专利名称：一种生物防腐剂及将该生物防腐剂用于食品防腐保鲜的方法随着我国速冻食品行业的快速发展，备受人们喜爱的肉糜、鱼糜等制品的需求量不断增加。鱼糜制品是以鱼糜为主要成分，添加一定辅料如食盐、淀粉、白糖、脱腥剂等，经过擂溃、成型、凝胶化等一系列加工制成的有凝胶特性的产品。市场上常见的鱼糜制品有模拟蟹制品、鱼丸、鱼糕、鱼面、鱼排、鱼肉香肠、虾丸、鱼卷等。这些鱼糜制品食用方便，营养价值高、口感好，深受消费者欢迎，而且鱼丸等鱼糜制品是亚洲居民传统食品，具有广泛的市场人群。此外，此类鱼糜制品生产工艺简单，对原料要求不高，能够提高各种鱼类的深加工程度和低值鱼的经济价值。鱼糜制品的加工过程中，鱼糜原料经过多次搅碎、漂洗等工艺，碎化的鱼肉又经常暴露在空气中，从而加速了脂肪氧化和鱼肉自我分解劣变。此外在鱼糜制品的加工过程中， 碎化的鱼肉表面积更大，暴露在空气中也更容易接触微生物，使微生物污染的几率增加，这就使得鱼糜制品非常容易腐败变质。为延长鱼糜制品的保质期，工业加工中常用冷冻方式保存鱼糜制品。在低于_18°C 的温度下，鱼丸等鱼糜制品可以储藏6个月以上而不变质，但传统的_18°C以下的冷冻贮藏、运输和销售方式，不仅导致了鱼糜制品凝胶结构、口感和风味品质的下降，而且导致了极高的能源消耗。这与低碳经济、节能增效和降低企业能源成本的发展趋势并不一致。目前，国内对鱼糜制品保鲜的研究，无论是开发保鲜剂还是采用冷杀菌方式，均集中在冷藏保鲜方面。在冷藏条件下保鲜鱼糜制品已成为主要的研究内容和发展方向。因此，研究鱼糜制品冷藏保鲜技术，改进鱼糜制品生产加工储运工艺，降低能耗，具有重要的经济意义和产业意义。鱼丸是我国传统鱼糜制品，具有蛋白质含量高、脂肪含量低、口感嫩爽等特点，而深受消费者欢迎。然而因鱼丸含水量高、组织脆嫩，在贮藏的过程中极易腐败变质。若采用高压灭菌或冻藏保鲜，易使其质构、风味发生显著变化，而且会增加企业的能耗成本。采用 4°C左右的冷藏方式，尽管能保持鱼丸的组织结构，但保鲜期一般仅为3 5d(天)。如何有效延长保鲜期、保持其原有风味品质并保证产品的安全卫生是传统鱼糜制品工业化生产中亟待解决的问题。生物保鲜技术是利用生物保鲜物质本身具有的良好的抑菌作用，来达到防腐保鲜之目的，它以无毒、安全等特点，显示出良好的应用前景。目前我国允许使用的天然生物保鲜剂只有乳酸链菌肽(Nisin)和纳他霉素(Natamycin)两种，而且已经广泛的应用于食品的防腐保鲜研究。由于生物保鲜物质在达到防腐保鲜目的的同时，还不会造成食品的毒素污染，而且有些生物保鲜剂本身就是食品中的某种营养成分。因此，开发高效安全的天然食品防腐剂已成为食品添加剂发展的主要方向。
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种能有效提高食品保鲜期的生物防腐剂。本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种将上述生物防腐剂用于食品防腐保鲜的方法。本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为本发明生物防腐剂，它是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y_6分泌表达的抗菌物质，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y-6 的保藏编号为 CGMCC No. 5451。本发明的生物防腐剂能够显著的抑制微生物的生长，延长鱼丸等糜类食品的保质期。研究表明，当鱼丸中抗菌物质的添加浓度为2mg/g时，其保鲜效果最佳，可使菌落数降低1. 23个数量级，TBA值和TVB-N值与对照组相比上升缓慢，鱼丸的质构特性也没有显著的变化，且与乳酸链菌肽的保鲜效果相当。因此，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y-6产生的抗菌物质作为一种天然防腐剂具有很好的开发价值。至于制备上述生物防腐剂，可以采用如下的步骤1)取斜面菌种一环到种子培养基中，；35 40°C，120 200r/min，培养12 Mh， 优选培养参数为37°C，160r/min，培养18h ；2)按照2 4%的接种量接入装有IOOmL发酵培养基的500mL容器中，25 30°C， 120 200r/min，发酵培养28 36h，优选培养参数为，160r/min，发酵培养32h ；3)发酵液在0 4°C条件下离心去菌体得到上清液，上清液用盐酸调pH值至2. 5， 0 4°C条件下下充分沉淀，然后离心分离，收集沉淀物；4)沉淀物用70%甲醇水溶液溶解提取，收集提取液并将其pH值调为中性，旋转蒸发除去甲醇后真空冷冻干燥即得；前述的种子培养基的配方为牛肉膏4 6g，蛋白胨8 12g，氯化钠4 6g，酵母膏4 6g，葡萄糖4 6g，蒸馏水lOOOmL，pH = 7. 0-7. 4 ；前述的发酵培养基的配方为葡萄糖9 13g，MgS04 0 . 4 0. 6g，L-谷氨酸钠4 6g, KCl 0. 4 0. 6g, KH2PO4 0. 9 1. lg, FeSO4 0. 13 0. 17mg, MnSO4 4 6. Omg, CuSO4 0. 14 0. 18mg,蒸馏水 IOOOmL, pH = 6. 75 7. 0。所述种子培养基的配方优选为牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，酵母膏5g，葡萄糖 5g，蒸馏水 lOOOmL，pH = 7. 0-7. 4。所述发酵培养基的配方优选为葡萄糖llg，MgSO4 0. 5g, L-谷氨酸钠5g，KCl 0. 5g, KH2PO4 1. 0g，FeSO4 0. 15mg, MnSO4 5. Omg, CuSO4 0. 16mg，蒸溜水 lOOOmL，pH = 6. 91。本发明将上述的生物防腐剂用于食品防腐保鲜的方法是先将生鲜食品剁碎， 根据调味需要加入辅料，捣勻，其后加入生物防腐剂并搅拌均勻，然后成型熟化，冷却后包装即得成品；其中生物防腐剂的添加量为生鲜食品质量的0. 05 0. 5%。优选是在所述包装步骤后还采用脉冲强光对成品进行杀菌处理。所述脉冲强光的杀菌光谱以由 UV-A(400nm-315nm)、UV-B (315nm-280nm)、UV-C (280nm-200nm)组成为宜，且其中脉冲紫外线杀菌参数优选为单次剂量150-450mj/cm2，频次为1_3次/4s，处理时间为20_50s。脉冲强光杀菌技术是利用惰性气体灯发出与太阳光谱相近、但强度更强的紫外线至红外线区域强烈脉冲闪光来杀灭固体表面、气体和透明液体中的微生物。1996年，美国食品及药物管理局 (FDA)批准采用脉冲强光作为控制食品表面微生物的灭菌手段。与传统的杀菌方法相比，其主要优点在于①处理时间短、操作方便，对食品的成分和感官特性影响小；②投资相对较少，能耗低，适合大规模工业化和连续化生产；③适合流体食品、固态食品及其包装材料的杀菌和消毒。研究表明，脉冲强光可有效杀灭包括细菌、霉菌、孢子、病毒、原生质、休眠孢子等在内的各类微生物并且对食品中的内源酶也具有灭活作用。上述方法中，脉冲强光处理前采用的包装材料为可透过紫外线的包装材料，如PE 保鲜膜。该方法中生物防腐剂用于控制鱼丸等糜类食品内部腐败微生物，而脉冲强光则对鱼丸等糜类制品表面和/或包装材料表面微生物进行杀菌，结果显示生物抗菌物质与脉冲强光之间具有协同增效作用，在4°C下贮藏，其保质期可达3周以上，此方法简单实用，是一种环保绿色杀菌技术。保藏说明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y_6于2011年11月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. M51，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。图1为不同添加量的生物防腐剂对鱼丸贮藏过程中细菌总数的影响；图2为生物防腐剂添加量对鱼丸贮藏过程中TBA值的影响；图3为生物防腐剂添加量对鱼丸贮藏过程中TVB-N值的影响；图4为生物防腐剂添加量对鱼丸贮藏过程中硬度的影响；图5为生物防腐剂添加量对鱼丸贮藏过程中弹性的影响；图6为生物防腐剂添加量对鱼丸贮藏过程中咀嚼性的影响；图7为本发明生物防腐剂HPLC色谱图。鲜鲢鱼一洗净一采肉一漂洗一脱水一精滤一排斩剁碎一调料一成型一水煮一冷
却一包装辅料配方鱼肉100g，取食盐3g，淀粉20g，砂糖2g，味精0.8g，水30g。1. 2. 2生物防腐剂(本实施例中又称抗菌物质)的制备取斜面菌种一环到种子培养基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，酵母膏5g，葡萄糖5g,蒸馏水IOOOmL, pH = 7. 0-7. 4)中，37 °C，160r/min,培养18h后，按照3 %的接种量接入装有IOOmL发酵培养基(葡萄糖IlgjMgSO4 0. 5g，L-谷氨酸钠5g，KCl 0. 5g，KH2PO4
1.0g, FeSO4 0. 15mg, MnSO4 5. Omg, CuSO4 0. 16mg，蒸馏水 lOOOmL，pH = 6. 91)的 500mL 三角瓶中J8°C，160r/min，发酵培养32h。发酵液在4°C下离心15min (8000r/min)去菌体得到上清液，上清液用6mol/L的盐酸调pH值为2. 5，4°C下沉淀lh。然后以lOOOOr/min的转速低温(0 4°C)离心15min，收集沉淀物，用体积含量70%甲醇水溶液溶解提取三次，收集提取液并将其PH值调为中性，旋转蒸发除去甲醇后真空冷冻干燥可得到生物防腐剂，分析表明其对食品常见致病菌和腐败真菌具有较好的抑菌活性。1.2.3生物防腐剂对鱼丸保鲜效果的研究在鱼丸制作过程中添加不同含量的抗菌物质，使其最终浓度分别为0、0.5、1.0、
2.0,3. 0mg/g,另外将添加0. 3mg/g nisin的鱼丸作为阳性对照组。鱼丸制成后立即用无菌食品保鲜袋密封包装，将样品放置于4°C下储藏，定期对鱼丸的细菌总数、TBA值、TVB-N 值、硬度、弹性和咀嚼性指标进行检测。检测随机抽3袋，取平均值。1. 2. 4细菌总数的测定在无菌操作台内，称取样品10g，置于90mL无菌生理盐水中，充分均质后，做成 1 10的稀释液，按GB 4789. 2-2010规定的方法进行稀释平板计数。1.2.5硫代巴比妥酸值(TBA)的测定取IOg样品斩碎均勻后，加50mL 7. 5%的三氯乙酸(含0. 1 % EDTA)，振摇30min， 双层滤纸过滤两次。取5mL上清液，加入5mL 0. 02mol ·Ι^2-硫代巴比妥酸溶液，沸水浴中保温40min，取出冷却Ih后，以1600r/min离心5min，上清液中加5mL氯仿摇勻，静置分层后取上清液，分别在532nm和600nm处比色，记录消光值并用以下公式计算TBA值。TBA 值(mg · IOOg-1) = (A532-A600)/155 X (1/10) X 72. 6X 1001. 2. 6挥发性盐基氮值(TVB-N)的测定取IOg样品斩碎均勻后，置于锥形瓶中，添加蒸馏水50mL，震摇后浸渍30min，过滤，取滤液按GB 5009. 44-2003微量扩散法测定，标准盐酸浓度为0. Olmol/L。1.2. 7质构特性的测定鱼丸切成长1. 5cm,宽Icm大小的长方体，用CT3质构仪进行分析。设定参数测量前探头下降速度5. Omm/s，测试速度0. 5mm/s.测量后探头回程速度0. 5mm/s，针入距离6mm。 触发力值5g，探头类型ρ/5。1.2. 8抗菌物质的HPLC分析抗菌物质用甲醇溶解，经0. 45 μ m有机滤膜过滤后进行HPLC分析。HPLC分析条件如下流动相含0. 1 %三氟乙酸的乙腈(A)和纯水(B)，洗脱过程 0-100% (A)，0-60min，100% _0 (B)，0_60min，流速为 1. OmL/min，检测波长 230nm。1. 2. 9数据统计分析
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实验数据用X= IiSD表示，采用SAS 8. 2软件对实验数据进行方差分析。当ρ
<0. 05时，表示差异显著，当ρ > 0. 05时，表示差异不显著。所有实验重复3次。2结果与讨论2. 1不同浓度的抗菌物质对鱼丸贮藏品质的影响2. 1. 1抗菌物质添加浓度对细菌总数的影响含有不同添加量抗菌物质的鱼丸在贮藏程中的细菌总数变化如图1所示。鱼糜制品卫生标准(GB10132-20(^)规定，非即食类鱼糜制品细菌总数不得超过5X 104cfu/g。从图1可以看出，随着贮藏时间的延长，细菌总数不断增加，添加抗菌物质可以明显抑制细菌的生长，且添加的浓度越高，抑制效果越好。未添加抗菌物质的鱼丸在第16d其菌落数已达到5. 661og cfu/g，且表面发粘出现感官腐败现象，而抗菌物质添加浓度分别为ang/g和 3mg/g的鱼丸其菌落数为4. 431og cfu/g和4. 321og cfu/g，添加nisin的阳性组其菌落数为4. 571og cfu/g。表明所添加的抗菌物质与nisin均可有效延长鱼丸的保藏时间。方差分析表明，添加不同浓度抗菌物质的样品组之间的抑菌活性具有显著性差异 (p< 0.005)。多重比较显示，与对照组相比，添加浓度分别为aiig/gJmg/g的样品组(ρ
<0. 001，ρ < 0. 001)及添加nisin的阳性组(ρ < 0. 05)均存在显著性差异，但这三组样品之间的抑菌活性无显著性差异，说明所制备的抗菌物质在鱼丸储藏过程中能够有效的抑制微生物的生长，且以添加量ang/g时效果最佳。2. 1.2抗菌物质添加浓度对TBA值的影响添加不同量抗菌物质的鱼丸在贮藏过程TBA值的变化如图2所示，随着贮藏时间的延长，TBA值呈缓慢上升态势。但添加抗菌物质以及nisin的样品后，其TBA值在不同贮藏时间整体上小于空白对照组，添加浓度分别为2mg/g(p < 0. 01)和3mg/g(p < 0. 01)的样品组与空白对照组相比有极显著差异，表明枯草芽孢杆菌Y-6抗菌物质具有一定的抗氧化活性，可有效抑制鱼丸中脂质的氧化。2. 1. 3抗菌物质添加浓度对TVB-N值的影响TVB-N值反映水产品中的蛋白质在酶和细菌的作用下，发生分解而产生氨和胺等碱性含氮物的情况，是国标中用于评价肉质鲜度的唯一理化指标，其值越低，鱼丸的新鲜度越高。由图3可知，随着贮藏时间的延长，TVB-N值不断增大。到第16天，空白对照组的 TVB-N值已达到3. 23mg/100g，且出现发粘变质现象。而其它添加了不同浓度抗菌物质以及 nisin的样品组其TVB-N含量均低于3. 0mg/100g。多重比较表明，抗菌物质添加浓度分别为ang/g(p < 0. 05)和;3mg/g(p < 0. 05) 的样品组其TVB-N值与空白组相比有显著性差异，但与nisin样品组相比无显著性变化，表明所制备的抗菌物质能够有效控制TVB-N值，达到保鲜目的。2. 1. 4抗菌物质添加浓度对硬度、弹性和咀嚼性的影响鱼丸制品的弹性是赋予制品独特口感的重要特征，不仅在食味上，而且对制品的外观、贮藏性也有较大的影响，硬度太低或太高都不利于鱼丸的弹性。如图4、5所示，添加抗菌物质的鱼丸与空白组相比硬度(P < 0. 01)和弹性(ρ < 0. 01)都有显著性差异。在贮藏过程中，随着贮藏时间的延长，鱼丸的硬度逐渐增加，弹性逐渐减弱。这可能是因为鱼丸蛋白质发生变性失水，造成由肌动球蛋白溶胶凝固形成的网状结构聚集，从而导致鱼丸硬度上升弹性下降。而添加抗菌物质的鱼丸在硬度和弹性方面均优于空白对照组，这可能是因为抗菌物质主要为多肽类分子，能够与蛋白质络合使其网状结构相对稳定。添加抗菌物质的鱼丸贮藏过程中咀嚼性的变化如图6所示，处理组与照组相比咀嚼性没有显著差别(P > 0. 05)，说明添加的抗菌物质对鱼丸的咀嚼性没有太大影响。2. 1. 5品质变化指标的相关性分析对添加不同抗菌物质含量鱼丸的菌落数、TBA、TVB-N、硬度、弹性和咀嚼性的变化与贮藏时间进行相关性分析，结果见表1。由表1可以看出，菌落数、TBA值和TVB-N值与贮藏时间存在良好的正相关性(r > 0. 9)，弹性与鱼丸成一定程度的负相关。菌落数与各指标的相关性分析如表2所示，所有样品的菌落数与TBA和TVB-N值均具有很好的正相关性，随着贮藏时间的延长，菌落总数的增加，TBA和TVB-N值也迅速增加。微生物的生长会促进鱼丸的氧化酸败，抗菌物质的添加可有效抑制微生物的生长，降低微生物降解蛋白质等营养成分的速率，延缓挥发性盐基氮值的增大，另外抗菌物质主要为多肽类物质，可能本身也具有的抗氧化活性，也在一定程度上抑制了鱼丸的氧化酸败，所以，对于添加了不同浓度抗菌物质的样品其菌落数均与TVB-N值和TBA值有良好的正相关。表1贮藏时间与菌落数、TBA、TVB-N、硬度、弹性和咀嚼性的相关性分析
抗菌物质添加浓度(mg/mL)
空白0.501.02.03.0茼落数0.9542a0.9339a0.9477a0.9716b0.9560aTBA0.9277a0.9790b0.9270a0.9150b0.9500aTVB-N0.9860a0.9660b0.9860b0.9870b0.9861b硬度0.81550.54080.0615-0.37950.6887弹性-0.8654-0.8721-0.9425a-0.9186a-0.9661b咀嚼性0.81850.79770.36350.023-0.6875上表中a、b 分别表示 P < 0. 05、P < 0. 01表2菌落数与TBA、TVB-N、硬度、弹性和咀嚼性的相关性分析
抗菌物质添加浓度(mg/mL)
空白0.501.02.03.0
TBA0.9325a0.9790b0.9051a0.9750b0.9996bTVB-N0.945a0.9667b0.9158a0.9865b0.9675b硬度0.9281a0.53930.0124-0.52630.8409弹性-0.9406a-0.6685-0.8379-0.8465-0.8516咀嚼性0.63370.9017a0.59410.1202-0.7448上表中 a、b 分别表示 P < 0. 05、P < 0. 01
2. 2抗菌物质的HPLC分析 由抗菌物质的HPLC分析可知(见图7)，其包含多种组分，色谱峰主要集中在 30-40min、47-55min和57-60min三个区域，说明抗菌物质中可能存在三大类性质相似的抗菌物质。有研究报道枯草芽孢杆菌的某些菌株只能产生surfactin (表面活性素)，而有些菌株却能同时产生surfactin，fengycin和iturin(伊枯草菌素)或surfactin， bacillomycin (脂肽抗生素)和plipastatin。而且，即使同一种菌株产生的同一种抗菌脂肽也不是纯的单一化合物，而是由几个或许多结构类似的同系物组成，还有研究显示枯草芽孢杆菌还能产生一些多烯类物质及其多肽类物质，具有很好的抗细菌活性。本发明研究小组在前期研究中发现枯草芽孢杆菌Y-6产生的抗菌物质对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌都具有出色的抑制能力。因此，结合各种抗菌物质的抑菌特性及有关文献，可以推测枯草芽孢杆菌Y-6能够产生多种不同分子量，不同结构类型的抗菌物质，对细菌和真菌都具有较好的抑制作用，但有关其主要抗菌物质的结构、构效关系以及相关机制等还有待于进一步深入探讨。3 结论化学防腐剂安全隐患的存在以及食品安全意识的提高，致使人们对不含化学防腐剂的天然、绿色食品的需求日益增大，开发高效安全的天然防腐剂对我国食品工业的发展具有重大意义。本发明研究结果表明，在鱼丸中添加枯草芽孢杆菌Y-6产生的抗菌物质能够显著的抑制微生物的生长，延长鱼丸的保质期。当鱼丸中抗菌物质的添加浓度为2mg/g 时，其保鲜效果最佳，可使菌落数降级1. 23个数量级，TBA值和TVB-N值与对照组相比上升缓慢，鱼丸的质构特性也没有显著的变化，且与nisin的保鲜效果相当。因此，抗枯草芽孢杆菌Y-6产生的抗菌物质作为一种天然防腐剂具有很好的开发价值。二、以下结合实施例说明将本发明实施例生物防腐剂结合脉冲强光杀菌用于食品防腐保鲜的方法实施例1 选用淡水鱼或海鱼为主料，剁碎鱼肉，加适量食盐，淀粉，砂糖，味精，水等，捣成鱼泥后，添加鱼肉质量分数为0.2%的枯草芽孢杆菌Y-6产生物防腐剂，搅勻后挤成小圆球， 入沸汤煮熟成型，冷却后用PE保鲜袋包装成品鱼丸，经脉冲强光处理30s (频率1次/4s ；紫外区能量占总能量约观％，其中UV-C波段(220-280nm)ll%, UV-B波段(280-320nm) 9% , UV-A波段(320-400歷)7%，单次脉冲强度为450mj/cn^)后置于4°C温度下进行贮藏，采用此方法，鱼丸的保质期达3周以上。实施例2 选用淡水鱼或海鱼为主料，剁碎鱼肉，加适量食盐，淀粉，砂糖，味精，水等，捣成鱼泥后，添加鱼肉质量分数为0.3%的枯草芽孢杆菌Y-6产生物防腐剂，搅勻后挤成小圆球， 入沸汤煮熟成型，冷却后用PE保鲜袋包装成品鱼丸，经辐照处理2如频率1次/4s ；紫外区能量占总能量约，其中UV-C波段Q20-280nm) 11%, UV-B波段O80_320nm)9%，UV-A 波段(320-400歷)7%，单次脉冲强度为450mj/cn^)后置于4°C温度下进行贮藏，采用此方法，鱼丸的保质期在为3周以上。


本发明公开了一种生物防腐剂及将该生物防腐剂用于食品防腐保鲜的方法。生物防腐剂是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y-6(保藏编号为CGMCC No.5451)分泌表达的抗菌物质。其用于食品防腐保鲜时，生物防腐剂的添加量为生鲜食品质量的0.05～0.5％，还可以结合脉冲强光对包装后的食品进行杀菌处理。本发明的生物防腐剂能够显著的抑制微生物的生长，延长鱼丸等糜类食品的保质期，可使菌落数降低1.23个数量级，TBA值和TVB-N值与对照组相比上升缓慢，鱼丸的质构特性也没有显著的变化，且与乳酸链菌肽的保鲜效果相当。