一种检测系统性红斑狼疮遗传风险的试剂盒的制作方法[0002]系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种自身免疫性疾病，它累及多个系统，在疾病发生发展中有自身抗体产生，有细胞间抗原的相互作用，这就涉及到基因的转录与翻译。遗传因素有可能在从SLE的易感性到SLE的临床表现多个方面都起作用。并且根据数据统计，SLE好发于女性，特别是育龄期妇女，累及心、脑、肾等全身多个重要脏器。据估计，目前我国有SLE患者100多万人，平均患病率位居全球第二位。众多研究发现，该疾病具有较高的遗传倾向，通过分子诊断检测与SLE发生密切相关的基因位点就可以提前评估受检者患SLE的风险，提早预防和治疗。[0003]细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (cytotoxic T lymphocyte associated antigen4，CTLA-4)是活化T细胞表面所表达的一种膜融合蛋白，对T细胞的活化起关键的负性调节作用，因此CTLA-4基因成为自身免疫性疾病的一个侯选易感基因。研究数据显示，CTLA-4基因第I外显子A49G多态性除了与SLE的发生密切相关外，还与Graves眼病、白癜风、自身免疫甲状腺病等相关。2004年徐安平等对中国南方地区人群研究结果显示CTLA4基因-1722T/C位点多态性与SLE明显相关，SLE患者TC基因型频率明显高于正常对照组。2009年孟炜课题组对中国南方人群研究发现CTLA-4基因-1722T/C位点与SLE相关，病例组和对照组T/T、C/T、C/C基因型频率有显著差异，SLE患者TT基因频率明显升高。国内外的临床研究数据显示，CTLA-4基因-1722T/C位点多态性除了与SLE的发生密切相关外，还可以作为白癜风、乳腺癌等多种疾病发生的独立危险因素。[0004]肿瘤坏死因子受体2 (tumor necrosis factor receptor 2, TNFR2)主要街道 T和B细胞的增值，研究表明TNFR2在血清中的表达水平与系统性红斑狼疮(SLE)的临床活动程度有关。全基因扫描结果显示人类SLE的易感基因热点集中在I号染色体上包括lq36，而TNFR2基因就定位于此。研究发现TNFR2基因上有许多个多态性位点，而第6外显子的587位点T — G即氨基酸序列中的196位(蛋氨酸Met —精氨酸Arg)的变异被认为与SLE发病有关。研究表面，TNFR2587位点T — G突变可能通过TNF_a信号传导途径来影响T和B淋巴细胞的增值，诱导B细胞产生过多的自身抗体，因此TNFR2587位点T — G突变是SLE的危险因素。
[0005]基于CTLA4基因上A49G和T_1772C、MTHFR基因上C677T的3个SNPs位点基因型可用来评估系统性红斑狼疮发病风险级别，本发明提供一种系统性红斑狼疮基因检测试剂盒。[0006]该试剂盒包括: 检测CTLA4基因上A49G和T_1772C、TNFR2基因上T587G的3个SNPs位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物； PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)； PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；
DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等)。
[0007]本发明试剂盒的组分和含量包括:
PCR 反应体系:10 XPCR 反应缓冲液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul。
[0008]PCR 产物纯化体系:lU/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20
3.875ul。
[0009]测序反应体系:25%BigDyemix lul ；3.2uM DNA 测序引物 lul ; 125mM EDTA 溶液lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul。
[0010]本试剂盒供一人份检测使用，试剂盒的保存温度为-20°C。
[0011]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0012]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0013]实施例1.检测试剂盒的使用。
[0014]1、抽提DNA模板
刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。
[0015]2、PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对:
(1)CTLA4 (A49G)正向引物:5’ -CTGAACACCGCTCCCATAAA-3’
CTLA4 (A49G)反向引物:5’ -GAATACAGAGCCAGCCAAGC-3’
(2)CTLA4 (T-1772C)正向引物:5’ -CACAGAAGCAAAGAACCCAT-3’
CTLA4 (T-1772C)反向引物:5’ -TGTATGTGGGTAGGAGATGGA-3’
(3)TNFR2 (T587G)正向引物:5’ -CTCCTATCCTGCCTGCT-3’
TNFR2 (T587G)反向引物:5’ -GACGTGCAGACTGCATCCA-3’。
[0016]PCR扩增的反应体系为:10 X PCR反应缓冲液2.5ml ；25mM的dNTP混合液
0.2ml、5U/ul Taq酶0.125ml、DNA模板Iml (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各
0.25ml、ddH20 19.175ml。
[0017]反应条件为:94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C I分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。
[0018]3、PCR扩增产物纯化使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去离子水 3.875ul。
[0019]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。
[0020]4、DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物:
(1)CTLA4 (A49G)测序引物:5，-CTGAACACCGCTCCCATAAA-3’
(2)CTLA4 (T-1772C)测序引物:5’ -CACAGAAGCAAAGAACCCAT-3’
(3)TNFR2 (T587G)测序引物:5，-CTCCTATCCTGCCTGCT-3’。
[0021]反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA测序引物lul，去离子水2ul。
[0022]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98 °C 2min,进行25个循环的960C 30s,55°C 30s, 60°C 4min。
[0023]反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室温下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min离心15min ,轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入测
序仪中。
[0024]5、基因型分析
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。
[0025]实施例2.为人群进行系统性红斑狼疮基因检测的服务。
[0026]1.采样及抽提DNA
由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
[0027]2.基因型检测
使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的CCTLA4基因上A49G和T-1772C、TNFR2基因上T587G的3个SNPs位点分别进行DNA测序，确定这3个SNPs位点的基因型。
[0028]3.系统性红斑狼疮基因高危人群风险评估分析
通过对受检者SNPs基因型的分析，出具系统性红斑狼疮风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者CTLA4基因上A49G和T-1772C、TNFR2基因上T587G的SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读系统性红斑狼疮基因检测报告单。