专利名称：制备感染松口蘑菌的幼松树的方法 松口蘑菌是属于担子菌亚纲(Basidiomycotina)伞菌目(Agaricales)白蘑科(Tricholomataceae)的真菌，其天然生长于包括赤松(Pinus densiflora)、偃松(Pinus pumila)、欧洲云杉(Piceaabies)和鱼鳞云杉(Picea jezoensis)的针叶林中。特别地，在韩国，已知该真菌只生长于松树林中。在韩国和日本，松口蘑菌是最受欢迎的食用菌之一，特别是在韩国东部沿海地区，其是主要的经济来源。该真菌发出独特的香味，该香味的芳香成分包括1-辛烯-3-醇、2-辛醇、1-辛烯和4-甲基肉桂酸。寄生于活树根部的食用真菌松口蘑，主要寄生在松树(例如，赤松)的细根上，与树共生并形成外生菌根。然而，还没有该外生菌根的真菌形成体外的子实体的报道。韩国的一个研究小组试图通过将松树芽苗移植到松口蘑真菌的蘑菇圈周围的土壤中这种传统方法来产生体外由其感染的松树，但是结果并不令人满意。(TS Kim，GH Ga，H Park，YC Park，GH Yoon和GY Lee，1999，体外培养松口蘑和其产量的提高(In vitro cultivation of T.matsutake and increase of itsproduction yield)，韩国森林研究协会出版(Publications published bythe Korean Forest Research Institute)Vol.15313-16)。茨城地方林业中心(Ibaraki Prefectural Forestry Center)报道了在赤松的芽苗上成功形成松口蘑真菌外生菌根(Akiyoshi Yamada，Ken Maeda和Masatake Ohmasa，1999，体外松口蘑分离菌在赤松芽苗上的外生菌根的形成(Ectomycorrhizal formation of Tricholoma matsutake isolateson seedling of Pinus densiflora in vitro，真菌科学(Mycoscience)40455-463)。由于该真菌是活树的根部寄生菌，所以体外很难形成松口蘑真菌的子实体(蘑菇)。鉴于此，传统上培养松口蘑为简单控制影响松口蘑发育的环境因素，例如，湿度、光强度、温度等。即，通过一系列野外作业包括灌溉、移走落叶和用杯状物覆盖蘑菇，获得适于松口蘑发育的环境。这种培养方法可以显著提高蘑菇产量，但是其应用只限于松口蘑天然存在的地方。更具体地，这种培养蘑菇方法的例子包括如下首先，将培养的松口蘑菌丝体播撒于存在松口蘑的田地中，接着，新形成的菌丝体移植入土壤中；第二，从松口蘑菌的子实体收集孢子并播撒于存在松口蘑的田地中；第三，将含有活的松口蘑菌丝体的土壤播撒于没有生长松口蘑的地方的田地中。通过上述方法移植的松口蘑真菌没有长成真菌菌落是由于其菌丝体生长速率比细菌和其它丝状真菌低，由于雨或土壤状况导致松口蘑真菌丢失而松树根部却没有感染该真菌。另外，松口蘑可以通过将松树芽苗种植于松口蘑蘑菇圈周围的土壤中来培养，所述蘑菇圈天然形成于松树周围。使芽苗生长几年，然后将得到的松树移植到没有生长松口蘑的田地中。然而，这种方法使种植的松树芽苗在感染松口蘑菌之前，感染并生长了天然存在于该田地中的许多其它相似真菌。而且，鉴定生长的真菌需要复杂的实验技术。因此，没有高产量地获得感染松口蘑菌的松树。
基于松口蘑菌丝体渗入松树根部并且该真菌与松树共生的事实，本发明人通过将无菌松树芽苗与松口蘑分离菌体外共同培养，选择性感染松树根部。因此，本发明的一个目的是提供一种制备感染松口蘑菌的幼松树的方法。上述目的通过如下方法实现将松口蘑菌KBFERI 20T05接种于灭菌的培养容器中，所述松口蘑菌分离自液体培养于PDB培养基(马铃薯葡萄糖液体培养基(Potato Dextrose Broth)，Difco)的天然存在的松口蘑的子实体；将珍珠岩和泥炭藓泥炭沼(sphagnum peatmoss)的土壤混合物及K-液体培养基放置于接种的真菌上；将松树子在无菌状态下发芽产生的无菌芽苗种植入混合土壤中；然后将松树芽苗与松口蘑菌一起培养以在松树芽苗的细根上形成外生菌根。

从下列详细描述并结合所附附图将更清楚理解本发明的上述和其它目的、特征、和其它优点。其中图1为显示松口蘑真菌KBFERI 20T05液体培养结果的照片，所述松口蘑真菌KBFERI 20T05分离自天然存在的松口蘑；图2为在无菌下发芽的松树芽苗的照片；图3为插入纸杯的培养容器的照片；图4为显示用于共同培养无菌松树芽苗和松口蘑分离菌的感染培养基的组合物的照片；图5为被松口蘑分离菌菌丝体感染的幼松树的照片；图6为根部形成外生菌根的松树的细根照片，其中在立体显微镜下观察细根；图7为渗入松树芽苗细根的松口蘑菌丝体的照片，其中在光学显微镜下观察菌丝体；图8为渗入松树芽苗细根的松口蘑菌丝体的照片，其中在荧光显微镜下观察菌丝体；和图9为当根部具有菌丝体的松树的一根细根培养于PDA培养基上时，松口蘑菌丝体生长于PDA固体培养基上的照片。

本发明涉及通过将松树芽苗和松口蘑菌的子实体共同培养来制备感染松口蘑菌的幼松树的方法，该方法包括如下步骤制备能够含有感染培养基的培养容器；将松口蘑菌KBFERT 20T05的子实体接种到培养容器中；制备用于松树芽苗生长的混合土壤和K-液体培养基以提供感染培养基；将松树芽苗种植到该感染培养基中。
具体地讲，本发明提供了通过共同培养无菌松树芽苗和松口蘑菌制备感染松口蘑菌的幼松树的方法，该方法包括以下步骤将真菌菌丝体以0.01-0.02mg干重/mL无菌水的量接种于灭菌的培养容器底部，该真菌菌丝体通过将液体培养于PDB培养基的松口蘑菌的子实体粉碎获得；将珍珠岩和泥炭藓泥炭沼以80∶1-2的比率混合并将得到的混合土壤放置于接种的真菌菌丝体上；制备K-液体培养基，调整培养基的pH至5.5-5.6并将K-液体培养基平分至混合土壤上，所述K-液体培养基为每升水中含有1.65g NH4NO3，0.2g KNO3，0.002g CaCl2·2H2O，0.02g KCl，0.2g KH2PO4，0.9g MgSO4·7H2O，0.2g (NH4)2HPO4，0.5g NH4-Tar，0.5mlFe-Cit，0.031g H3BO3，0.01516g MnSO3·4H2O，0.0086g ZnSO4·7H2O，0.00083g KI，0.00025g Na2MoO4·2H2O，100μg盐酸硫胺，1.0g麦芽提取物，0.5g酵母提取物，0.3g酪蛋白和3.0g葡萄糖；在无菌条件下，使松树子发芽至3cm长，将得到的无菌芽苗种植到含有混合土壤和K-液体培养基的感染培养基上，并用盖子覆盖培养容器；将松树芽苗和松口蘑菌在10-40,000勒克斯(lux)光强度下于15-25℃共同培养24小时。
以下将更详细描述本发明的方法。
步骤1含有感染培养基的培养容器的制备和灭菌首先，制备用于共同培养松树芽苗和松口蘑菌的含有感染培养基的培养容器，并在1.2个大气压下，121℃高压灭菌20分钟。培养容器应该由在灭菌过程中不改变和熔化的材料制成，并且在共同培养过程中，也不受微生物感染的攻击。
另一方面，培养容器优选由生物可降解材料制备。然而，当将被松口蘑真菌感染的松树以放置于生物可降解的培养容器中的形式种植于田地中时，这种材料需很长时间才生物降解。因此，优选制备同时考虑到共同培养和移植到田地因素的培养容器。在这点上，在本发明中，当进行共同培养时，使用的培养容器内部具有纸杯，当感染了真菌菌丝体的松树芽苗移植到田地中时，丢弃纸杯。优选，参见图3，可商购获得的纸杯(相当小型的杯子)紧密插入培养容器的内部但不暴露于培养容器的上部分，并且培养容器用透明盖子覆盖。尽管灭菌和培养中，纸杯的外形可发生变化，但是由于纸杯在共同培养至移植到田地中的过程中，保持其内含物不改变，并且，几乎不影响松树芽苗和松口蘑菌丝体的生长，因而纸杯是有用的。更优选在高压灭菌后，可以立即将培养容器在超净台上暴露于紫外光下进一步灭菌。
步骤2将液体培养的松口蘑菌KBFERI 20T05接种于感染培养基中获自天然存在的松口蘑的松口蘑菌KBFERI 20T05均匀分布地接种于步骤1制备的灭菌的培养容器的底部。
优选使用来自松口蘑蘑菇子实体的松口蘑分离菌作为接种体，其中已鉴定所述松口蘑分离菌与常规已知的松口蘑菌具有DNA序列同源性，而不使用常规已知或通过外观或感官评价方式鉴定的松口蘑菌。因此，本发明应用的松口蘑菌KBFERI 20T05与常规已知松口蘑菌的Gene Bank登记的ITS区、5.8S整个区域和18S的一部分的DNA序列具有超过99％的同源性。该真菌KBFERI 20T05的DNA序列已在Gene Bank登记。松口蘑分离菌KBFERI 20T05培养于PDB培养基(Difco)中。得到的菌丝体团以K-液体培养基(pH 5.6)洗涤，以灭菌网孔过滤，并于K-液体培养基中利用Waring氏可高压灭菌的搅拌器31L91粉碎为精细颗粒，所述培养基按照如下表1列出的组成制备。然后，将粉碎的菌丝体转移至超净台，并且，在打开培养容器后，利用10ml玻璃吸液管均匀接种于灭菌的培养容器底部。接种的菌丝体生长成为多层菌落，这种生长形式增加了松树芽苗的细根与松口蘑真菌的接触。在这里，优选利用搅拌器将菌丝体团粉碎得非常精细。此外，由于在粉碎过程中产生的热对松口蘑菌丝体的生长产生不利的影响，优选粉碎过程使用，例如，放置于冰箱中预冷的5℃以下的K-液体培养基进行。真菌菌丝体与5ml K-液体培养基以0.05-0.10mg干重的量接种。接种体的干重通过以下方法进行计算将5ml含有粉碎的真菌菌丝体的K-液体培养基放置于小的容器中，使之干燥，将得到物称重并减去滤纸重量，然后重复上述方法20次，并将得到的重量值平均。接种量极大地影响松树芽苗细根与松口蘑菌丝体的接触。增加真菌菌丝体的接种量，将提高它们与松树芽苗根部的接触。然而，由于松口蘑真菌在较高浓度接种时，其菌丝体生长率较低，因此认为上述的接种量是合适的。
另一方面，为了提高松口蘑菌丝体与松树芽苗细根的接触，可以在培养容器的底部加入pH5.5-5.6的K-固体培养基。
所述K-固体培养基的组成列于如下表1。通常，植物体外培养的最佳pH值约为5.7-5.8，松口蘑真菌的最佳pH约为5.4。为了提供适于这两种共同培养生物的环境，调整K-固体培养基的pH至5.5-5.6。另外，通常在液体培养基中松口蘑的真菌增殖速度慢，因此，为了提高松口蘑真菌的生长率，放置于培养容器底部的K-固体培养基含有高的碳源。为了在短时间内增加松口蘑菌生物团，并且完全消耗K-固体培养基中的高的碳源，将最少量的K-固体培养基等分至培养容器的底部，优选，厚度小于2cm，更优选，0.5mm。当使用高浓度的K-固体培养基时，松口蘑菌仅仅利用存在的高浓度的碳源继续生长而不渗入松树芽苗的细根中，结果在松树根部不形成外生菌根。
表1

步骤3利用混合土壤和K-液体培养基制备感染培养基为了培养松树芽苗，将珍珠岩和泥炭藓泥炭沼的混合物及K-液体培养基倾倒于步骤2中的接种的松口蘑菌丝体上，其中K-液体培养基用于防止松树芽苗由于干燥而凋零。
感染培养基中使用的床土是珍珠岩和泥炭藓泥炭沼以80∶1-2比率的混合物。珍珠岩广泛地用作床土。并且，由于珍珠岩几乎不含有其它有机或无机化合物，其适于K-固体培养基或K-液体培养基的加入。泥炭藓泥炭沼用于湿度控制。由于泥炭藓泥炭沼的强酸性，其使用浓度非常低。当使用含有纸杯的培养容器时，在纸杯被放置于容器中灭菌后，混合土壤倾倒入按照上述步骤制备的接种了松口蘑菌丝体的培养容器中，并使其达到与纸杯同样的高度，以防止将要倾倒于混合土壤的K-液体培养基进入培养容器与纸杯之间的空间，其中在超净台上加入土壤。
另一方面，具有如上表1所示组成的K-液体培养基在1.2个大气压，于121℃高压灭菌20分钟，并冷却。然后，在超净台上将100ml K-液体培养基倾倒于混合土壤上。这些加入的少量的K-液体培养基可以防止在培养过程中干燥，因此，防止松树芽苗的凋零。
步骤4无菌松树芽苗的准备并将其种植到感染培养基在无菌条件下，使松树子发芽，将得到的松树芽苗种植到步骤3中制备的含有混合土壤和K-液体培养基的感染培养基中，并使根面向下，子叶面向上。然后，用盖子覆盖培养容器。
另一方面，为了获得松树芽苗，将松树子在70％乙醇中浸泡10-60秒消毒，然后用0.5-3％(最佳2％)的次氯酸钠处理1-7分钟，再用无菌水洗涤3-4次。当用次氯酸钠处理更长时间时，松树子的发芽率降低。因此，用次氯酸钠处理芽苗约5分钟是合适的。当在无菌条件下剥离种皮后，将消毒的种子种植于固体培养基中并在15-28℃培养，(最佳温度23-26℃，通常种子发芽温度24℃)，所述固体培养基利用营养液体培养基(Nutrient Broth，Scharlau)和琼脂(8g/L)制备并在灭菌的一次性培养皿中变硬。选择3cm长没有被微生物污染的发芽种子。超过3cm长的芽苗容易倒下或凋零。将选择的松树芽苗种植于步骤3中准备的培养容器中，该容器中含有接种了松口蘑菌丝体的感染培养基。这里，将芽苗种植入混合土壤约2cm深，小于1cm高，并且使根面向下，子叶面向上。
步骤5制备感染松口蘑菌的幼松树的培养步骤为了制备细根被松口蘑菌感染的幼松树，将步骤4中种植于培养容器中的松树芽苗在10-40,000lux光强度下于15-25℃共同培养24小时。
通常在15-25℃下进行松口蘑菌进入松树芽苗细根的感染。已知根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacience)作为将外源基因整合入植物染色体的载体，感染植物的最佳温度为20℃。在这点上，本发明的感染松口蘑菌过程在20℃进行。最重要的因素，光强度，在10-40,000lux范围内。自然光约为20,000lux，但是由于包括培养容器的透射率低和照明设备过热等重大问题，难以人工维持这样的自然光强度。因此，本发明应用三个波长的荧光灯。感染过程在装有4个或多个荧光灯的培养箱中进行，并使培养容器维持在超过8,000lux光强度下，以维持供应对于植物生长必需的碳源。由于松口蘑菌试图获得碳源，这些培养条件自发诱导松口蘑菌的感染机制。
步骤6对于在松树芽苗细根上的菌根形成的评价在共培养松树芽苗和松口蘑菌丝体后，评价在松树芽苗的细根上形成的菌根的香味，并且在立体显微镜、荧光显微镜和电子显微镜下观察渗入松树芽苗的细根的真菌菌丝体状态。
发现，在培养后70天内，松树芽苗感染了松口蘑菌丝体。还发现在松树芽苗细根上形成的菌根发出与松口蘑蘑菇相同的香味。并且，在立体显微镜、荧光显微镜和电子显微镜下，发现菌丝体渗入细根中。在无菌下切除形成的菌根的一部分，种植于MMN(改进的Melin-Norkron)培养基上，然后培养。发现在培养基上形成的菌丝体具有与松口蘑蘑菇相同的形态和香味。
将参考下列实施例并结合附图更详细地解释本发明。然而，提供下列实施例只是为了阐述本发明，并不用于限定本发明。
实施例1使用用于金针菇的培养容器制备感染松口蘑菌的幼松树为了获得如图4所示的感染松口蘑菌的幼松树，将灭菌的K-固体培养基倾倒于灭菌的培养容器中并使之变硬，该K-固体培养基通常用于培养金针菇(Flammulina velutipes)蘑菇。用滤纸覆盖K-固体培养基后，将菌丝体与5ml无菌水以0.075mg干重接种于滤纸上，该菌丝体来自液体培养的松口蘑菌KBFERI 20T05的子实体，将80∶1.5比率的珍珠岩和泥炭藓泥炭沼的混合物加到接种的真菌菌丝体上并将pH 5.6的K-液体培养基加入土壤中，以此形成感染培养基。然后，将从无菌下发芽松树子获得的芽苗种植到含有混合土壤和K-液体培养基的感染培养基上，并用盖子覆盖培养容器，然后在25,000lux光强度下，于20℃将松树芽苗和松口蘑真菌共同培养24小时。评价在松树芽苗的细根上形成的外生菌根的香味，并且在立体显微镜、荧光显微镜和电子显微镜下研究它们渗入根部的状态。
这里，加入的K-固体培养基的深度小于5.0mm。使用的滤纸为Adantec公司生产的N05B。加入的混合土壤的深度小于5mm。
另外，用达到感染培养基高度的铝箔将含有感染培养基的培养容器的外部包围，以防止光透过而保护松口蘑菌丝体和松树芽苗的根部。
结果，发现松树芽苗细根上形成的外生菌根具有与松口蘑蘑菇相同的香味，并且在立体显微镜下形成菌丝体膜。在光学显微镜、荧光显微镜和电子显微镜下，在细根上观察到菌丝体的细胞间渗透。另外，在共同培养后70天内，发现真菌菌丝体感染了松树芽苗。当在无菌下切除外生菌根的细根的一部分并种植于MMN(改进的Melin-Norkron)培养基上时，真菌菌丝体显示松口蘑真菌的特征性菌丝体生长(附图未显示)，并且新形成的蘑菇发出与天然存在的松口蘑蘑菇相同的香味。
制备例1来自液体培养的松口蘑接种体的制备本发明中用作接种体的松口蘑真菌分离自天然存在的恰好在其菌盖打开前的松口蘑蘑菇，该松口蘑蘑菇是从位于韩国的庆尚北道(Gyeongsangbuk-do)庆州市(Gyeongju-si)Namsan-dong的10公顷(ha)的Doyoo森林采集的。在采集后8小时内，将采集的蘑菇中的菌盖和菌褶之间的部分切成0.5mm大小的块，并且种植到按照如下表2所示的组成的pH 5.5的MMN培养基上。然后，在松口蘑生长的最佳生长温度，23±0.5℃，在PDA培养基上进一步培养分离的菌丝体60天。松口蘑真菌成功地分离自约98％的培养的菌丝体。发现分离的菌丝体与已知的松口蘑真菌的ITS序列，整个5.8S rRNA和部分18S的DNA序列具有超过99％同源性。鉴定的rDNA序列于2001年4月3日在Gene Bank登记，指定登记号AF367417。在本发明中，分离的松口蘑真菌命名为“KBFERI20T05”。这里，作为松口蘑接种体，可以应用来自天然存在的松口蘑蘑菇的菌丝体，其与松口蘑的已知ITS序列和整个5.8S和18S的DNA序列具有超过99％同源性。
为了获得制备本发明感染松口蘑菌的幼松树的接种体的菌丝体团，将分离自天然存在的松口蘑蘑菇子实体的松口蘑菌KBFERI 20T05培养于PDA培养基中(按照表2列出的组成除去琼脂后制备)。得到的真菌菌丝体团用pH5.0的无菌水洗涤，然后利用Waring氏可高压灭菌的搅拌器31L91于无菌水中粉碎为精细颗粒。利用10ml玻璃吸液管将粉碎的真菌菌丝体均匀接种于培养容器中放置于K-固体培养基上的滤纸上。
表2

制备例2利用混合土壤和K-液体培养基制备感染培养基应用珍珠岩和泥炭藓泥炭沼作为培养松树芽苗的床土。以80∶1.5比率混合后，将它们在容器中灭菌。在超净台上，灭菌的混合土壤倾倒至接种了松口蘑菌丝体的培养容器中至合适的高度。
按照如上表1所示的组成制备K-液体培养基。在高温下高压灭菌后，在超净台上将100ml K-液体培养基倾倒至混合土壤上。
制备例3在无菌条件下使松树子发芽并种植它们以制备松树芽苗将松树子在70％乙醇中浸泡60秒消毒，然后用2％次氯酸钠处理4分钟，再用无菌水洗涤3次。在无菌条件下剥离种皮后，将消毒种子种植于固体培养基上并在24℃培养，所述固体培养基利用营养液体培养基(Scharlau)和琼脂(8g/L)制备并在灭菌的一次性培养皿中变硬。选择3cm长没有被微生物污染的发芽种子并种植于制备例2中制备的培养容器中的感染培养基中。
如图2所示，选择的没有被微生物污染的松树芽苗种植于感染培养基中。
实施例2利用含有纸杯的培养容器制备感染松口蘑菌的幼松树如图3所示，为了制备感染松口蘑菌的幼松树，将灭菌的K-固体培养基倾倒入灭菌的含有纸杯的培养容器中。来自松口蘑菌KBFERI 20T05子实体的菌丝体按照如制备例1相同的方法制备。所述菌丝体与5ml无菌水以0.075mg干重接种至纸杯的底部。将按照制备例2相同方法制备的混合土壤和100ml K-液体培养基倾倒至接种的真菌菌丝体上，由此制备感染培养基。然后，将按照制备例3相同方法制备的松树芽苗种植到感染培养基上，并且用盖子覆盖培养容器，然后，在25,000lux光强度下于培养箱中20℃培养24小时。该培养箱装有4个或多个三个波长的荧光灯。评价在松树芽苗的细根上形成的外生菌根的香味，并且在立体显微镜、荧光显微镜和电子显微镜下研究它们渗入根部的状态。
作为松树芽苗和松口蘑真菌共同培养的结果，发现在松树芽苗的细根上形成的外生菌根与松口蘑蘑菇具有相同的香味，并且在立体显微镜下形成菌丝体膜。在光学显微镜、荧光显微镜和电子显微镜下，在细根上观察到菌丝体的细胞间渗透。另外，在共同培养后70天内，松树芽苗感染了松口蘑菌丝体。当在无菌下切除外生菌根的细根的一部分并种植于MMN(改进的Melin-Norkron)培养基中时，真菌菌丝体显示松口蘑真菌的特征性菌丝体生长(附图未显示)，并且新形成的蘑菇发出与天然存在的松口蘑蘑菇相同的香味。
另一方面，当真菌菌丝体均匀接种于培养容器的纸杯的底部时，接种的菌丝体生长成为多层菌落，这种生长形式增加了松树芽苗的细根与松口蘑真菌的接触。
制备例4培养容器的制备如图3所示，为了制备感染松口蘑菌的幼松树，可商购获得的纸杯(相当小型的杯子)紧密插入培养容器的内部但不暴露于容器的上部分，然后用透明盖子覆盖培养容器。然后，培养容器在1.2个大气压，121℃下高压灭菌20分钟，并冷却。然后，将培养容器在超净台上暴露于紫外光下进一步灭菌。
实施例3在含有K-固体培养基的培养容器中，利用生长松口蘑蘑菇的田地土壤制备感染松口蘑菌的幼松树为了在插入纸杯并含有K-固体培养基的培养容器(按照与实施例1相同的方法制备)中制备感染松口蘑菌的幼松树，将来自松口蘑菌KBFERI20T05子实体的菌丝体(按照与制备例1相同的方法制备)与5ml无菌水以0.075mg干重的量接种于放置在纸杯底部的K-固体培养基上。将收集于生长松口蘑蘑菇的田地土壤(按照如下制备例6相同方法制备)和50ml K-液体培养基倾倒于接种了的真菌菌丝体上，由此制备感染培养基。然后，将按照制备例3相同方法制备的松树芽苗种植于感染培养基上，并用盖子覆盖培养容器。然后在25,000lux光强度下于培养箱中20℃培养24小时。该培养箱装有4个或多个三个波长的荧光灯。评价在松树芽苗的细根上形成的外生菌根的香味，并且在立体显微镜、荧光显微镜和电子显微镜下研究它们渗入根部的状态。
作为松树芽苗和松口蘑真菌共同培养的结果，发现在松树芽苗的细根上形成的外生菌根与松口蘑蘑菇具有相同的香味，并且在立体显微镜下形成菌丝体膜。在光学显微镜、荧光显微镜和电子显微镜下，在细根上观察到菌丝体的细胞间渗透。另外，在共同培养后70天内，发现松树芽苗感染了松口蘑菌丝体。当在无菌下切除外生菌根的细根的一部分并种植于MMN(改进的Melin-Norkron)培养基中时，真菌菌丝体显示松口蘑真菌的特征性菌丝体生长(附图未显示)，并且新形成的蘑菇发出与天然存在的松口蘑蘑菇相同的香味。
制备例5制备含有K-固体培养基的培养容器如下方法制备用于共同培养松树芽苗和松口蘑真菌的培养容器。如图3所示，可商购获得的纸杯(相当小型的杯子)紧密插入培养容器的内部但不暴露于培养容器的上部分，并且用透明盖子覆盖培养容器。然后，培养容器在1.2个大气压，121℃下高压灭菌20分钟，并冷却。然后，将培养容器在超净台上暴露于紫外光下进一步灭菌。在超净台上，将按照表1列出的组成制备的K-固体培养基(pH5.6)倾倒入培养容器的纸杯中至厚度2cm，优选约0.5mm，并使之变硬。
制备例6利用生长松口蘑蘑菇的田地土壤和K-液体培养基制备感染培养基用于培养松树芽苗的床土利用生长松口蘑蘑菇的田地土壤制备。土壤分别收集于三层土壤层表面土壤层，精细颗粒土壤层和粗糙颗粒土壤层，并将所述土壤加入制备例5中的纸杯中的K-固体培养基中，并保持其自然结构，即，将K-液体培养基、粗糙颗粒土壤、精细颗粒土壤和表面土壤依次加入纸杯中。然后，将按照表1列出的组成制备的K-液体培养基(pH5.6)在1.2个大气压，121℃下高压灭菌20分钟，并冷却。然后，在超净台上，将50ml冷却的K-液体培养基倾倒入土壤上。
实施例4利用含有K-固体培养基的培养容器中的混合土壤制备感染松口蘑菌的幼松树为了在插入纸杯并含有K-固体培养基的培养容器(按照与实施例1相同的方法制备)中制备感染松口蘑菌的幼松树，将来自松口蘑菌KBFERI20T05子实体的菌丝体(按照与制备例1相同的方法制备)与5ml无菌水以0.075mg干重的量接种于放置于纸杯底部的K-固体培养基上。将按照制备例2相同方法制备的混合土壤和100ml K-液体培养基倾倒于接种的真菌菌丝体上，由此制备感染培养基。然后，将按照制备例3相同方法制备的松树芽苗种植于感染培养基上，并用盖子覆盖培养容器。然后在25,000lux光强度下于培养箱中20℃培养24小时。该培养箱装有4个或多个三个波长的荧光灯。评价在松树芽苗的细根上形成的外生菌根的香味，并且在立体显微镜、荧光显微镜和电子显微镜下，研究它们渗入根部的状态。
如图5所示，发现松树芽苗感染了松口蘑真菌。在松树芽苗细根上形成的外生菌根具有与松口蘑蘑菇相同的香味。并且，如图6所示，在立体显微镜下形成菌丝体膜。如图7和图8所示，在光学显微镜、荧光显微镜和电子显微镜下，在线状细根上观察到菌丝体的细胞间渗透。另外，在共同培养后70天内，发现真菌菌丝体感染了松树芽苗。
如图9所示，当在无菌条件下切除外生菌根的细根的一部分并种植于MMN(改进的Melin-Norkron)培养基时，发现真菌菌丝体显示松口蘑真菌的特征性菌丝体生长。
如实施例所描述，根据本发明制备感染松口蘑菌的幼松树的方法是有效的，其通过体外共同培养无菌松树芽苗和真菌菌丝体，只用松口蘑真菌选择性感染松树根部。本发明的方法通过应用松口蘑分离菌，该松口蘑分离菌与常规已知松口蘑的ITS区，5.8S的整个区域和18S一部分具有DNA序列同源性，有利于为松口蘑接种体和感染了真菌的松树芽苗提供客观现实条件。另外，由于一旦移植入田地容易移去纸杯，本发明的方法为种植工作提供了方便，并且对松口蘑菌生根相对有效。进一步地，该方法使整年大规模生产感染松口蘑菌的松树成为可能，其对于体外培养松口蘑蘑菇特别有用。


本发明公开了一种通过共同培养无菌松树芽苗和松口蘑分离菌，制备感染松口蘑菌的幼松树的方法，该方法包括以下步骤于PDB(马铃薯葡萄糖液体培养基，Difco)中液体培养天然存在的松口蘑蘑菇子实体并将分离自培养的子实体的松口蘑菌KBFERI 20T05接种；将珍珠岩和泥炭藓泥炭沼的混合土壤及K－液体培养基放置于接种的真菌上；将松树子在无菌下发芽产生的无菌芽苗种植到混合土壤中，然后与松口蘑分离菌一起培养松树芽苗以使在松树芽苗的细根上形成外生菌根。本发明的方法通过应用与已知常规松口蘑菌具有DNA同源性的真菌作为接种体，有利于为真菌接种体提供客观现实条件，并使整年大规模生产感染松口蘑菌的松树成为可能。