专利名称：具有长时间作用的胰高血糖素样肽－1类似物的制作方法口服摄取食物会引发胰岛素和胰岛素量调节激素以相互协调的方式分泌，通过增加肝脏、肌肉和脂肪组织对葡萄糖和游离脂肪酸的摄取和减少肝脏的糖原异生作用来控制血糖水平。胰岛素的分泌由肠内分泌细胞产生的促分泌激素(即肠促胰岛素)调节。葡萄糖依赖型促胰岛素肽(GIP)和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)可以表现出几乎所有的肠促胰岛素作用。与GIP不同，GLP-1对于糖尿病患者也是有效的。因此，使用GLP-1及其类似物来治疗糖尿病引起了许多人的兴趣[关于GLP-1生理学的详细讨论见综述1]Kieffer TJ and Habener JF.，1999，Endocrine reviews，20(6)，876-913；2]Doyle ME and Egan JM.，2001，Recent Prog.Horm.Res.，56377-99；3]Holst JJ.1999，Trends Endocrinol.Metab.，10(6)，229-235；4)Perfetti R and MerkelP.，2000.，Eur.J.Endocrinol.，143717-725；5)Nauck MA.，1997，Cur.Opin.Endocrinol.Diabet.，4291-299；6)Gutniak MK.，1997，Intl.Diabet.Monitor.，9(2)1-12；7)Drucker DJ.，2001，Endocrinol.，142(2)521-527]。GLP-1是来源于具有160个氨基酸的激素原-胰高血糖素原的具有30个氨基酸的肽。在胰和肠中不同激素原转化酶的作用导致胰高血糖素和其他不确定肽的产生，而胰高血糖素原的切割产生GLP-1和GLP-2，还有两种其它的肽。在所有目前已研究的哺乳动物中，GLP-1的氨基酸序列是100％同源的，这意味着它具有关键性的生理作用。GLP-1(7-37)OH的C-末端被截短并被酰胺化以形成GLP-1(7-36)NH2。游离酸GLP-1(7-37)OH和酰胺GLP-1(7-36)NH2的生物效应和代谢更新是没有区别的。按照惯例，氨基酸的编号基于从胰高血糖素原肽加工的GLP-1(1-37)OH。有生物活性的GLP-1是进一步加工GLP-1(7-36)NH2而得到的结果。因此GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)NH2的第一个氨基酸是His7。在胃肠道中，GLP-1由肠、结肠和直肠粘膜的L-细胞对管腔内葡萄糖的刺激发生应答而产生的。活性GLP-1的血浆半衰期＜5分钟，其代谢清除率约是12-13分钟(Holst JJ.，1994，Gastroenterology，1071848-1855)。参与GLP-1代谢的主要蛋白酶是二肽基肽酶(DPP)IV(CD26)，其可以切割N-端His-Ala二肽而产生代谢产物GLP-1(9-37)OH或GLP-1(9-36)NH2，上述产物被不同的观点认为是GLP-1受体的灭活的、弱的激动剂或拮抗剂。GLP-1受体(GLP-1R)是具有463个氨基酸的G蛋白偶联受体，集中于胰脏的β细胞和肺中，而在脑、脂肪组织和肾中的含量较少。GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)NH2对GLP-1R的刺激作用导致腺苷酸环化酶活化、cAMP合成、膜去极化、细胞内钙升高和葡萄糖诱导的胰岛素分泌增加(Holz GGet al.，1995，J.Biol.Chem.，27017749-57)。GLP-1是最有效的胰岛素促分泌素，是由肠粘膜对食物摄取产生应答而分泌的。人体中免疫反性GLP-1的空腹水平是5-10pmol/L，在进食后上升到25pmol/L(Perfetti R and Merkel P，2000见上)。GLP-1R敲除小鼠是葡萄糖非耐受的这一事实着重说明了GLP-1复杂的肠促胰岛素作用(Scrocchi LA et al.，1996，Nat.Med.21254-1258)。在糖尿病患者中静脉输注GLP-1会产生肠促胰岛素反应，虽然这些患者中对口服葡萄糖的肠促胰岛素反应减弱。通过输注或皮下注射施用GLP-1不仅可以控制糖尿病患者的空腹葡萄糖水平，而且也能维持胰岛素分泌的葡萄糖阈值(Gutniak M et al.，1992，New Engl.J.Med.，3261316-1322；Nauck MA et al.，1986，Diabetologia，2946-52；Nauck MA et al.，1993，同前．36741-744)。因此GLP-1显示出了其可以作为以生理方式增加胰岛素分泌、同时避免与磺酰脲类药物相关的低血糖症的可能治疗剂的巨大潜力。GLP-1对于葡萄糖稳态的其他重要机理是抑制胰高血糖素分泌和抑制胃动力(Tolessa T et al.，1998，J.Clin.Invest.，102764-774)。通过减少糖原异生和糖原分解，GLP-1对于胰脏α细胞的抑制作用可以导致肝葡萄糖生成减少(D′Alessio D et al.，1997，Diabetes，46(Suppl.1)29A)。在糖尿病患者中，保持着GLP-1的抗胰高血糖素作用。所谓的GLP-1回肠制动效应，是由迷走神经的传出受体或由肠内平滑肌的直接作用产生的，在该效应中胃动力和胃液分泌被抑制。GLP-1导致的胃酸分泌减少促成了养分利用的停滞期，因此避免了对快速胰岛素反应的需求。总之，GLP-1的胃肠效应明显有助于延迟葡萄糖和脂肪酸吸收，调节胰岛素分泌和葡萄糖稳态。GLP-1也表明能诱导β细胞特异性基因，例如GLUT-1转运蛋白、胰岛素受体(经PDX-1和胰岛素启动子的相互作用)和己糖激酶-1。因此，GLP-1具有逆转通常与衰老相关的葡萄糖不耐性的潜力，如啮齿动物实验所示(Perfetti R.and MerkelP.，2000，见上文)。另外，GLP-1也有助于β细胞的新生和β细胞群的增加，以及β细胞功能的恢复(Wang Y.et al.，1997，J.Clin.Invest.，992883-2889；Xu G.et al.，1999，Diabetes，482270-2276)。GLP-1的中心效应包括在减少食物摄取后增加饱足感，该效应是通过下丘脑GLP-1的作用完成的。在II型糖尿病患者中连续皮下输注GLP-148小时可以减少饥饿感和食物摄取，并增加饱足感(Toft-Nielsen MB.et al.，1999，Diabetes Care，221137-1143)。这些厌食效应在GLP-1敲除小鼠中是没有的(Scrocchi LA.et al.，1996见上文)。
GLP-1的药代动力学和药效学(静脉注射肽在血清中的半衰期是约2-3分钟[Vilsboll T.et al.，2003，J.Clin.Endocrinol.Med.，88220])以及低血糖作用的持续时间(2-3小时[Nauck MA.et al.，1996，Diabetologia，391546；Todd JF.et al.，1998，Clin.Sci.95325])都清楚地显示出，其每日一次或每日两次给药不能足够满足较严重的糖尿病患者需要在全天控制血糖生成的需求。
国际申请WO99/43706公开了一种GLP-1类似物，其在至少一个赖氨酸残基上具有亲脂取代基，使得肽与白蛋白结合以延长体内作用。没有描述未在赖氨酸残基上修饰的GLP-1类似物具有更长时间的作用。
国际申请WO 01/98331公开了在下列一个或多个位置有修饰的GLP-1类似物11、12、16、22、23、24、25、27、30、33、34、35、36和37。如其所述，与GLP-1(7-37)OH相比，这些类似物的聚集倾向显著降低。
国际申请WO 03/18516公开了在下列一个或多个位置有修饰的GLP-1类似物7、8、12、16、18、19、20、22、25、27、30、33及37。如其所述，这些类似物具有增强的功效，有利于使用与有限生物利用度相关的递送技术。
因此，仍然需要开发有效的GLP-1类似物，其不仅显示DPPIV抗性，而且其具有更长的药理学作用时间。
本发明正是试图满足上述这些及其他的需求。
本发明引用大量的文献，在此将它们全部引入本文作为参考。


本发明涉及具有更高的生物学效能和延长的药理学活性的新型GLP-1类似物。在一个实施方案中，本发明涉及在下列一个或多个位置具有氨基酸取代的GLP-1类似物(长度为28或29个氨基酸)8、20、27、30和33。
在一个实施方案中，本发明涉及包含如下序列的GLP-1类似物R1-His-X8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-X20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-X27-Phe-Ile-X30-Trp-Leu-X33其中R1选自氢、线性或支化的不饱和C1-C6酰基、任选取代的芳基羰基、任选取代的环烷基羰基和任选取代的芳基烷基羰基；在本发明的一个实施方案中，R1是氢、2-羟基苯甲酰基或反式-3-己烯酰基；X8选自Ala、Aib、Val和Gly；
X20选自Leu和Gly，Gly具有C6-C20烷基侧链；在本发明的一个实施方案中，X20是S-辛基甘氨酸；X27选自Ala、Leu、Val、Ile和Glu；X30选自Glu、Asp、Asn、Gln和Ala；并且X33选自Lys-Asn-Aib-OH、Lys-Asn-Aib-NH2、Val-Lys-Asn-OH、Val-Lys-Asn-NH2、Lys-Asn-OH、Lys-Asn-NH2、Val-Lys-Gly-Arg-NH2、Val-Lys-Aib-Arg-OH、Val-Lys-Aib-Arg-NH2、Lys-Asn-Gly-OH和Lys-Asn-Gly-NH2，前提是该序列不是His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg。
在一个实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和谷氨酸(Glu)的氨基酸；在8位具有选自丙氨酸(Ala)、氨基异丁酸(Aib)、缬氨酸(Val)和甘氨酸(Gly)的氨基酸；在30位具有选自谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)和丙氨酸(Ala)的氨基酸；和C-端氨基酸序列缬氨酸33-赖氨酸34-天冬酰胺35-NH2。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其具有选自氢和2-羟基苯甲酰基的R1；在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和谷氨酸(Glu)的氨基酸；在8位具有选自丙氨酸(Ala)、氨基异丁酸(Aib)、缬氨酸(Val)和甘氨酸(Gly)的氨基酸；在30位具有选自谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、丙氨酸(Ala)、天冬酰胺(Asn)和天冬氨酸(Asp)的氨基酸；和C-端氨基酸序列缬氨酸33-赖氨酸34-天冬酰胺35-NH2。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其具有选自2-羟基苯甲酰基和反式-3-己烯酰基的R1；在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和谷氨酸(Glu)的氨基酸；在30位具有选自谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、丙氨酸(Ala)、谷氨酰胺(Gln)和天冬酰胺(Asn)的氨基酸；和C-端氨基酸序列赖氨酸33-天冬酰胺34-NH2。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其具有选自2-羟基苯甲酰基和反式-3-己烯酰基的R1；在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、谷氨酸(Glu)和异亮氨酸(Ile)的氨基酸；在30位具有选自谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)和丙氨酸(Ala)的氨基酸；和C-端氨基酸序列赖氨酸33-天冬酰胺34-氨基异丁酸35-NH2。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其具有选自氢、2-羟基苯甲酰基和反式-3-己烯酰基的R1；在8位具有选自氨基异丁酸(Aib)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)和甘氨酸(Gly)的氨基酸；在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、谷氨酸(Glu)和异亮氨酸(Ile)的氨基酸；在30位具有选自谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和丙氨酸(Ala)的氨基酸；和C-端氨基酸序列赖氨酸33-天冬酰胺34-氨基异丁酸35-NH2。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其具有选自氢和反式-3-己烯酰基的R1；在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和谷氨酸(Glu)的氨基酸；在8位具有选自氨基异丁酸(Aib)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)和甘氨酸(Gly)的氨基酸；在30位具有选自谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)和丙氨酸(Ala)的氨基酸；和C-端氨基酸序列赖氨酸33-天冬酰胺34-NH2。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其在20位具有选自亮氨酸(Leu)和包含C6-C20烷基侧链的甘氨酸(Gly)的氨基酸，在本发明的一个实施方案中该烷基侧链是辛基链；在8位具有选自丙氨酸(Ala)、氨基异丁酸(Aib)、缬氨酸(Val)和甘氨酸(Gly)的氨基酸；和C-端氨基酸序列缬氨酸33-赖氨酸34-天冬酰胺35-NH2。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其在20位具有选自亮氨酸(Leu)和包含C6-C20烷基侧链的甘氨酸(Gly)的氨基酸，在本发明的一个实施方案中该烷基侧链是辛基链；在8位具有选自丙氨酸(Ala)、氨基异丁酸(Aib)、缬氨酸(Val)和甘氨酸(Gly)的氨基酸；和C-端氨基酸序列赖氨酸33-天冬酰胺34-NH2。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其在20位具有选自亮氨酸(Leu)和包含C6-C20烷基侧链的甘氨酸(Gly)的氨基酸，在本发明的一个实施方案中该烷基侧链是辛基链；在8位具有选自丙氨酸(Ala)、氨基异丁酸(Aib)、缬氨酸(Val)和甘氨酸(Gly)的氨基酸；在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和谷氨酸(Glu)的氨基酸；和C-端氨基酸序列缬氨酸33-赖氨酸34-天冬酰胺35-NH2。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其在20位具有选自亮氨酸(Leu)和包含C6-C20烷基侧链的甘氨酸(Gly)的氨基酸，在本发明的一个实施方案中该烷基侧链是辛基链；在8位具有选自丙氨酸(Ala)、氨基异丁酸(Aib)、缬氨酸(Val)和甘氨酸(Gly)的氨基酸；在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和谷氨酸(Glu)的氨基酸；和C-端氨基酸序列赖氨酸33-天冬酰胺34-NH2。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其在20位具有选自亮氨酸(Leu)和包含C6-C20烷基侧链的甘氨酸(Gly)的氨基酸，在本发明的一个实施方案中该烷基侧链是辛基链；在8位具有选自丙氨酸(Ala)、氨基异丁酸(Aib)、缬氨酸(Val)和甘氨酸(Gly)的氨基酸；在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和谷氨酸(Glu)的氨基酸；在30位具有选自谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酰胺(Gln)和丙氨酸(Ala)的氨基酸；和C-端氨基酸序列缬氨酸33-赖氨酸34-天冬酰胺35-NH2。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其在20位具有选自亮氨酸(Leu)和包含C6-C20烷基侧链的甘氨酸(Gly)的氨基酸，在本发明的一个实施方案中该烷基侧链是辛基链；在8位具有选自丙氨酸(Ala)、氨基异丁酸(Aib)、缬氨酸(Val)和甘氨酸(Gly)的氨基酸；在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和谷氨酸(Glu)的氨基酸；在30位具有选自谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、丙氨酸(Ala)和谷氨酰胺(Gln)的氨基酸；和C-端氨基酸序列赖氨酸33-天冬酰胺34-NH2。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其在20位具有选自亮氨酸(Leu)和包含C6-C20烷基侧链的甘氨酸(Gly)的氨基酸，在本发明的一个实施方案中该烷基侧链是辛基链；在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和谷氨酸(Glu)的氨基酸；在30位具有选自谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、丙氨酸(Ala)和谷氨酰胺(Gln)的氨基酸；其中R1是反式-3-己烯酰基；和C-端氨基酸序列赖氨酸33-天冬酰胺34-NH2。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其中R1选自氢、2-羟基苯甲酰基和反式-3-己烯酰基；在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和谷氨酸(Glu)的氨基酸；在8位具有选自氨基异丁酸(Aib)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)和甘氨酸(Gly)的氨基酸；在30位具有选自谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)和丙氨酸(Ala)的氨基酸；和C-端氨基酸序列赖氨酸33-天冬酰胺34-甘氨酸35-NH2。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其具有选自2-羟基苯甲酰基和反式-3-己烯酰基的R1；在20位具有选自亮氨酸(Leu)和包含C6-C20烷基侧链的甘氨酸(Gly)的氨基酸，在本发明的一个实施方案中该烷基侧链是辛基链；和C-端氨基酸序列缬氨酸33-赖氨酸34-氨基异丁酸35-精氨酸36-NH2。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其在20位具有选自亮氨酸(Leu)和包含C6-C20烷基侧链的甘氨酸(Gly)的氨基酸，在本发明的一个实施方案中该烷基侧链是辛基链；在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和谷氨酸(Glu)的氨基酸；在30位具有选自谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、丙氨酸(Ala)和谷氨酰胺(Gln)的氨基酸；其中R1是反式-3-己烯酰基；和C-端氨基酸序列赖氨酸33-天冬酰胺34-NH2。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Ala-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO1)在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物2-羟基苯甲酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO2)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物2-羟基苯甲酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Ala-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Aib-NH2(SEQ.ID NO3)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Th r-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Ala-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO4)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-[(S)-辛基甘氨酸]-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Ala-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO5)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物反式-3-己烯酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO6)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物反式-3-己烯酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-[(S)-辛基甘氨酸]-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Ala-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO7)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物
反式-3-己烯酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO8)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物反式-3-己烯酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Ala-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO9)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物，反式-3-己烯酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Ala-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO10)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物反式-3-己烯酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-[(S)-辛基甘氨酸]-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Ala-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO11)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-[(S)-辛基甘氨酸]-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO12)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-[(S)-辛基甘氨酸]-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO13)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物反式-3-己烯酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-[(S)-辛基甘氨酸]-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID No14)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物反式-3-己烯酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-[(S)-辛基甘氨酸]-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg-NH2(SEQ.ID No15)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物2-羟基苯甲酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-NH2(SEQ.ID NO16)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO17)在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO18)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物反式-3-己烯酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-[(S)-辛基甘氨酸]-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO19)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物反式-3-己烯酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-[(S)-辛基甘氨酸]-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO20)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-[(S)-辛烷基甘氨酸]-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO21)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-[(S)-辛基甘氨酸]-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Ala-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-NH2(SEQ.IDNO22)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-[(R)-十八烷基甘氨酸]-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO23)。
本发明也涉及一种组合物，其包含治疗有效量的本文所述肽或者其药学上可接受的盐，与选自药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂的至少一种组分。在一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含治疗有效量的本文所述肽或者其药学上可接受的盐，其中所述治疗有效量为约1mcg-约10mg。
本发明也涉及一种组合物，其包含预防有效量的本文所述肽或者其药学上可接受的盐，与选自药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂的至少一种组分。
本发明还涉及一种治疗与葡萄糖代谢紊乱相关的疾病或病症的方法。此外，本发明涉及一种防止(即预防)与葡萄糖代谢紊乱相关的疾病或病症的方法。葡萄糖紊乱的非限制性的例子包括I型或II型糖尿病、胰岛素抵抗及并发的体重疾病和病症或病况。体重疾病或相关病症的非限制性的例子包括肥胖、与超重并发的病况、饱足感异常、血浆胰岛素水平下降、血糖水平升高和胰脏β细胞群减少。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗I型或II型糖尿病的方法，包括向需要这种治疗的患者施用治疗有效量的本文所述肽，或者其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗胰岛素抵抗的方法，包括向需要这种治疗的患者施用治疗有效量的本文所述肽，或者其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，本发明涉及一种减轻患者体重的方法，包括向需要减轻体重的患者施用有效量的本文所述肽，或者其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，本发明涉及一种降低患者饱足感的方法，包括向需要的患者施用治疗有效量的本文所述肽，或者其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，本发明涉及一种升高患者进食后血浆胰岛素水平的方法，包括向需要的患者施用治疗有效量的本文所述肽，或者其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，本发明涉及一种降低患者空腹血糖水平的方法，包括向需要的患者施用治疗有效量的本文所述肽，或者其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，本发明涉及一种增加患者胰脏β细胞群的方法，包括向需要的患者施用治疗有效量的本文所述肽，或者其药学上可接受的盐。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及施用本文所述肽或者其药学上可接受的盐的方法。施用所述肽或者其药学上可接受的盐的方法的非限制性的例子包括皮下给药、静脉给药、透皮给药、口服、经口腔和鼻内给药。
本发明还涉及GLP-1类似物或者其药学上可接受的盐用于治疗或预防与葡萄糖代谢相关的疾病或病症的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐用于治疗患者I型或II型糖尿病的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐用于治疗患者胰岛素抵抗的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐用于减轻患者体重的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐用于降低患者饱足感的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐用于升高患者进食后血浆胰岛素水平的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐用于降低患者空腹血糖水平的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐用于增加患者胰脏β细胞群的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐在制备用于治疗患者I型或II型糖尿病的药物中的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐在制备用于治疗患者胰岛素抵抗的药物中的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐在制备用于减轻患者体重的药物中的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐在制备用于增加患者饱足感的药物中的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐在制备用于升高患者进食后血浆胰岛素水平的药物中的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐在制备用于降低患者空腹血糖水平的药物中的用途。
在另一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐在制备用于增加患者胰脏β细胞群的药物中的用途。
通过下文给出的详细描述，进一步的范围和可应用性将会变得显而易见。然而应当明白，下文的详述，当指出本发明的优选实施方案时仅仅是用于解释说明，因此在本发明的实质和范围内进行各种改变和修饰对于本领域技术人员将是显而易见的。


上文对本发明进行了一般性的描述，下面将参照附图来说明本发明的优选方案，其中图1显示的是禁食过夜并喂食30分钟的CD-1小鼠的血糖水平。将不同的肽，其中包括本发明的肽(400μg/kg)在30分钟时皮下给药，并在接下来的6个小时里测定血糖水平。数据用平均值±SEM值表示；图2显示的是Sprague-Dawley大鼠以15mM施用促血糖升高药后的血糖水平。将不同的肽，其中包括本发明的肽(100μg/kg)皮下给药。横坐标上显示出了血糖水平(Δ葡萄糖mM)的改变。数据用平均值±SEM表示；
图3显示的是由本发明的GLP-1类似物对125I-GLP-1(7-36)NH2的替换百分比。用对放射性标记肽结合的半数最大抑制作用来确定IC50；图4显示的是对CD-1小鼠进食后血糖水平的影响。将动物禁食过夜，然后喂食30分钟。该动物在喂食后立即皮下注射载体(20mM乙酸)、GLP-1类似物(400μg/kg)和Exendin-4TM(40μg/kg)。进食后6小时葡萄糖水平的AUC用棒条表示(平均值±SEM；n＝动物数，如棒条上方的数字所示)。经测定，空腹葡萄糖水平平均为4.11±0.07mmol/L(n＝189)，对应于空腹AUC 1615±29.7mmol/L/6h，从所有数据中减去该值，所得剩余的就是进食后葡萄糖水平。通过ANOVA分析，*P＜0.05vs载体；图5、6、7和8显示的是所选择的类似物对CD-1小鼠进食后葡萄糖水平的影响(剂量应答)。将动物禁食过夜，然后喂食30分钟。该动物在喂食后立即皮下注射载体(20mM乙酸)或不同剂量的GLP-1类似物(剂量应答从40-400μg/kg)。在注射后的6个小时里测定血糖水平(平均值±SEM；上面的图)。6个小时的葡萄糖AUC用棒条表示(平均值±SEM；下面的图；n是动物的数目，如下面图中棒条上方的数字所示)；图9和10显示的是对施用了固定(clamped)葡萄糖(15mmol/L)的Sprague-Dawley大鼠中血糖清除率的评价。实验前将Sprague-Dawley大鼠在12∶12的明∶暗周期下饲养并禁食12小时(过夜)。在给动物输注葡萄糖后开始的90分钟获得Δ葡萄糖值，当血糖水平达到平稳的水平时，在该时间点给动物皮下注射载体、GLP-1或GLP-1类似物(GLP-1、TH0384和TH0385的剂量为300μg/kg；TH0395、TH0396、TH0424和TH0426的剂量为100μg/kg)。数据用平均值±SEM表示；n是动物的数目，如下面图中棒条上方的数字所示。
图11显示的是注射链脲霉素的CD-1小鼠中促血糖增高曲线的形成。在试验期间随意喂食该CD-1小鼠，将其在12∶12的明∶暗周期下饲养，并监测总共50小时。将链脲霉素(400μg/kg)施用于两组动物，允许其某些时间重叠，并尽可能完整地给出葡萄糖谱。用便携式血糖测定仪测定血糖，评价糖尿病模型中高血糖的时间依赖性情况(平均值±SEM；每个时间点n＝8)。
图12、13和14显示的是GLP-1类似物对喂食STZ-诱导的糖尿病CD-1小鼠中葡萄糖谱的影响；图12(2小时)和图13、14(6小时)。用链脲霉素处理CD-1小鼠，24小时后(血糖大于20mmol/L)用类似物处理，并允许动物在实验期间(2和6小时)随意进食。在10:00am，向该动物皮下注射载体或GLP-1类似物。在注射后2和6小时内测定血糖水平(平均值±SEM；上面的图)。2或6小时内的葡萄糖AUC用棒条表示(平均值±SEM；下面的图；n是动物数，如下面图中棒条上方的数字所示)；图15显示的是GLP-1类似物对喂食STZ-诱导的糖尿病CD-1小鼠中葡萄糖谱的影响；图15(12小时)。为评价所选择类似物效应的持续时间，用链脲霉素处理CD-1小鼠并在24小时后(血糖大于20mmol/L)用类似物处理，允许动物在实验期间(12小时)随意进食。在上午10:00，向该动物皮下注射载体或GLP-1类似物。在注射后12小时测定血糖水平(平均值±SEM；上面的图)。12小时内的葡萄糖AUC是减去正常小鼠的喂食葡萄糖AUC后的(平均值±SEM；下面的图；n是动物数，如下面图中棒条上方的数字所示)；图16显示的是喂食STZ-诱导的糖尿病CD-1小鼠中在12小时的时间点上TH0396和Exendin-4TM的比较。为了比较TH0396和Exendin-4TM的效应持续时间，用剂量依赖性方式分析在观测最后一小时的葡萄糖水平。用链脲霉素处理CD-1小鼠并在24小时后(血糖大于20mmol/L)用TH0396(40、80和400μg/kg)或Exendin-4TM(40和80μg/kg)处理，并允许动物在实验期间(12小时)随意进食。在上午10:00，向该动物皮下注射药剂。在注射后12小时测定血糖水平(平均值±SEM；上面的图)。11和12小时内的平均葡萄糖水平是减去正常小鼠的喂食葡萄糖水平后的(n是动物数，如下面图中棒条上方的数字所示)；图17显示的是STZ-诱导的糖尿病CD-1小鼠中不同GLP-1类似物的影响。按400μg/kg的剂量皮下注射所述肽；n＝3或6，如棒条上方数字所示；数据用平均值±SEM表示。
图18显示的是不同GLP-1类似物对CD-1小鼠中进食后血糖水平的影响。按400μg/kg的剂量皮下注射所述肽；n＝4-8，如棒条上方数字所示；数据用平均值±SEM表示。
通过阅读下文对参考非限制性的优选实施方案的描述和示例性的附图，本发明的其他目的、优点和特征将会变得更加显而易见，同时下述描述不应视为对本发明的范围进行限定。

在本说明书的全文中使用下列缩写DMFN，N-二甲基甲酰胺；DIEA二异丙基乙胺；TFA三氯乙酸；BOP六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧-三(二甲氨基)磷；MALDI-TOF基质辅助的激光解析/电离质谱；HPLC高效液相色谱；BHA二苯甲基胺树脂；Boc叔丁氧羰基；Aib氨基异丁酸；Pbf2，2，4，6，7-戊甲基二羟苯并呋喃-5-磺酰；AUC曲线下面积；Nle正亮氨酸。
本文所用的“芳基”是指包含6-10个碳原子的芳香碳环基团或取代芳香碳环基团。其非限制性的例子是苯基或萘基。其取代基的非限制性的例子是C1-C6；直链或支链烷基例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、戊基、己基；和烯基、羟基、烷氧基、氨基、卤素。
本文所用的“烷基”是指直链或支链的C1-C6脂肪族烃基。其取代基的非限制性的例子是C1-C6；直链或支链烷基例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、戊基、己基；和烯基、羟基、烷氧基、氨基、卤素。
本文所用的“不饱和酰基”是指烯基羰基，其中烯基是指包含碳-碳双键或三键并在线性链上有2-5个碳原子的烷基。其非限制性的例子包括反式-3-己烯酰基。
本文所用的“芳烷基”是指其所包含的氢被芳基取代后的烷基。其非限制性的例子包括苯甲基和3-苯丙基。
本文所用的“环烷基”是指包含3-10个碳原子的非芳香族环。其非限制性的例子是环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基和环癸基，这些环烷基可以是部分不饱和的。
本文所用的术语“载体”、“稀释剂”、“赋形剂”和“药学上可接受的盐”如下列参考手册中所定义″Handbook of Pharmaceutical Excipients″，第三版，Arthur H.Kibbe，American Pharmaceutical Association，Pharmaceutical Press，2000。
到目前为止还不可能使GLP-1(7-36)在没有非共价或共价结合到白蛋白上时具有延长的药理活性。如本文所述，我们发现在8、20、27、30或33位的一个或多个位置有氨基酸取代和任选的N-末端取代基R1的较短的GLP-1类似物(长度为28或29个氨基酸)提供了GLP-1(7-34)和GLP-1(7-35)衍生物，其在体内具有延长的药理活性(6小时)。制备该较短的GLP-1类似物(长度为28或29个氨基酸)的方法包括将天然的GLP-1(7-36)酰胺截短并进行氨基酸置换。在8、20、27、30或33位的一个或多个位置进行了修饰的GLP-1类似物适于对糖尿病患者每日一次或每日两次给药。
本发明涉及全新的GLP-1类似物，包括在8、20、27、30或33位的一个或多个位置有氨基酸取代基和任选的N-末端取代基R1。
本发明涉及具有改善的生物效能和对血糖水平具有更长作用时间的新型GLP-1类似物。此外，本发明涉及不仅显示DPPIV抗性、而且与Exendin-4TM相比具有延长的药理学作用的新型GLP-1类似物。
所述氨基酸用常用的三个字母缩写来表示，参见下面的表1，其在肽领域是被广泛接受的，并由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐。
表1氨基酸代码

按照惯例，活性GLP-1的第一个氨基酸(His)定为7位，依次类推。
此处的术语“患者”应该理解为包括任何的哺乳动物。在本发明的一个实施方案中，所述的患者是人。
在一个实施方案中，本发明涉及包含如下序列的GLP-1类似物R1-His-X8-Glu-Gly-Th r-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-X20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-X27-Phe-Ile-X30-Trp-Leu-X33其中R1选自氢、线性或支化的不饱和C1-C6酰基、任选取代的芳基羰基、任选取代的环烷基羰基和任选取代的芳基烷基羰基；在本发明的一个实施方案中，R1是氢、2-羟基苯甲酰基或反式-3-己烯酰基；X8选自Ala、Aib、Val和Gly；X20选自Leu和Gly，Gly具有C6-C20烷基侧链；在本发明的一个实施方案中，X20优选是S-辛基甘氨酸；X27选自Ala、Leu、Val、Ile和Glu；
X30选自Glu、Asp、Asn、Gln和Ala；并且X33选自Lys-Asn-Aib-OH、Lys-Asn-Aib-NH2、Val-Lys-Asn-OH、Val-Lys-Asn-NH2、Lys-Asn-OH、Lys-Asn-NH2和Val-Lys-Gly-Arg-NH2、Val-Lys-Aib-Arg-OH、Val-Lys-Aib-Arg-NH2、Lys-Asn-Gly-OH和Lys-Asn-Gly-NH2；前提是该序列不是His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg。
在一个实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和谷氨酸(Glu)的氨基酸；在8位具有选自丙氨酸(Ala)、氨基异丁酸(Aib)、缬氨酸(Val)和甘氨酸(Gly)的氨基酸；在30位具有选自谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)和丙氨酸(Ala)的氨基酸；和C-端氨基酸序列缬氨酸33-赖氨酸34-天冬酰胺35-NH2。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其具有选自氢和2-羟基苯甲酰基的R1；在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和谷氨酸(Glu)的氨基酸；在8位具有选自丙氨酸(Ala)、氨基异丁酸(Aib)、缬氨酸(Val)和甘氨酸(Gly)的氨基酸；在30位具有选自谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、丙氨酸(Ala)、天冬酰胺(Asn)和天冬氨酸(Asp)的氨基酸；和C-端氨基酸序列缬氨酸33-赖氨酸34-天冬酰胺35-NH2。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其具有选自2-羟基苯甲酰基和反式-3-己烯酰基的R1；在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和谷氨酸(Glu)的氨基酸；在30位具有选自谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、丙氨酸(Ala)、谷氨酰胺(Gln)和天冬酰胺(Asn)的氨基酸；和C-端氨基酸序列赖氨酸33-天冬酰胺34-NH2。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其具有选自2-羟基苯甲酰基和反式-3-己烯酰基的R1；在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、谷氨酸(Glu)和异亮氨酸(Ile)的氨基酸；在30位具有选自谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)和丙氨酸(Ala)的氨基酸；和C-端氨基酸序列赖氨酸33-天冬酰胺34-氨基异丁酸35-NH2。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其具有选自氢、2-羟基苯甲酰基和反式-3-己烯酰基的R1；在8位具有选自氨基异丁酸(Aib)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)和甘氨酸(Gly)的氨基酸；在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、谷氨酸(Glu)和异亮氨酸(Ile)的氨基酸；在30位具有选自谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和丙氨酸(Ala)的氨基酸；和C-端氨基酸序列赖氨酸33-天冬酰胺34-氨基异丁酸35-NH2。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其具有选自氢和反式-3-己烯酰基的R1；在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和谷氨酸(Glu)的氨基酸；在8位具有选自氨基异丁酸(Aib)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)和甘氨酸(Gly)的氨基酸；在30位具有选自谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)和丙氨酸(Ala)的氨基酸；和C-端氨基酸序列赖氨酸33-天冬酰胺34-NH2。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其在20位具有选自亮氨酸(Leu)和包含C6-C20烷基侧链的甘氨酸(Gly)的氨基酸，其中在本发明的一个实施方案中该烷基侧链是辛基链；在8位具有选自丙氨酸(Ala)、氨基异丁酸(Aib)、缬氨酸(Val)和甘氨酸(Gly)的氨基酸；和C-端氨基酸序列缬氨酸33-赖氨酸34-天冬酰胺35-NH2。
在另一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其在20位具有选自亮氨酸(Leu)和包含C6-C20烷基侧链的甘氨酸(Gly)的氨基酸，其中在本发明的实施方案中该烷基侧链是辛基链；在8位具有选自丙氨酸(Ala)、氨基异丁酸(Aib)、缬氨酸(Val)和甘氨酸(Gly)的氨基酸；和C-端氨基酸序列赖氨酸33-天冬酰胺34-NH2。
在另一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其在20位具有一个选自亮氨酸(Leu)和包含C6-C20烷基侧链的甘氨酸(Gly)的氨基酸，其中在本发明的一个实施方案中该烷基侧链是辛基链；在8位具有选自丙氨酸(Ala)、氨基异丁酸(Aib)、缬氨酸(Val)和甘氨酸(Gly)的氨基酸；在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和谷氨酸(Glu)的氨基酸；和C-端氨基酸序列缬氨酸33-赖氨酸34-天冬酰胺35-NH2。
在另一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其在20位具有选自亮氨酸(Leu)和包含C6-C20烷基侧链的甘氨酸(Gly)的氨基酸，其中在本发明的一个实施方案中该烷基侧链是辛基链；在8位具有选自丙氨酸(Ala)、氨基异丁酸(Aib)、缬氨酸(Val)和甘氨酸(Gly)的氨基酸；在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和谷氨酸(Glu)的氨基酸；和C-端氨基酸序列赖氨酸33-天冬酰胺34-NH2。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其在20位具有选自亮氨酸(Leu)和包含C6-C20烷基侧链的甘氨酸(Gly)的氨基酸，其中在本发明的一个实施方案中该烷基侧链是辛基链；在8位具有选自丙氨酸(Ala)、氨基异丁酸(Aib)、缬氨酸(Val)和甘氨酸(Gly)的氨基酸；在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和谷氨酸(Glu)的氨基酸；在30位具有选自谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酰胺(Gln)和丙氨酸(Ala)的氨基酸；和C-端氨基酸序列缬氨酸33-赖氨酸34-天冬酰胺35-NH2。
在另一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其在20位具有选自亮氨酸(Leu)和包含C6-C20烷基侧链的甘氨酸(Gly)的氨基酸，其中在本发明的一个实施方案中该烷基侧链是辛基链；在8位具有选自丙氨酸(Ala)、氨基异丁酸(Aib)、缬氨酸(Val)和甘氨酸(Gly)的氨基酸；在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和谷氨酸(Glu)的氨基酸；在30位具有选自谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、丙氨酸(Ala)和谷氨酰胺(Gln)的氨基酸；和C-端氨基酸序列赖氨酸33-天冬酰胺34-NH2。
在另一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其在20位具有选自亮氨酸(Leu)和包含C6-C20烷基侧链的甘氨酸(Gly)的氨基酸，其中在本发明的实施方案中该烷基侧链是辛基链；在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和谷氨酸(Glu)的氨基酸；在30位具有选自谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、丙氨酸(Ala)和谷氨酰胺(Gln)的氨基酸；其中R1是反式-3-己烯酰基；和C-端氨基酸序列赖氨酸33-天冬酰胺34-NH2。
在另一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其具有选自氢、2-羟基苯甲酰基和反式-3-己烯酰基的R1；在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和谷氨酸(Glu)的氨基酸；在8位具有选自氨基异丁酸(Aib)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)和甘氨酸(Gly)的氨基酸；在30位具有选自谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)和丙氨酸(Ala)的氨基酸；和C-端氨基酸序列赖氨酸33-天冬酰胺34-甘氨酸35-NH2。
在另一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其具有选自2-羟基苯甲酰基和反式-3-己烯酰基的R1；在20位具有选自亮氨酸(Leu)和包含C6-C20烷基侧链的甘氨酸(Gly)的氨基酸，其中在本发明的一个实施方案中该烷基侧链是辛基链；和C-端氨基酸序列缬氨酸33-赖氨酸34-氨基异丁酸35-精氨酸36-NH2。
在另一个进一步的实施方案中，本发明涉及GLP-1类似物，其在20位具有选自亮氨酸(Leu)和包含C6-C20烷基侧链的甘氨酸(Gly)的氨基酸，其中在本发明的一个实施方案中该烷基侧链是辛基链；在27位具有选自丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和谷氨酸(Glu)的氨基酸；在30位具有选自谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、丙氨酸(Ala)和谷氨酰胺(Gln)的氨基酸；其中R1是反式-3-己烯酰基；和C-端氨基酸序列赖氨酸33-天冬酰胺34-NH2。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Ala-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO1)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物
2-羟基苯甲酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO2)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物2-羟基苯甲酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Ala-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Aib-NH2(SEQ.ID NO3)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Ala-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO4)在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-[(S)-辛基甘氨酸]-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Ala-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO5)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物反式-3-己烯酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO6)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物反式-3-己烯酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-[(S)-辛基甘氨酸]-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Ala-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO7)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物反式-3-己烯酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-NH2(SEQ.IDNO8)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物
反式-3-己烯酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Ala-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO9)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物，反式-3-己烯酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Ala-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO10)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物反式-3-己烯酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-[(S)-辛基甘氨酸]-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Ala-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO11)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-[(S)-辛基甘氨酸]-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO12)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-[(S)-辛基甘氨酸]-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO13)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物；反式-3-己烯酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-[(S)-辛基甘氨酸]-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID No14)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物反式-3-己烯酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-[(S)-辛基甘氨酸]-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg-NH2(SEQ.ID No15)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物2-羟基苯甲酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-NH2(SEQ.ID NO16)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO17)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO18)。
在一个实施方案中，本发明涉及一种GLP-1类似物，具有如下序列反式-3-己烯酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-[(S)-辛基甘氨酸]-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO19)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物，反式-3-己烯酰基-NH-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-[(S)-辛基甘氨酸]-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO20)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-[(S)-辛基甘氨酸]-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-NH2(SEQ.ID NO21)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-[(S)-辛基甘氨酸]-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Ala-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-NH2(SEQ.IDNO22)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-[(R)-十八烷基甘氨酸]-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO23)。
本发明也涉及所述肽的盐形式。本发明的肽类似物可以具有显著的酸性或显著的碱性，以与许多无机碱或无机酸和有机酸反应生成盐。
通常用于形成酸加成盐的酸包括无机酸，例如但不限于盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等，和有机酸，例如但不限于对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸等。这些盐的例子包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙酸盐(propiolate)、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、扁桃酸盐、羟乙酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐等。
碱加成盐包括来自于无机碱的盐，例如但不限于铵、碱金属或者碱土金属的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等。因此这些碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾等。
所述肽类似物的盐形式是特别优选的。应该理解，本发明的肽类似物当用于治疗目的时，也可以是盐形式。但是，该盐必须是药学上可接受的盐。
本发明也涉及一种组合物，其包含治疗有效量的本文所述肽或者其药学上可接受的盐，与选自药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂的至少一种组分。在一个具体实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含治疗有效量的本文所述肽或者其药学上可接受的盐，其中所述治疗有效量为约1mcg-约10mg。
本发明也涉及一种组合物，其包含治疗有效量的本文所述肽或者其药学上可接受的盐，与选自药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂的至少一种组分。
本发明还涉及一种治疗与葡萄糖代谢紊乱相关的疾病或病症的方法。此外，本发明涉及一种防止(即预防)与葡萄糖代谢紊乱相关的疾病或病症的方法。葡萄糖紊乱的非限制性的例子包括I型或II型糖尿病、胰岛素抵抗以及并发的体重疾病和病症或病况。体重疾病或相关病况的非限制性的例子包括肥胖、与超重并发的病况、饱足感异常、血浆胰岛素水平下降、血糖水平升高和胰脏β细胞群减少。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗I型或II型糖尿病的方法，包括向需要这种治疗的患者施用治疗有效量的本文所述肽或者其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗胰岛素抵抗的方法，包括向需要这种治疗的患者施用治疗有效量的本文所述肽或者其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，本发明涉及一种减轻患者体重的方法，包括向需要减轻体重的患者施用治疗有效量的本文所述肽或者其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，本发明涉及一种降低患者饱足感的方法，包括向需要的患者施用治疗有效量的本文所述肽或者其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，本发明涉及一种升高患者进食后血浆胰岛素水平的方法，包括向需要的患者施用治疗有效量的本文所述肽或者其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，本发明涉及一种降低患者空腹血糖水平的方法，包括向需要的患者施用治疗有效量的本文所述肽或者其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，本发明涉及一种增加患者胰脏β细胞群的方法，包括向需要的患者施用治疗有效量的本文所述肽或者其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本发明涉及施用所述肽或者其药学上可接受的盐的方法。施用本文所述肽或者其药学上可接受的盐的方法的非限制性的例子包括皮下给药、静脉给药、透皮给药、口服、经口腔和鼻内给药。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐用于治疗患者I型或II型糖尿病的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐用于治疗患者胰岛素抵抗的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐用于减轻患者体重的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐用于降低患者饱足感的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐用于升高患者进食后血浆胰岛素水平的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐用于降低患者空腹血糖水平的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐用于增加患者胰脏β细胞群的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐在制备用于治疗患者I型或II型糖尿病的药物中的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐在制备用于治疗患者胰岛素抵抗的药物中的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐在制备用于减轻患者体重的药物中的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐在制备用于增加患者饱足感的药物中的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及如上所述的肽或者其药学上可接受的盐在制备用于升高患者进食后血浆胰岛素水平的药物中的用途。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐在制备用于降低患者空腹血糖水平的药物中的用途。
在一个进一步的进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的肽或者其药学上可接受的盐在制备用于增加患者胰脏β细胞群的药物中的用途。
下面用非限制性的实施例对本发明进一步的说明。
实施例1固相合成GLP-1类似物并在His7处偶联R1部分本发明肽类似物通过使用标准自动化和/或手工固相肽合成技术、用具有氟烯基甲氧羰基保护和适当侧链保护的氨基酸、用二苯甲基胺(BHA)树脂来制备。在合成完成后，将该肽类似物从固相支持物切割，同时使其侧链脱保护。任选地，用适于氨基酸偶联的相同方法把水杨酸或反式-3-己烯酸偶联到His7的N-端。粗制肽通过制备性HPLC纯化，然后真空干燥并冻干。通过分析性HPLC评价肽的纯度，用MALDI-TOF MS分析法测定肽质量。把所述肽制备成TFA盐并溶解在20mM乙酸中用于动物的给药。GLP-1类似物的代表性实例如下表2所示。
表2代表性的GLP-1类似物





1L-BipL-二苯基丙氨酸；Aib氨基异丁酸；Nie正亮氨酸实施例2GLP-1类似物对CD-1小鼠进食后血糖水平的影响使禁食过夜的CD-1正常雌性小鼠(6周，Charles River，Montreal，Canada)随意进食30分钟。在30分钟时皮下注射GLP-1肽(100-400μg/kg)。用尾静脉切除法抽取血液样本，并在接下来的6小时里用One-TouchTM血糖测量仪测定血糖水平(mmol/L)。用梯形法计算“曲线下面积”(葡萄糖AUC[mmol/L/120分钟])。
如图1所示，天然的GLP-1和GLP-1的DPPIV抗性类似物[2-羟基苄基-GLP-1(7-36)NH2(TH0318)]在2小时内显示降血糖作用，而经修饰的类似物TH0322和TH0368的降血糖作用延长到至少4小时，与Exendin-4TM类似。
实施例3GLP-1类似物对低血糖Sprague-Dawley大鼠的血糖水平的影响。
将动物(Sprague-Dawley大鼠)在标准实验室中在12∶12的明∶暗周期下饲养。在禁食12小时后，将这些动物麻醉(2％异氟烷)，插入颈动脉和颈静脉导管以分别抽取血液和注射葡萄糖(先推注1.0g/kg，然后输注1.4g/kg/hr)。在葡萄糖推注和输注开始90分钟后，向动物皮下注射不同浓度(300μg/kg)的该类似物，在此期间血糖浓度达到平稳水平。在开始注射葡萄糖之前和30、60、90、100、110、120、135、150、180、210分钟后，有时还在240和300分钟后测定血糖。
取样(0.3-0.4ml；如果需要)后立即将血滴置于血糖测量仪上测定葡萄糖。在进行胰岛素和/或任何其他测定所需的血浆分离(离心)之前测定葡萄糖。
如图2所示，我们发现，GLP-1类似物TH0384比GLP-1或2-羟基苄基-GLP-1类似物TH0318更为有效。
实施例4使用RINm5F细胞用GLP-1类似物取代125I-GLP-1(7-36)NH2按照操作说明书培养RINm5F细胞(ATCC#CRL-2058)。实验前，先将细胞在融合烧瓶中保持4天。然后打碎细胞并收集在15ml圆锥试管中，然后超声，并评价蛋白质水平。稀释所述细胞膜，以在每个测试管中获得400μg等份的蛋白质。
包含400μg蛋白质的RINm5F细胞等份在22℃(室温)下在包含100μl磷酸钠缓冲液(10mM，pH 7.4)和不同浓度的GLP-1类似物(10-10-10-5)和100000cpm的I125GLP-1(7-36)NH2(3nM)的玻璃管中培养45分钟，该磷酸钠缓冲液包含100mMNaCl、2mM MgCl2、微蛋白酶抑制剂混合物(mini protease inhibitor cocktail)(1片/100ml，Roche diagnostics GmbH)。用100mM Tris-HCl(3×3mL，pH 7.4)终止反应，溶液用GF/C Whatman玻璃微纤维过滤器过滤。接着将溶液置于玻璃管中并用Packard COBRA IIγ计数器计数。描绘出替换等温线并用PrismTM(GraphPad，Ca)分析。
如图3所示，在Rinm5F细胞中GLP-1类似物TH0322和TH0384在替换受体结合配体方面比GLP-1更为有效。
实施例5在RINm5F细胞中对应答GLP-1和类似物的cAMP体外分泌的影响按照操作说明书培养RINm5F细胞(ATCC#CRL-2058)。使来自近似90％融合烧瓶中的细胞用胰蛋白酶处理并计数。然后将细胞接种在含培养基(RPMI 1640，10％FBS，2mM谷氨酰胺，0.5％ Pen-Strep；100μl)的96-孔板中(具有透明平底的ClearSarstedt plateTM)并在达到融合后4天测定。
用20mM的乙酸配制浓度为1mg/ml的GLP-1和类似物母液。然后将母液样品按每份体积100μl(100μg)分成等份，再加入400μl H2O。然后把等份冷冻并冻干过夜。该冻干样品保持在-80℃直到使用。仅在实验进行前才将上述的样品制备成浓度为1mM(利于肽纯度和肽含量)。在包含0.1mM IBMX的RPMI中从2×母液测定剂量应答(10-1M-10-5M)。在测定开始前少于30分钟内制备GLP-1稀释液。
将细胞培养基轻轻地从孔中吸出。然后在37℃下在100μl RPMI 0.1mM IBMX中预培养细胞10分钟。预培养之后，向孔中加入100μl每种2×GLP-1稀释液，设三个重复，并在37℃下培养30分钟。在培养期结束时，收集上清液并用放射免疫分析试剂盒(DPC)分析cAMP的浓度。用标准曲线将放射性计数转变为cAMP的量。用考马斯亮蓝测定法把所获得的cAMP值折算成在相应孔中的蛋白总量。cAMP的值以pmol/mg蛋白为单位表示为平均值±SEM(表3)。用GraphPad Prism 3.02TM把cAMP的剂量应答拟合至S型的曲线模型(固定斜度)。
当进行蛋白测定时，需要测定每个样品在每个孔中蛋白质的量。用NaOH(0.1N)裂解该细胞，并用10μl的等份测定蛋白质含量。上述方法是在考马斯亮蓝(Pierce)和自动化的平板读数器Emax ProTM(Molecular Devices)中完成的。
表3GLP-1和GLP-1类似物对RINm5F细胞中cAMP产生的效应。平均值±SEM；n＝剂量应答曲线的数目，设3个重复。

实施例6GLP-1类似物降低已喂食的CD-1小鼠进食后葡萄糖的效应将动物(CD-1小鼠)在标准实验室中在12∶12的明∶暗周期下饲养。把动物分组，每个笼子里4只小鼠。在禁食12小时(随意提供水)后，让动物进食30分钟。监测所食用的食物量。然后移走食物，给动物皮下注射待试验的载体或GLP-1类似物。在整个实验中的-30分钟、0、30、60、120、180、240、300和360分钟时测定葡萄糖水平。
用手术刀切除CD-1小鼠尾尖的一小片，用拇指从尾根部向尾尖轻压出一滴血。将滴出的血置于血糖测计仪(AccucheckTMcompact，Roche)上并读数。清除该斑点并用相同的方法对后面的每一组进行测定。
如图4所示，我们发现，在已喂食的CD-1小鼠中GLP-1类似物TH0395、TH0396、TH0397和TH0424能够有效降低进食后的葡萄糖。
实施例7在固