专利名称：一种巨大口蘑原生质体及其制备方法巨大口蘑CTricholoma giganteum)又称大白口蘑，为担子菌亚门层菌纲伞菌目口蘑科口蘑属食用真菌，其子实体营养丰富、含有多种多糖。巨大口蘑是一种野生珍稀食用菌，有极高的经济价值和营养价值。其子实体质地致密，在12°C贮藏30天，不变色，不变味， 不易腐烂，尤其不易褐变，即使是机械损伤后，很长时间也不会褐变。因为食用菌的原生质体全能性较易体现，所以原生质体诱变、融合育种技术是目前食用菌高产菌株及新菌株选育手段中最为高效经济的方法之一。而原生质体的成功制备是原生质体诱变、融合育种技术的必要条件。目前国内没有对巨大口蘑原生质体制备工艺及方法的研究，对其他食用菌原生质体制备大多使用溶壁酶，但单一的使用溶壁酶不仅价格昂贵而且效果不理想，原生质体的释放量和再生率均处于较低的水平。因此，采用一种更廉价、并且能提高了原生质体的释放量和再生率的方法制备巨大口蘑原生质体具有很大的意义。
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种巨大口蘑原生质体的制备方法。该方法采用蜗牛酶和纤维素酶的混合酶液代替溶壁酶，可以大大降低巨大口蘑原生质体的制备费用，同时，所述制备方法得到的原生质体的释放量和再生率均处于较高水平。本发明的另一目的在于提供由所述制备方法得到的巨大口蘑原生质体。本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现一种巨大口蘑原生质体的制备方法，采用蜗牛酶与纤维素酶组成的混合酶液对巨大口蘑菌丝进行酶解，所述混合酶液中，纤维素酶的质量浓度为3. 5 4. 0%，蜗牛酶的质量浓度为0. 5 1. 0%，余量为渗透压稳定剂。作为一种优选方案，所述巨大口蘑原生质体的制备方法具体包括如下步骤(1)将巨大口蘑菌丝与渗透压稳定剂混合，于7000 10000r/min离心15 20min，将所得沉淀用渗透压稳定剂洗涤，得到预处理后的菌丝；(2)将预处理后的菌丝按每300 500mg菌丝加入ImL的混合酶液中，置于四 32°C水浴恒温培养3. 5 4. 5h，隔30 40min摇动一次，得到酶解液；(3)对酶解液进行过滤，滤液于3000 4000r/min离心15 20min，弃上清液，收集沉淀，即得到所述巨大口蘑原生质体。作为一种最优选方案，本发明中所述渗透压稳定剂最优选为0. 5mol/L的甘露醇溶液。作为一种优选方案，所述混合酶液由如下方法制备得到以渗透压稳定剂溶解纤维素酶和蜗牛酶，于7000 10000r/min离心15 20min后，用0. 222 μ m的微孔滤膜过滤上清液，所得滤液即为混合酶液。作为一种优选方案，步骤(1)中，所述巨大口蘑菌丝为菌龄为7 IOd的巨大口蘑菌丝。作为一种优选方案，步骤(1)中，所述巨大口蘑菌丝由如下方法制备得到将巨大口蘑菌丝块接到液体马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，于四 32°C、160 180r/min的摇床培养6 8d，然后过滤，取0. 4 0. 6g过滤后得到的菌丝转移到160 ISOmL液体马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，于四 32°C静置培养7 10d，过滤去上清液，得到所述巨大口蘑菌丝。作为一种最优选方案，步骤(3)中，所述过滤最优选为采用6层擦镜纸进行过滤。为了使巨大口蘑原生质体的纯度更高，可以在步骤C3)完成后，对得到的巨大口蘑原生质体进行精制，作为一种优选方案，所述精制包括如下步骤将巨大口蘑原生质体加入1 1. 5ml渗透压稳定剂中，于3000 4000r/min离心 15 20min，去上清液，用渗透压稳定剂洗涤下层悬浮液2 3次，再用渗透压稳定剂重悬原生质体，得到巨大口蘑原生质体精制悬液。上述的重悬过程中，所用渗透压稳定剂的用量优选为与步骤( 所述酶解液等体积。一种由所述制备方法得到的巨大口蘑原生质体。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明采用纤维素酶和蜗牛酶作为混合酶系，比单一的溶壁酶价格低一半以上， 大大降低了科研中巨大口蘑原生质体的制备费用，为利用原生质体技术进行巨大口蘑育种和基因工程奠定了基础；同时，本发明的巨大口蘑原生质体的制备方法成本比传统的制备方法降低一半以上，而且得到的原生质体释放量达到9. 2X IO6个/mL，再生率达到1.17%，处于较高的水平。巨大口蘑原生质体的制备方法如下(1)菌丝的预处理 将以上制备的0. 4g巨大口蘑菌丝加入到50mL离心管中，加入0. 5mol/L甘露醇作为渗透压稳定剂，于7000r/min离心15min，去上清液，所得沉淀用渗透压稳定剂洗涤2次， 得到预处理后的菌丝；(2)酶解的过程如下每0. 4g预处理后的菌丝加入ImL上述混合酶液，置于31°C水浴恒温培养4. 5h，隔 30min适当摇动一次，得到酶解液；(3)酶解后的处理如下酶解完毕后，用6层擦镜纸过滤酶解液，除去残留菌丝，滤液于3000r/min离心 20min，弃上清液，收集沉淀，即得到巨大口蘑原生质体。(4)精制将制得的巨大口蘑原生质体沉淀用0. 5mol/L的甘露醇作为渗透压稳定剂，于 3000r/min离心15min并洗涤两次，然后用与步骤(2)酶解液等体积的0. 5mol/L的甘露醇重悬原生质体，得到精制的巨大口蘑原生质体，重悬的目的是为了使巨大口蘑原生质体的纯度更高。然后用血球计数板测定巨大口蘑原生质体释放量，整个过程在无菌条件下进行， 血球计数板为25X16型，具体计算公式为原生质生质体AmL= 80个小方格原生质小方格χ 400 X 10000 X稀释倍数;80测得本实施例方法制得的巨大口蘑原生质体释放量为9. 9X IO6个/mL。巨大口蘑原生质的再生率测试方法如下将原生质体浓度调整到106个/mL，取0. ImL原生质体悬浮液涂布于PDA再生培养基上，计算其再生率，再生培养基为可溶性淀粉4.7g，蔗糖5g，酵母膏0. lg，KH2P04 0. Ig, MgS04 · 7H20 0. 5g 琼脂 1· 5 2g，0. 5moL/L 甘露醇 IOOmL, pH = 7. 0。再生率计算值为 1. 17%。实施例2采用实施例1相同的巨大口蘑菌丝，区别在于，混合酶液的配制方法如下称取纤维素酶和蜗牛酶加入无菌0. 5mol/L的甘露醇溶解，使纤维素酶和蜗牛酶的质量浓度分别为3. 5%和0. 5% (纤维素酶由上海伯奥生物科技有限公司提供；蜗牛酶由北京百泰生物科技有限公司提供)，于8000r/min离心ISmin除杂质后用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤上清液，得到滤液，即为混合酶液。巨大口蘑原生质体的制备方法及释放量测定与实施例1相同，经测定后，本实施例方法制得的巨大口蘑原生质体释放量为9. 6X IO6个/mL。巨大口蘑原生质的再生率测试方法如下将原生质体浓度调整到106个/mL，取0. ImL原生质体悬浮液涂布于PDA再生培养基上，计算其再生率，再生培养基为可溶性淀粉4.7g，蔗糖5g，酵母膏0. lg，KH2P04 0. Ig, MgS04 · 7H20 0. 5g 琼脂 1· 5 2g，0. 5moL/L 甘露醇 IOOmL, pH = 7. 0。再生率计算值为1. 08%。 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。


本发明公开一种巨大口蘑原生质体的制备方法。所述制备方法，包括如下步骤用渗透压稳定剂对巨大口蘑菌丝进行预处理，然后采用蜗牛酶与纤维素酶组成的混合酶液对巨大口蘑菌丝进行酶解，所述混合酶液中，纤维素酶的质量浓度为3.5～4.0％，蜗牛酶的质量浓度为0.5～1.0％，余量为渗透压稳定剂；最后对酶解液进行过滤，离心，所得沉淀即为巨大口蘑原生质体。本发明所用的混合酶液比单一的溶壁酶价格低一半以上，大大降低了科研中巨大口蘑原生质体的制备费用，为利用原生质体技术进行巨大口蘑育种和基因工程奠定了基础；同时，本发明的巨大口蘑原生质体的制备方法成本比传统的制备方法降低一半以上，而且得到的原生质体释放量和再生率均处于较高水平。