专利名称：具有改进灵敏度的均相化学发光测试方法具有改进灵敏度的均相化学发光测试方法特异性结合测试是用于检测物质存在和数量的试验方法，并且是基于特异性识别并与特异性结合伴侣结合在一起。免疫测试是指一种特异性结合测试的例子，其中抗体和特定蛋白或者化合物相结合。在这个例子中抗体是特异性结合配对成员中的成员。核酸结合测试是另一种类型，其中互补的核酸链是特异性配对。特异性结合测试建立了一个广泛和发展的技术空间，能够进行疾病状态、感染器官以及药物滥用的精确检测。在过去的几十年里，人们投入大量的工作来设计具有必需的灵敏度、动态范围、稳定性、广泛适用性和适用于自动化的测试和测试方法学。发光化合物，比如荧光化合物和化学发光化合物，由于它们可以发光的能力从而被广泛地应用在测试领域。由于这个原因，已经在测试中诸如上述提到的核酸测试和免疫检测测试中利用发光体作为标记。例如，特异性结合配对成员与发光体共轭，并且可以采用·不同的方案，人们可以将观察到的发光水平和样品中分析物的浓度或仅仅是分析物的存在相关联。这些特异性结合测试方法可以被宽泛地分为两类。均相法利用分析物特异性结合反应来调节或者创建一个可检测信号，而无需分析物特异性的和分析物非特异性的反应物之间的分离步骤。非均相模式，依赖于与分析物结合的可检测地被标记的特异性结合伴侣与游离的(不与分析物结合的)可检测的标记的特异性结合伴侣的物理分离。分离通常需要将关键的反应物固定到某种类型的固体基质上，以便进行某种类型的物理过程，例如过滤、沉淀、结块或者磁性分离，并且通常也需要洗涤步骤来去除游离的可检测地被标记的特异性结合伴侣。颗粒，如乳胶颗粒和脂质体，在测试中也会被用到。举例说明，在均相测试中酶可以被捕获在用抗体或抗原标记的脂质体的水相中。在样品和补体存在下，引起脂质体释放该酶。抗体或抗原标记的脂质体，在水相中具有被包裹的水溶性的荧光或非荧光染料，或者溶解在脂质囊泡的脂双层中的脂溶性染料，可以利用该脂质体用于分析物的测试，该分析物能够进入与表面结合的抗体或抗原之间的免疫化学反应中。洗涤剂被用于将染料从脂质体水相中释放出来。并入本文以供参考的美国专利6，911，305公开了一种检测聚核苷酸分析物的方法，该聚核苷酸分析物与第一膜上的用敏化剂或者敏化剂标记的探针结合。该膜与带有固定的化学发光前体的第二膜接触。在夹心的膜中激发敏化剂，产生单线态氧，单线态氧与化学发光前体反应在第二膜上产生可触发的化学发光化合物。可触发的化学发光化合物和试剂反应，在第二膜上产生化学发光，用于检测分析物。这些方法并不依赖于使反应物相接触的特异性结合反应，而是将第二膜作为试剂输送装置。并入本文以供参考的美国专利6，406，913公开了测试方法，该方法包括在一定条件下处理疑似含有分析物的介质，以致于分析物能引起光敏剂和化学发光化合物接近。当用光源照射光敏剂时，光敏剂产生单线态氧，单线态氧通过溶液扩散至化学发光化合物，并且当单线态氧紧密接近化学发光化合物时可以活化化学发光化合物。活化的化学发光化合物随后产生光。产生光的量与介质中分析物的量相关。在一个实施方式中，至少一种光敏剂或化学发光化合物与悬浮颗粒结合，另一种特异性结合配对成员也与其结合。这些均相测试模式利用单线态氧扩散用于选择与分析物的化学发光化合物的活化关系，与现有技术的测试技术相比，该均相测试模式在自动化上提供了操作的便利性和灵活性。尽管这些优势，在测试设计和性能上的其他改进仍然是测试研发人员的目标。特别是提高特异性信号的产生，降低背景(比如非特异性信号)是人们想要的。本发明公开的测试方法通过提供简单的方法来提供或增加灵敏度，解决了这些需求。
本申请公开了用于测定疑似含有分析物的样品中的分析物的方法、试剂、试剂盒和体系，其中所有试剂都是溶解在水溶液中。一种测试方法包括在一定的条件下处理疑似含有分析物的样品，如果存在分析物，敏化剂被带入具有化学发光化合物的活性构造中以便活化该化学发光化合物。包括样品在内的反应混合物也用一种试剂处理，以便降低与分析物不相关的信号。最后，使该样品经受一定条件(或者能量、或者活性化合物)以便引起敏化剂产生单线态氧，用于与化学发光化合物反应从而由化学发光化合物产生光，以便发出·样品中存在分析物的信号。分、病毒及真菌。化学发光化合物一即一种被称作为标记物的化合物，可进行化学反应以便引起发光，比如通过被转化为在电子激发态下形成的另一种化合物。激发态可以是单线态或是三重激发态。激发态可弛豫到基态直接发光，或者是通过将激发能量传递到发射能量受体，从而自身恢复到基态。在此过程中，能量受体将被跃迁为激发态而发光。化学发光标记的固定的特异性结合伴侣(sbp)——测试混合物中的反应物，至少包括下述的连接构造a)用于分析物的特异性结合伴侣(sbp)，b)化学发光化合物或标记物，c)固相。剂量应答——信号，诸如来自于测试反应的化学发光输出，与样品中待测的分析物的含量相关。自由基捕集器(FRT)——指易与自由基发生反应的化合物，通常形成一种稳定的产物化合物。典型的自由基捕集器有时也被称作自旋捕集剂(spin trap)，是脂肪族或芳香族硝酮类化合物，诸如苯基叔丁基硝酮(PBN)。杂烷基——指其中环或非末端链的碳原子中的至少I个被选自N、0或S的杂原子置换的烧基。杂芳基——指其中环的碳原子中的1-3个被选自N、O或S的杂原子置换的芳基。 代表性的基团包括吡啶，吡咯，噻吩，呋喃，喹啉和吖啶基团。亚稳态物质一通常指第一位置产生的激发态并且跃迁至第二位置，在第二位置进行能量转移或是与处于第二位置的分子发生反应。亚稳态物质也可以是反应中间产物，诸如自由基、自由基离子、氮宾、碳烯、高张力分子(highly strained molecule)诸如反式环己烯和a-内酯、环丙烷甲烷等等，此处亚稳态物质的寿命低于10毫秒，通常低于I微秒。亚稳态物质还包括如单线态诸如单线态氧、三重态、还有寿命小于10毫秒且通常小于I微秒的二氧环丁烷(dioxetane)，其中包括二氧环丁酮和二氧环丁烷二酮。通常可通过将合适的敏化剂如芘和能量受体如蒽组合而形成三重态。例如，二溴蒽可以作为呈三重态的能量受体。三重态可以进一步将能量传递给另一个分子，并引发可被检测到的化学发光反应诸如产生光。活化分子与单线态氧或过氧化氢发生反应可以形成二氧环丁烷，二氧环丁烷包括二氧环丁酮和二氧环丁烷二酮。比如，适量的草酸盐和过氧化氢反应可以生成二氧环丁烷二酮。酶诸如辣根过氧化物酶可以产生也是亚稳态的并且可与另一个分子反应并发出可检测信号的阳离子自由基或单线态氧。光敏剂——通常用光激发可形成单线态氧的一种敏化剂。光敏剂可以是光活化的(如染料和芳香化合物)或者化学活化的(如酶、金属盐等)。光激发时，光敏剂通常是含有共价键原子的化合物，通常具有多个共轭的二价键或三价键。化合物可吸收波长范围是200-1 lOOnm、通常是300_1000nm、优选是450_950nm的光，在激发波长处在其吸收峰处的消光系数大于500M^ cnT1,最好至少是5000Μ4 cnT1,优选至少是50000Μ4 cnT1。缺乏氧的情形下，光吸收后产生的激发态的寿命通常至少是100纳秒，优选至少是I微秒。一般情况下，寿命必须足够长，以便能量能够传递给氧原子，存在的氧的浓度范围通常是10_5至10_3M，这取决于介质。和基态相比，光敏剂激发态通常拥有不同的自旋量子数(S )，通常情况下激发态是三重态(S=l)，如通常的那样，基态则是单线态(S=0)。优选地，光敏剂具有较高的系间窜越(intersystem crossing)产量。即光敏剂的光激发能够产生较长寿命状态(通常是三重态)，效率至少是10%，理想地至少是40%，更优选是高于80%。测试条件下，光敏剂将处于最弱的荧光状态(量子产率通常低于0. 5，优选低于0. I)。待被光激发的光敏剂是相对光稳定的,不会有效地与单线态氧发生反应。在大多数可用的光敏剂中存在一些结构特征。在保持刚性的通常是芳香族结构中，大多数光敏剂至少有一个，通常有三个或更多的共轭双键或三键。它们通常至少含有一个能加速系间窜越的基团，如羰基、亚胺基或是选自元素周期表第3-6行中的重原子尤其是碘或溴，或者它们可能具有扩展型芳香结构。典型的光敏剂包括丙酮、苯甲酮、9-噻吨酮、曙红、9，10-二溴蒽、亚甲基蓝、金属卟啉诸如血卟啉、酞菁、叶绿素、孟加拉玫瑰红、富勒烯等，以及这些化合物的具有1-50个原子的取代基的衍生物，所 述取代基用于使得这些化合物更具亲脂性或更具亲水性、和/或作为连接至特异性结合配对成员的连接基团。本领域技术人员已知的其他光敏剂的例子也可以在本发明中使用，比如在美国专利No. 6406913中也有描述，将其并入本文以供参考。在此处描述的方法中，光敏剂优选是相对非极性的，以确保当光敏感剂合并入固相载体包括如小珠、颗粒等等时，其可溶解到亲脂性成员中。颗粒-颗粒大小至少约20nm,不大于20 μ m,通常至少约40 nm且小于ΙΟμπι,优选约O. 10-2.0μπι直径、通常体积小于I皮升(pL)。颗粒可以是有机的或是无机的、可膨胀或不可膨胀的、多孔的或非多孔的，具有任何密度，但优选具有和水接近的密度，一般是约O.7g/mri. 5g/ml之间，优选能漂浮于水中，且由透明、部分透明或不透明的材料构成。颗粒可以有或没有电荷，当带有电荷时，优选是负电荷。颗粒可以是固体(如聚合物、金属、玻璃、有机和无机物诸如矿物、盐和硅藻)、小油滴(如碳氢化合物、碳氟化合物、硅质流体)、囊泡(如合成的诸如磷脂、或天然的诸如细胞、及细胞器官)。颗粒可以是乳胶颗粒或是含有有机或无机聚合物的其他颗粒、脂双层如脂质体、磷脂囊泡、小油滴、硅颗粒、金属溶胶、细胞和微晶染料。有机颗粒通常是聚合物，或者是加成聚合物或者是缩合聚合物，易于分散在测试介质中。有机颗粒也具有吸附性或功能性，以便在它们的表面可间接或直接地结合特异性结合配对成员、以及在它们的表面结合光敏剂或化学发光化合物、或者将光敏剂或化学发光化合物合并入它们的体积内。颗粒可以来源于天然存在的材料、经合成法修饰的天然 存在的材料或者合成的材料。天然或合成的组装体诸如脂双层，如脂质体和非磷脂性囊泡是优选的。在有机聚合物中，特别感兴趣的是多糖，尤其是交联多糖，诸如琼脂糖有SEPHAROSE (法玛西亚生物公司)、葡聚糖有SEPHADEX (法玛西亚生物公司)、纤维素、淀粉等等；加成聚合物，诸如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的衍生物的均聚物、共聚物，尤其是具有游离羟基官能团的酯类和氨基化合物包括水凝胶等等。无机聚合物包括硅酮、玻璃有Bioglas等。溶胶包括金、硒和其他金属。颗粒也可以是分散于水中的不溶性染料，诸如卟啉、]酞菁染料等，它们也可做光敏剂。颗粒也可以包括硅藻、细胞、病毒颗粒、磁小体、细胞核等。当颗粒是购买的商品时，可通过机械方式诸如研磨、超声、搅动等将大颗粒破碎成小颗粒，颗粒的大小可以是变化的。颗粒通常具有多功能性，或者能够通过特异或非特异的共价或非共价相互作用而结合到特异性结合伴侣(sbp)成员、光敏剂或化学发光化合物上。有许多官能团是可用的、或者将其合并进来。典型的官能团包括羧酸、乙醛、氨基、氰基、乙烯基、羟基、巯基等。当利用特异性结合伴侣成员、化学发光化合物或光敏剂与颗粒之间的共价连接时，连接方式是已知的，并且在文献中给予了详细阐述。该方法在美国专利No. 6406913和其引用的参考文献中有详细描述。可以选择光敏剂和/或化学发光化合物溶解在、或非共价地结合到颗粒的表面。在这种情况下，这些化合物优选是疏水性的，以降低它们从颗粒解离下来的能力，从而使两种化合物都能和相同的颗粒结合。通过如下方法可以进一步降低解离下来的可能性通过利用仅是一种组分的颗粒，该组分与光敏剂或者化学发光化合物结合；或者通过利用组分不同的两种不同类型的颗粒，以促使光敏剂与一种颗粒结合，化学发光化合物同另一种颗粒结合。与每个颗粒结合的光敏剂或者化学发光分子的数目平均上通常是至少一个，并且可以是足够高，以致于颗粒全部由光敏剂或化学发光剂分子组成。基于经验，所述分子上优选的数目应选择为在测试中可提供最高的信号与背景比(即信噪比)。在一些情况下，可通过结合多种不同的光敏剂分子至颗粒中来获得最好的结果。通常，颗粒中光敏剂或化学发光化合物与特异性结合伴侣(sbp)成员比率至少应当是1，优选至少是100比1，最优选是超过1000比I。样品——测试中待检测的含有或疑似含有分析物的一种混合物。分析物包括蛋白质、肽、核酸、激素、抗体、药物和类固醇。可以被用在本发明公开的方法中的典型的样品包括体液诸如血液(可以是在收集的血液样品中通常看到的抗凝血)、血浆、血清、尿、精液、唾液、细胞培养物、组织提取物等。其他类型的样品包括溶剂、海水、工业水样、食品样品、环境·样品诸如土或水、植物材料、真核细胞、细菌、质粒、病毒、真菌、及来自于原核的细胞。敏化剂——一种化合物，当被激发或被诱导反应时可导致另一种化合物或物质发生化学反应。敏化剂包括光敏剂，其能够被光照射所诱导，从而形成活化的激发态。敏化剂也包括能发生化学反应，从而产生亚稳态物质诸如单线态氧的化合物。特异性结合配对成员——也是已知的特异性结合伴侣(sbp)，特异性结合伴侣是一种分子，包括生物分子，对于另一种物质(如分析物)具有特异性结合亲合性。用于分析物的两种特异性结合伴侣，优选在该分析物上具有不同的结合位点，可被称作特异性结合配对。NMA (噪音调节剂)一本发明公开的测试反应混合物中提供的一种化合物，与来自于测试反应混合物的化学发光形成反应所产生的分析物特异性信号相比，其可极大地降低非特异性信号或背景信号。在此处描述的方法中，NMA是一种化合物或混合物(诸如单线态氧淬灭剂(S0Q))，能够干扰亚稳态物质与信号产生化合物之间的反应。固体载体——一种大小至少是I微米的材料，具有测试成分可以固定在其上的表面。该材料以颗粒、微粒、纳米颗粒、金属胶体、纤维、薄片、珠子、膜、滤膜或其他载体诸如试管、微孔、芯片、载玻片及微阵列芯片的形式存在。可溶解的、溶解性、溶解一指一种物质和另外一种物质混合均匀的能力和倾向。在本发明的公开中，溶解性及其相关术语通常指的是固体溶解到液体中的特性，如NMA溶解在水缓冲液中。固体溶解至它们失去晶体形式的程度，变成分子或离子溶解或分散在溶剂(如液体)中，从而形成了真正的溶液。与此相反，双相系统中，一个相由小颗粒(包括微颗粒或胶体大小的颗粒)组成，其分散在整个主体物质中，不管是否能够被稳定化来抑制沉淀或者是未被稳定化。取代——指基团上至少有一个氢原子被非氢基团所置换。应当注意的是，关于取代基，除非有明确的标注，指的是可以存在多点取代。反应容器——根据本发明用于包含样品和测试中其他成分的容器或装置。例如包括各种大小、各种形状的试管和微孔板。II.进行本发明的方式
本发明的公开提供了均相测试方法，尤其是这样的均相测试方法在化学发光标记的特异性结合伴侣和敏化剂标记的特异性结合伴侣共轭物与分析物相结合后，利用分析物的化学发光检测。进行均相测试和方法不需要将游离的特异性结合伴侣与复合物中结合的特异性结合伴侣分开。本发明的公开提供了用于通过特异性结合配对反应来检测物质的存在、定位或含量的快速和简便的均相测试。该测试需要在液相中使用与第一特异性结合伴侣相连接的化学发光化合物(“化学发光标记的特异性结合伴侣”)、与第二特异性结合伴侣共轭的敏化剂(“敏化剂标记的特异性结合伴侣”)、噪音调节剂(NMA)、增强剂。本发明的测试方法与其他均相测试方法的区别就在于不需要特殊的构建体，即被设计成具有可检测成分的被标记的特异性结合配对成员，可检测成分是未被活化的或是在复合物中与其他成分结合后只能产生特定的检测信号。和本发明公开的测试体系相反，因为需要特殊成分，其他的均相测试方法在制备上复杂、困难、并且成本高。本发明的测试为测试的设计及研发提供了更为简单、更为灵活的方法，并且允许为更多的分析物提供现成
的应用。本发明的测试方法与传统的非均相测试方法或基于分离的测试方法的区别就在于，不需要利用分离步骤或方法来将游离的特异性结合伴侣与复合物中被结合的特异性结合伴侣区分开来。通过使用本发明的测试方法，避免了分离，导致测试操作更为简单，测试耗时减少，有利于自动化。在本发明公开的测试方法中，使化学发光标记的特异性结合伴侣、敏化剂标记的特异性结合伴侣、噪音调节剂与样品放在一起。在一个实施方式中，当被特异性结合伴侣成员识别的分析物存在于样品中时，化学发光标记的特异性结合伴侣及敏化剂标记的特异性结合伴侣各自结合到分析物的不同区域，形成复合物。在另一个实施方式中，当样品中的分析物被一种特异性结合伴侣成员识别后，避免了另一种特异性结合伴侣成员结合在复合物中。这一般是通过下述方式来实现提供一种特异性结合伴侣成员作为分析物或分析物类似物以及敏化剂或化学发光化合物的共轭物，而另一种特异性结合伴侣成员是对于该分析物或者其他敏化剂或化学发光化合物具有结合亲合性的物质的共轭物。后一模式可以进行竞争性结合测试。产生与分析物相关的特定信号，在将测试混合物置于可生成亚稳态物质用于与化学发光化合物进行反应的条件下之后，开始进行检测。在另一个实施方式中，提供分析物的化学发光标记的类似物用于竞争性测试模式。分析物与化学发光标记的类似物竞争性地结合敏化剂标记的特异性结合伴侣。在竞争性结合测试的一个实施方式中，化学发光标记的类似物和敏化剂标记的特异性结合伴侣可预先形成复合物，并且添加分析物以取代被标记的类似物。在另一个实施方式中，化学发光标记的类似物、分析物及敏化剂标记的特异性结合伴侣可以混合在一起而没有预先形成结合复合物。产生与分析物相关的特定信号，在将测试混合物置于生成亚稳态物质用于与化学发光化合物进行反应的条件下之后，开始进行检测。在这种测试模式中，信号与分析物浓度呈反向相关性。作为特异性结合伴侣由于与分析物结合的结果，使敏化剂可操作地接近于化学发光化合物，从而可有效地在化学发光化合物附近生成亚稳态物质。亚稳态物质和化学发光化合物反应，导致产生光。术语“可操作地(的)接近”意味着化学发光化合物和敏化剂之间应该足够近，包括直至物理接触，以致于产生的亚稳态物质是在与化学发光化合物之间的距离在其扩散寿命内产生的。这意味着在亚稳态物质寿命内，它能够扩散穿过测试介质和穿过任何使用的悬浮性颗粒的介质而到达化学发光化合物。与需要用于测定分析物浓度的量相比，在体系中提供了过量的敏化剂标记的特异性结合伴侣和/或化学发光标记的特异性结合伴侣。可以存在并不接近于由敏化剂标记的特异性结合伴侣和化学发光化合物标记的特异性结合伴侣形成的结合复合物的“过量的亚稳态物质”或亚稳态物质，会导致增加非特异信号。当存在过量的亚稳态物质时，化学发光检测反应可能不能提供有用的、或者最多十分有限的信号和分析物之间的相关性。根据传统常识，过量亚稳态物质的产生或存在通常会导致测试失败，这是由于过多的非特异信号、或者限制了测试的灵敏度。可以通过稀释分析物将由过量亚稳态物质所产生的非特异性信号降至可接受的水平。然而，也会降低测试的灵敏度。令人惊讶的是，已发现噪音调节剂可以降低与过量亚稳态物质有关的非特异性信号。在本发明方法中，由过量亚稳态物质诸如单线态氧造成的非特异性背景信号可以通过比如使用单线态氧淬灭剂(SOQ)来抑制。本发明已经发现，添加特定的NMA化合物可带来出色的区分能力。通过使用NMA，在反应结合复合物中由化学发光标记和敏化剂标记之间的反 应所产生的信号与不是存在于这种复合物中的标记物的信号之间的比例将被极大地提高，而且无需稀释分析物就可以实现。NMA在提高测试灵敏度上的功效可根据下列式I进行理解。多种不同的游离型(如没有结合到分析物上)、复合型(如结合到分析物上)化学发光标记的特异性结合伴侣(“CLSBP”)和敏化剂标记的特异性结合伴侣(“SLSBP”)可能有助于产生可被观测到的化学发光信号。下面列举了四个可能的反应式I.结合的SLSBP+结合的CLSBP+接近的亚稳态物质一特异性信号2.结合的SLSBP+游离的CLSBP+过量的亚稳态物质一非特异性信号3.游离的SLSBP+结合的CLSBP+过量的亚稳态物质一非特异性信号
4.游离的SLSBP+游离的CLSBP+过量的亚稳态物质一非特异性信号如上述列表所显示，反应混合物中四种不同类型的化学发光剂-敏化剂配对发生反应，与亚稳态物质相互作用以便产生可被检测的信号，但是只有第一种类型产生的信号与测试中分析物含量相关。与来自于反应I的信号相比，NMA可以通过选择性地阻止、抑制或淬灭反应2-4中所产生的信号量来发挥作用。在本发明的实施方式中，通过特异性的结合反应提供了测定样品中所关注的分析物的方法，特异性结合反应涉及分析物与用于该分析物的特异性结合伴侣(sbp)，其中一种特异性结合伴侣被敏化剂化合物标记，敏化剂化合物可以是光敏剂，尤其是可以产生单线态氧的光敏剂。分析物的另一种特异性结合伴侣被化学发光化合物标记。标记的特异性结合伴侣由于与分析物结合导致形成被标记的复合物。当化学发光化合物与形成的亚稳态物质相互作用时，化学发光化合物发生化学发光反应。产生的化学发光与样品中分析物的含量相关。将敏化剂标记物置于产生亚稳态物质的条件下，通常会产生大量的亚稳态物质，远远多于与化学发光化合物反应所需要的量。只有一些亚稳态物质可接近结合复合物，因此能与复合物相互作用，从而产生化学发光反应。过量的亚稳态物质可能产生大量的“背景”信号，以致于不能得出有效的剂量-应答关系。为了能够进行均相非分离式测试，当产生化学发光信号所必需的全部反应成分以结合复合物的形式和以游离的形式或非结合的形式存在时，必须提供某种手段以便不进行物理分离便能区分被结合的或未被结合的被标记的特异性结合伴侣。本方法不需要也不使用特别设计的被标记的结合伴侣，如果该结合伴侣没有被带到结合复合物中，该结合伴侣就不能进行产生信号的反应。在本发明的测试方法中，通过在反应溶液中加入噪音调节剂(NMA)，复合物中与分析物结合的特异性结合伴侣成员与游离型的、非结合的特异性结合伴侣成员之间可实现必要的区分。在反应溶液中加入有效量的NMA，导致来自于结合的标记的特异性结合伴侣成员的信号超过背景信号(包括过量亚稳态物质或者没有接近结合复合物的亚稳态物质所产生的任何信号)的程度远远大于没有NMA时所发生的情况。在此处描述的方法中，能够阻止、抑制或淬灭亚稳态物质的NMA物质或化合物是单线态氧淬灭剂(S0Q)。NMA也可以是一种能够与单线态氧竞争反应而不产生化学发光的化合物。当信号与背景的相关性取得提高后，
该测试的用处增加，包括具有更高的检测灵敏度。本发明的一个方面是测定分析物的方法。与之前的均相测试方法不同，本发明不需要为了达到可以接受的信噪比而将样品或反应混合物稀释。该方法包括在一定条件下处理疑似含有分析物的样品，以使得如果存在分析物，就将影响彼此接近的光敏剂和化学发光化合物的含量，其中短寿命的亚稳态物质，即光敏剂所产生的单线态氧在其自衰之前能够与化学发光化合物发生反应。该方法进一步包括测定由化学发光化合物所产生的光强度。产生的光强度与介质中分析物的量相关。单线态氧可活化化学发光化合物，催化单线态氧生成的光敏剂通常响应于光激发，接着能量转移给分子氧。通常，表面与光敏剂和化学发光化合物接近，其中表面优选是悬浮颗粒物的表面。通过活化化学发光化合物而生成的产物会降解，优选会自发地降解，并伴随着发光。本发明可预测，分析物导致或抑制了光敏剂和化学发光化合物之间的距离相比它们在测试介质的本体溶液中的平均距离相互靠的更近。这种隔离取决于待分析样品中存在的分析物的含量。没能和化学发光化合物相结合的光敏剂分子产生的单线态氧在液相介质中衰变之前不能到达化学发光化合物。相对于实际的分析物产生的信号，该“过量的”单线态氧产生大量的非特异性背景信号，使得对分析物的检测变得困难，并且极大地削弱了此种测试的灵敏度。因此，优选使用NMA。NMA可干扰“过量的”单线态氧，因此会减少、淬灭或抑制单线态氧所产生的背景信号，导致信噪比和随之的测试灵敏度的提高。因此，此处描述的测试方法提供了以一种简单、有效、可重复性的方式检测以及测定众多分析物的方法，其运用简单的设备测定反应过程中所产生的光含量，信噪比及灵敏度也得到了极大地提高，并且无需稀释分析物或反应混合物。不管光敏剂和化学发光化合物之间是如何结合的，重要的是两种物质都不能与其特异性结合伴侣成员解离，而且测试过程中，都不能与结合了光敏剂和化学发光化合物配对中另一个成员的特异性结合伴侣成员相结合。因此，这些化合物与其各自特异性结合伴侣成员的解离必须比测试所需要的时间慢。化学发光化合物可以结合到特异性结合伴侣成员上，该特异性结合伴侣成员能够直接或间接地与分析物或测试成分结合，该测试成分的浓度受存在的分析物的影响。术语“能够直接或间接地结合”指的是，指定的实体物能够特异性地结合到实体物上(直接地)，或者指定的实体物能够特异性地结合至特异性结合配对成员、或具有两个或更多能够结合其他实体物的特异性结合伴侣的复合物上(间接地)。
表面通常有连接其的特异性结合伴侣成员。优选地，化学发光化合物通常在悬浮性颗粒内与此表面相连。此特异性结合伴侣成员一般能够直接或间接地与分析物或分析物的受体结合。当与光敏剂和化学发光化合物连接的特异性结合伴侣成员都能结合分析物时，就产生了夹心测试方案。当与光敏剂或化学发光化合物连接的特异性结合伴侣成员既能与分析物结合，也能与其类似物结合时，就会导致竞争性测试方案。上述用于光敏剂与颗粒连接或合并入颗粒中的相同的原则决定着化学发光化合物与表面连接或者合并入颗粒中。光敏剂一般通过照射含有上述反应物的介质来活化化学发光化合物。介质必须用具有一定的波长、且能量足以将光敏剂转化至激发态、进而使得它能够将分子氧活化为单线态氧的光照射。能够激发分子氧的光敏剂的激发态一般位于三重态，其比处于基态的光敏剂的能量高大约20Kcal/mol、通常至少23Kcal/mol。虽然可以使用较短的波长，如230-950nm，但是优选地，使用波长大约是450_950nm的光来照射介质。可以以任何传统方式，诸如照相、肉眼直观、光度计等，来测定产生的光，以便确定其与介质中分析物含量相关 的量。尽管通常优选使用能够被光敏剂有效吸收的波长的光照射来激发光敏剂，但也可以使用一些其他的激发方法，如从激发态的能量供体诸如第二光敏剂转移能量。当使用第二光敏剂时，使用的光的波长不能有效地被光敏剂充分的吸收，而是被第二光敏剂有效地吸收。第二敏化剂可以与测试成分结合，该测试成分与、或将与第一敏化剂结合，比如与表面结合或合并入有第一敏化剂的颗粒中。当采用第二光敏剂时，它通常比第一光敏剂在最低能量三重态时所具有的能量更高。发射线为632. 6nm的氦氖激光是一种廉价的激发光源。本发明中特别有用的是吸收峰位于约620至约700nm区域的光敏剂。测试中分析物的结合反应通常会在提供了最佳测试灵敏度的适中pH的水介质中进行。优选地，光敏剂的活化也在水介质中进行。然而采用分离步骤时，就可以使用非水介质诸如乙腈、丙酮、甲苯、氰苯等以及pH值非常高、即高于10. O或者非常低、即低于4. O的水介质。如上所述，可以在没有分离(均相)或分离(非均相)任何测试成分或产品的条件下来进行测试。当所使用的特异性结合伴侣成员是蛋白质时，水介质可以仅是水，或者可以包括
O.01-80体积百分比的助溶剂、但通常包括小于40%的助溶剂。用于结合反应的介质的pH值一般位于约4-11、通常位于约5-10、优选位于约6. 5-9. 5的范围内。当单线态氧生成过程中PH值不发生改变时，则pH值通常在与结合成员最佳结合的pH和用于信号产生和测试中其他试剂保持稳定的最佳PH值之间折衷。当为了产生信号而需要提高pH值时，包括添加碱性试剂在内的步骤会被插入在结合反应与单线态氧和/或信号产生之间。通常，提高的PH值大于10，通常是10-14之间。如上所述，也可以使用非水溶剂用于非均相测试，主要考虑的是溶剂不能与单线态氧有效地反应。可以采用多种缓冲液来获得理想的pH值及维持测试中的pH值。示例性的缓冲液包括硼酸盐、磷酸盐、碳酸盐、Tris、巴比妥等。使用特定缓冲液对于本发明来说不是关键所在，但是在单独的测试中一种或另一种缓冲液可能是优选的。测试中蛋白质配体与受体之间进行结合反应通常需要使用合适的温度，并且在测定期间通常是恒定的温度，优选25-40° C。用于结合反应的温育温度范围通常在约5-45° C之间，一般在约15-40° C，更通常在约25-40° C之间。如果测试中发生核酸结合，通常会使用更高的温度，通常在约20-90° C，更通常在约35-75° C之间。检测期间的温度，即产生单线态氧和检测光时的温度，通常的范围在约20-100° C之间，更通常在约25-50° C，更通常在约25-40° C之间。待测定的分析物的浓度一般在1(Γ4Μ至低于1(Γ16Μ之间变化，通常在1(Γ6Μ至1(Γ14Μ之间。一些考虑因素，诸如测试是定性的、半定量的还是定量的，特定检测技术，所关注的分析物浓度以及理想的最大温育时间，都通常决定了不同试剂的浓度。在竞争性测试中，当测试中众多试剂的浓度通常被所关注的分析物的浓度范围决定时，每种试剂的最终浓度通常是根据经验在一定的范围内获得测试最佳的灵敏度。这就是说，分析物浓度的显著变化将会提供精确地可测定的信号差。特异性结合伴侣成员的浓度取决于分析物的浓度、期望的结合率以及特异性结合伴侣成员非特异性结合的程度。通常，特异性结合伴侣成员至少以最低预测的分析物的浓 度存在，优选至少以最高预期分析物的浓度存在，对于非竞争性测试，浓度可以是比最高分析物浓度高10至IO6倍，但通常低于10_4m，优选低于10_6m，一般位于10—11和IO-7M之间。与特异性结合伴侣成员结合的光敏剂或化学发光化合物的数量通常是每个特异性结合伴侣成员至少一个分子，可以高达105个，当光敏剂或化学发光化合物合并入颗粒时，通常是10至104个。当添加的顺序可以有较大的变动时，取决于测试特性，有特定的优选顺序。最简单的添加顺序便是同时加入所有的材料。可选择的是，按顺序完全组合或部分组合试剂。当测试是竞争性时，通常理想的是在样品与能结合分析物的特异性结合伴侣成员组合后再添加分析物的类似物。可选地，在试剂组合后、在引起敏化剂产生单线态氧及检测发射光前，涉及温育的步骤，温育的时间一般是约30秒至6小时，更通常是约2分钟至I小时。在均相测试中，在所有的试剂组合后，可根据需要温育。然后，照射组合物，导致产生单线态氧及可被检测到的化学发光信号。测定该信号，该信号与待测样品中分析物的含量相关。本发明在均相测试中采用的试剂量取决于分析物的特性。通常，本发明均相测试同其他已知的方法相比，显示了更高的灵敏度。该优势主要得益于本方法中的信噪比得到了提高，这通过使用作为噪音调节剂的自由基捕集器(FRT)或单线态氧淬灭剂(SOQ)来实现。化学发光标记的特异性结合伴侣该方法需要使用连接有第一特异性结合伴侣的化学发光化合物(即“化学发光标记的特异性结合伴侣”)。在本申请公开的测试和方法中，化学发光标记化合物将被固定到固体的表面上，固体比如是颗粒、珠子、多孔板或膜、过滤器、试管、量油计或其它亲合测试和方法中所使用的移液管。化学发光标记的特异性结合伴侣包括化学发光标记化合物和特异结合配对成员。在一些实施方式中，化学发光标记的特异性结合伴侣包括一种或多种化学发光标记化合物。在一些实施方式中，化学发光标记的特异性结合伴侣包括一个或多个拷贝的特异性结合配对成员。在一些实施方式中，化学发光标记化合物被直接连接到一个或多个拷贝的特异性结合配对成员上。在一些实施方式中，一个或多个化学发光标记化合物可被直接连接到一个拷贝的特异性结合配对成员上。术语“直接连接”，也可指直接标记；包括共价结合反应、离子结合反应、疏水作用。在一个实施方式中，化学发光标记被共价连接到用于分析物的特异性结合伴侣上。在一些实施方式中，一个化学发光标记化合物可被间接连接到一个或多个拷贝的特异性结合配对成员上。在一些其他的实施方式中，一个或多个化学发光标记化合物可间接连接到一个拷贝的特异性结合配对成员上。除了化学发光标记化合物和特异性结合配对成员外，间接连接还需要一种或多种辅助物质。辅助物质能够溶于水溶液中。包含一种或多种辅助物质的化学发光标记的特异性结合伴侣可溶解于水溶液中。在不同的实施方式中，辅助物质包括可溶性蛋白(比如链霉亲和素、抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、生物素、阳离子BSA、fos、jun、钥孔戚血蓝蛋白“KLH”、免疫球蛋白及它们的片段或部分(无论是天然的或是基因工程化的)、可溶性合成树聚物(比如PAMAM)、·可溶性合成聚合物(比如聚丙乙烯酸PAA)、可溶性天然聚合物(比如多糖诸如功能化的葡聚糖、氨基葡聚糖、寡聚核苷酸、蛋白以及其任何组合物)、脂质体、微团、囊泡以及由一种或多种可溶性合成聚合物、可溶性天然聚合物和可溶性蛋白的组合物(如IgG/生物素/链霉亲和素/PAA)。其他可溶解于水溶液并且可以功能化用于连接一种或多种化学发光标记化合物和/或特异性结合伴侣的辅助物质也可预期被用于本发明公开的方法和测试中。在一些实施方式中，与化学发光标记共价连接的辅助物质是蛋白或肽。典型的可溶性蛋白包括白蛋白、抗生物素蛋白、链霉亲和素、抗生物素蛋白、a-螺旋蛋白、fos、jun、钥孔戚血蓝蛋白“KLH”、免疫球蛋白及其片段或部分(无论是天然的或是基因工程化的)、以及它们的任何组合物。在一个实施方式中，辅助物质是一种通用型抗体，比如IgG，其中化学发光标记以维持与分析物特异捕获抗体的结合亲合性的方式与此通用型抗体共价连接。在另一个化学发光标记的特异性结合伴侣的实施方式中，化学发光化合物通过生物素-链霉亲和素或生物素-中性抗生物素蛋白的连接与一种或多种特异性结合伴侣相连接。化学发光标记的特异性结合伴侣合并链霉亲和素-生物素，或其他等价的连接，可以比如提供作为生物素共轭物的特异性结合伴侣，其中化学发光化合物是链霉亲和素结合的共轭物。可选择的生物素-链霉亲和素和相似的连接是众所周知的。可选择的化学发光标记的特异性结合伴侣与链霉亲和素-生物素的合并，或等价的连接，可以使用键合用于特异性结合伴侣或化学发光化合物与一种或多种附加的辅助物质的连接。在另一种实施方式中，与化学发光标记共价连接的辅助物质是合成聚合物。使用聚合辅助物用于连接化学发光化合物的测试模式，可以通过共价连接如生物素-亲和素连接、或者是通过通用型捕获成分比如特异性的免疫球蛋白种类的间接连接，与用于分析物的特异性结合伴侣相连接。在选择的实施方式中，化学发光标记的特异性结合伴侣包括选自于多糖或可溶性自组装的蛋白质的辅助物质。在一些实施方式中，化学发光标记的特异性结合伴侣包括多糖诸如氨基葡聚糖或羧基葡聚糖。在一些实施方式中，多肽诸如氨基葡聚糖或羧基葡聚糖的平均分子量在IOKDa至500KDa之间，在其他的实施方式中，平均分子量在25_150KDa之间。在进一步的实施方式中，化学发光标记的特异性结合伴侣包括多糖诸如氨基葡聚糖或羧基葡聚糖，多糖的平均分子量在50-100kDa之间。在另一个进一步的实施方式中，化学发光标记的特异性结合伴侣包括多糖诸如氨基葡聚糖或羧基葡聚糖，多糖的平均分子量为70kDao在许多实施方式中，化学发光标记的特异性结合伴侣的平均直径在5nM_800nM包含的范围内。在选择的实施方式中，通过合并可溶性蛋白、或其他可溶性天然聚合物或可溶性合成聚合物、或其组合物，化学发光标记的特异性结合伴侣的平均直径在200nM-600nM包含的范围内，在一些进一步的实施方式中，直径在300nM-500nM包含的范围内。敏化剂标记的特异性结合伴侣该测试方法需要使用连接有第一特异性结合伴侣的敏化剂化合物(即“敏化剂标记的特异性结合伴侣”)。在本申请公开的测试和方法中，敏化剂化合物不固定到固体表面上，固体比如是颗粒、多孔板或膜、滤纸、试管、量油计或其它亲合测试和方法中所使用的移 液管。敏化剂标记的特异性结合伴侣包括敏化剂标记化合物和特异结合配对成员。在一些实施方式中，敏化剂标记的特异性结合伴侣包括一种或多种敏化剂化合物。在一些实施方式中，敏化剂标记的特异性结合伴侣包括一个或多个拷贝的特异性结合配对成员。在一些实施方式中，敏化剂标记化合物被直接连接到一个或多个拷贝的特异性结合配对成员上。在一些实施方式中，一个或多个敏化剂标记化合物可直接连接到一个拷贝的特异性结合配对成员上。术语“直接连接”，也可指直接标记，包括共价结合相互作用、离子结合相互作用、疏水相互作用。在一个实施方式中，敏化剂标记共价连接到用于分析物的特异性结合伴侣上。在一些实施方式中，一个敏化剂标记化合物可间接连接到一个或多个拷贝的特异性结合配对成员上。在一些其他的实施方式中，一个或多个敏化剂标记化合物可间接连接到一个拷贝的特异性结合配对成员上。除了特异性结合配对成员外，间接连接还需要辅助物质。辅助物质能够溶于水溶液中。包含一种或多种辅助物质的敏化剂标记的特异性结合伴侣可溶解于水溶液中。在不同的实施方式中，辅助物质包括可溶性蛋白(比如链霉亲和素、抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、生物素、阳离子BSA、fos、jun、钥孔戚血蓝蛋白“KLH”、免疫球蛋白及它们的片段或部分(无论是天然的或是基因工程化的)、可溶性合成树聚物(比如PAMAM)、可溶性合成聚合物(比如聚丙乙烯酸PAA)、可溶性天然聚合物(比如多糖诸如葡聚糖、寡聚核苷酸、蛋白以及它们的任何组合物)、脂质体、微团、囊泡以及由一种或多种可溶性合成聚合物、可溶性天然聚合物和可溶性蛋白的组合物(如IgG/生物素/链霉亲和素/PAA)。其他可溶解于水溶液并且可以功能化用于连接一种或多种敏化剂标记化合物和/或特异性结合伴侣的辅助物质也可预期被用于本发明公开的方法和测试中。在一些实施方式中，与敏化剂标记共价连接的辅助物质是蛋白或肽。典型的可溶性蛋白包括白蛋白、抗生物素蛋白、链霉亲和素、抗生物素蛋白、a-螺旋蛋白、fos、jun、钥孔戚血蓝蛋白“KLH”、免疫球蛋白及它们的片段或部分(无论是天然的或是基因工程化的)、以及它们的任何组合物。在一个实施方式中，辅助物质是一种通用型抗体，比如IgG，其中敏化剂标记以维持与分析物特异捕获抗体的结合亲合性的方式与此通用型抗体共价连接。在另一个敏化剂标记的特异性结合伴侣的实施方式中，敏化剂化合物通过生物素-链霉亲和素连接与一种或多种特异性结合伴侣相连接。敏化剂标记的特异性结合伴侣合并链霉亲和素-生物素，或其他等价的连接，可以比如提供作为生物素共轭物的特异性结合伴侣，其中敏化剂化合物是链霉亲和素结合的共轭物。可选择的生物素-链霉亲和素和相似的连接是众所周知的。可选择的敏化剂标记的特异性结合伴侣与链霉亲和素-生物素的合并，或等价的连接，可以使用键合用于特异性结合伴侣或敏化剂化合物与一种或多种附加的辅助物质的连接。在另一种实施方式中，与敏化剂标记共价连接的辅助物质是合成聚合物。使用聚合辅助物用于连接化学发光化合物的测试模式，可以通过共价连接如生物素-亲和素连接、或者是通过通用型捕获成分比如特异性的免疫球蛋白种类的间接连接，与用于分析物的特异性结合伴侣相连接。在选择的实施方式中，敏化剂标记的特异性结合伴侣包括选自于多糖或可溶性自 组装的蛋白质的辅助物质。在一些实施方式中，敏化剂标记的特异性结合伴侣包括多糖诸如氨基葡聚糖或羧基葡聚糖。在一些实施方式中，多肽诸如氨基葡聚糖或羧基葡聚糖的平均分子量在IOKDa至500KDa之间，在其他的实施方式中，平均分子量在25-150KDa之间。在进一步的实施方式中，敏化剂标记的特异性结合伴侣包括多糖诸如氨基葡聚糖或羧基葡聚糖，多糖的平均分子量在50-100kDa之间。在另一个进一步的实施方式中,敏化剂标记的特异性结合伴侣包括多糖诸如氨基葡聚糖或羧基葡聚糖，多糖的平均分子量为70kDa。在大多数实施方式中，敏化剂标记的特异性结合伴侣的平均分子量在200kDa-3000kDa包含的范围内。在一些实施方式中，敏化剂标记的特异性结合伴侣的平均分子量一般在350kDa-1500kDa之间。敏化剂标记除了上述的光敏剂外，本发明中所使用的敏化剂还欲包括那些能够产生亚稳态物质诸如单线态氧、且优选较少或不被外部光源活化的物质和组合物。因此，比如已经表明钥酸盐(MOO4.2_)、氯过氧化物酶、髓过氧物酶加溴化物或氯离子(Kanofsky, J. Biol. Chem.(1983) 259，5596)可以催化过氧化氢转化为单线态氧和水。这些组合物的任何一个都可以包括在结合了特异性结合伴侣成员的颗粒内，并且被使用在测试方法中，该方法中包括作为辅助试剂的过氧化氢，氯过氧化酶被连接到表面，钥酸盐被合并到脂质体的水相中。那些作为被热、光或化学反应所激发后能够释放单线态氧分子的化合物的敏化剂也包括在本发明的范围内。最为熟知的此类化合物有芳烃内过氧化物，如1，4- 二羧基乙基-1，4-萘内过氧化物、9，10- 二苯基蒽-9，10内过氧化物和5，6，11，12-四苯基萘5，12-内过氧化物。力口热或此类化合物直接吸收光，可释放出单线态氧。噪音调节剂(NMA)本发明的噪音调节剂是当包括在此处描述测试反应混合物中时可干扰特异性结合配对的化合物，以致于被分析物结合的被标记的特异性结合伴侣成员所产生的信号超过背景信号的程度显著大于没有NMA时所发生的情况。在本发明的方法中，NMA是一种能够阻止、抑制或淬灭敏化剂所产生的亚稳态类物质的化合物，从而减少了 “过量”亚稳态物质产生的背景信号，并且提高了测试的灵敏度。在本发明的方法中，NMA是单线态氧淬灭剂(SOQ)0测试反应中的一种或多种噪音调节剂以KT6M-KT1M之间的浓度存在，通常情况下在IO-6M-IO-2M之间，常用的浓度范围IO-5M-IO-3M,有时使用的浓度则位于I(T5M-1(T4M之间。在一些实施方式中，根据本发明的方法，在反应中噪音调节剂以5X10_6M-5X10_4M的范围存在。在进一步的实施方式中，根据本发明的方法在反应中噪音调节剂以5Χ1(Γ5Μ-5Χ1(Γ4Μ 的范围存在。噪音调节剂可以作为单独的试剂而存在，或者是以比反应溶液中想要的浓度更高的溶液存在。在这种实施方式中，将经测量的工作液定量地加入到反应溶液中，以获得所需的反应浓度。在另一种实施方式中，将噪音调节剂并入到含有一种或多种标记的特异性结合伴侣成员的溶液中。在另一个实施方式中，噪音调节剂作为包含反应化合物的试剂成分 而被提供，其中使用反应混合物而不是使用能量来产生亚稳态物质。噪音调节剂提高信号-背景比或信噪比的程度的变化取决于其他因素中的化合物的特性及其使用时的浓度。根据“提高倍数”来对提高的程度进行划分，其中在使用噪音调节剂进行的测试中在特定的分析物浓度下测试的信号背景比与不加噪音调节剂在相同的分析物浓度下的信号背景比进行比较。提高倍数>1、或大约O. 5-1之间、或大约O. 4-1之间、或大约O. 3-1之间、或大约O. 2-1之间，是改进测试的标准以及噪音调节剂有利效果的证据。在本发明的实施方式中，提高倍数达到可以至少是2倍，诸如至少为5倍，以及包括至少是10倍，或至少是50倍。根据下面的实施例可以看出，测试中，提高倍数会作为分析物浓度的函数而变化。比如，当分析物浓度增加时，提高倍数可以提高。在另一个实施方式中，提高倍数随分析物浓度的变化可以产生一个更线性的校准曲线，即化学发光强度比上分析物浓度的曲线。在此处描述的方法中，NMA是能够干扰亚稳态物质诸如混合反应中单线态氧的物质或化合物。在一个实施方式中，NMA是一种与化学发光化合物竞争用于与单线态氧反应的化合物。在一个实施方式中，NMA是单线态氧淬灭剂(S0Q)。单线态氧淬灭剂通过光物理淬灭或者通过化学反应淬灭来淬灭单线态氧。通过光物理淬灭型进行的淬灭剂SOQ包括，但不限于生育酚、抗坏血酸盐、类胡萝卜素(如β-胡萝卜素、番茄红素等)、一些特定的氨基酸(如脯氨酸)、叔胺(如二氮杂二环[2. 2. 2]辛烷或DABCO等)、叠氮化物(如叠氮化钠)、特定的蛋白质(如硫氧还蛋白)、钼族金属胶体(US2007/0090153中有描述，并入本文以供参考)、氨基-酰胺化合物(如利多卡因)。通过化学反应进行的淬灭剂SOQ包括，但不限于甲基哌啶类(如2，2，6，6_四甲基哌啶)、维生素D、双烯和共轭多烯(如花青染料)、富含电子的烯烃(如烯醇醚、烯胺和二乙烯基硫)、鸟嘌呤等。当单线态氧反应化合物被用作单线态氧淬灭剂时，应当理解它作为化学发光化合物的竞争性反应物用于消耗单线态氧。优选地，竞争性化合物，尤其是当它是富含电子的烯烃时，也不能形成化学发光产物。较为不理想的是，反应产物是化学发光的，但是在不同波长下发光。化学发光化合物在本发明公开的实践中，化学发光化合物是指那些能够与单线态氧进行化学反应从而形成不稳定的中间体的化合物，该中间体可分解，伴随着同时或随后的发光。一般发光是自然发生的，没有加热或添加其他的能量，并且没有加入催化剂、能量受体或导致中间体分解和发光的其他辅助试剂，该中间体是通过化学发光化合物与单线态氧反应形成的。优选的化学发光化合物通常是能够与单线态氧反应的富含电子的化合物，通常会形成不稳定的中间体，诸如二氧环丁烷或二氧环丁酮。这些化合物的典型例子是化学发光领域中众所周知的烯醇醚、烯胺、9-烷叉黄原胶、9-烷叉-N-烃基吖啶满、芳乙烯醚、双环氧乙烯、二甲基噻吩、芳香性咪唑、光泽精。所关注的化学发光化合物在250-1200nm的波长范围内发光，一般在大于300或400nm的波长下发光。单独地或者与荧光分子一起在高于血清成分吸收光区域的波长处发光的化合物对于本发明将特别有帮助。血清的荧光迅速下降超过500nm，超过550nm的荧光变得相对不重要。因此，当分析物在血清中时，特别有用的是发射光超过550nm的化学发光化合物，优选超过600nm。为了避免化学发光化合物的自我敏化，优选使用那些不能吸收用于激发光敏剂的光的化学发光化合物。由于一般优选用大于500nm的光波长激发敏化剂， 因此化学发光化合物的光吸收优选是远低于500nm。本发明中所使用的乙烯醚通常具有下述结构
D1Dj
— /
翁.、
D1OD2⑴此处，D1可独自选自下述基团H和I至50个原子的取代基，优选是芳基、羟芳基、氨芳基、叔烷基、氢、烷氧基、杂芳基等，也可以与一个或两个碳原子形成环，如环烯烃、金刚烧烯(adamantylidene)、7_降冰片烯等。D2优选是烧基或芳基。典型的烯醇醚作为示例是，但不限于，2，3- 二芳基-4，5- 二羟双环氧乙烯。
KAi .‘(2)此处的X是O、S或ND2, Ar及Ar’是芳基，包括取代型的芳基，其中至少有一个取
代基是氣基、乙稀基或轻基。本发明中所使用的乙烯基硫化物一般包括了上述的烯醇醚，其中氧原子被硫原子取代。本发明中使用的烯胺一般具有下述的结构
C .................................................C...其中D3可以独立地是烷基或芳基，烯烃上剩余的取代基选自下组氢和1-50个原子的取代基，优选芳基、羟芳基、氨芳基、叔烷基、H、烷氧基、杂芳基等。9-烷叉-N-烃基吖啶满通常具有下述结构


本申请公开了在疑似含有分析物的介质中测定分析物的方法。一种方法包括在一定的条件下处理疑似含有分析物的介质，以致于如果存在分析物，分析物能致使光敏剂和化学发光化合物接近。当光敏剂接近时，光敏剂产生单线态氧，活化化学发光化合物。利用单线态氧淬灭剂(SOQ)可降低或抑制单线态氧没有接近时产生的非特异性信号。随后，活化的化学发光化合物产生光，而产生的光的量与介质中分析物的含量相关。利用噪音调节剂显著提高了信噪比和测试的灵敏度。本申请也公开了组合物和试剂盒。