起来相同。相比之下，肾切除+构建体组和未治疗动物组中的骨髓分别显示出中度、显著降低的骨髓细胞含量(放大率200倍)。下图示出上图中被框起的图的高清视图(放大率未知)。
[0114]图44A-44B示出每个试验组的代表性H&E-染色的脾组织切片。图显44A示在对照组和肾切除+细胞注入组之间没有观察到显著的组织学差异或变化。相比之下，在肾切除+构建体组和未治疗动物组中的紧邻囊下的红髓间隙，显示成人红细胞(RBC)和RBC前体分别存在中度和 显著的降低(放大率200倍)。图44B示出图44A中被框起的图的高清视图(放大率未知)。
[0115]图45A-45B示出每个试验组的代表性H&E-染色的肝组织切片。相比对照组，在肾切除+构建体组或未治疗的肾切除动物组中未观察到显著的肝实质和/或肝门三联征变化。相比之下，未在肾切除+细胞注入组中观察到窦状隙血细胞生成焦点区(圆形)(放大率200倍)。图45B示出图45A中示出的肝门三联征的高清视图(放大率未知)。
[0116]图46A-46B示出每个试验组的代表性H&E-染色的肾组织切片(放大率I倍)。图46A显示，相比对照组，其它三组的肾切片显示出结构缺失的进行性肾小球和肾小管变性，在所有对照组中，通过不良的血铁黄素和多灶性肾小管再生来表征(放大率200倍)。箭头指向构建体治疗部位。图46B示出图46A中被框起的图的高清视图(放大率未知)。
[0117]图47示出个体大鼠数据/HCT%(相对血清肌酸酐)。第5组=实心圆；第6组=环绕的“3”；第4组=环绕的“I”;第I组=环绕的“4”;第2组=环绕的“2”。
[0118]图48A-48B示出采用多层分级梯度技术(图48A)或单层混合梯度技术使来自新鲜分离肾组织的epo生成细胞组分富集。两种方法均导致非epo生成细胞组分(主要为肾小管细胞)从epo带局部缺失,该epo带介于1.025g/mL和1.035g/mL之间。
[0119]图49A示出确定上皮钙黏着蛋白表达的定量实时PCR(QRTPCR)结果。
[0120]图49B示出采用密度分级梯度确定Epo富集的定量实时PCR(QRTPCR)结果。
[0121]图50A-50C图示了分级梯度组分在分离和培养时的相对基因表达。图50A和50B示出在组织分离后立即进行密度梯度分离的两批独立的原代肾细胞。在两批细胞中，促红细胞生成素(Epo)mRNA的表达在分级梯度的带I中可再生地富集。将所有样本中的Epo表达标准化为新鲜消化的异质性肾细胞群。图50C清楚地显示除了富集EPO表达外，带I还相对缺乏肾小管细胞，这可通过肾小管标记物、神经钙黏着蛋白、上皮钙黏着蛋白、水通道蛋白I和水通道蛋白2的低表达来证实。相比之下，肾小管标记物在带2和带3中富集，突出分级梯度的附加特征-同时富集肾小管细胞组分。
[0122]图51示出水通道蛋白-1 (肾小管细胞标记物)的蛋白质印迹分析(Western Blotanalysis)。此蛋白质印迹示出水通道蛋白I在带2和带3中有清晰和明确的富集,这进一步支持了组分2和组分3的肾小管细胞富集，如图2中图(d)所描述。
[0123]图52示出治疗后16周的血细胞比容水平。
[0124]图53示出治疗后12周的血红蛋白水平。
[0125]图54示出用两种不同剂量的rEPO治疗的5/6肾切除大鼠(与对照组和未治疗组相比)随时间变化的血细胞比容水平。
[0126]图55示出用高和低剂量的EPO富集细胞治疗的5/6肾切除大鼠(与肾小管富集细胞和rEPO相比)随时间变化的血细胞比容水平。
[0127]图56A和56B示出治疗后16周的血清肌酸酐浓度以及治疗前至治疗后16周期间肌酸酐占对照组的百分比。
[0128]图57不出治疗后12周的游泳耐力结果。
[0129]图58示出治疗后16周的重量增量占初始重量的百分比。
[0130]图59示出未治疗的尿毒症大鼠和用高剂量EPO富集细胞(原型#2)或肾小管富集细胞(原型#4)治疗的尿毒症大鼠中血清肌酸酐占健康对照组的百分比。
[0131]图60示出未治疗的尿毒症大鼠和用高剂量EPO富集细胞(原型#2)或肾小管富集细胞(原型#4)治疗后12周的尿毒症大鼠中白蛋白/球蛋白的比率。 [0132]图61示出未治疗的尿毒症大鼠和用高剂量EPO富集细胞(原型#2)或肾小管富集细胞(原型#4)治疗后12周的尿毒症大鼠中憐丐的比率。
[0133]图62示出未治疗的尿毒症大鼠和用高剂量EPO富集细胞(原型#2)或肾小管富集细胞(原型#4)治疗后12周的尿毒症大鼠中的血清三酸甘油酯水平。
[0134]图63示出未治疗的尿毒症大鼠和用高剂量EPO富集细胞(原型#2)或肾小管富集细胞(原型#4)治疗后12周的尿毒症大鼠中的血清胆固醇水平。
[0135]图64示出未治疗的尿毒症大鼠和用高剂量EPO富集细胞(原型#2)或肾小管富集细胞(原型#4)处理后12周的尿毒症大鼠中的血清血红蛋白水平。
[0136]图65示出未治疗的尿毒症大鼠和用高剂量EPO富集细胞(原型#2)或肾小管富集细胞(原型#4)治疗后12周的尿毒症大鼠中的血细胞比容水平。
[0137]图66示出功能性啮齿动物