专利名称：双重rt-pcr检测花生条纹病毒和黄瓜花叶病毒的方法花生病毒病是影响我国花生生产和发展的重要病害，目前国内外已报道的侵染花生的病毒有观种，在我国北方花生产区，病毒病引起花生减产5 10%，大流行年份能引起花生减产20 30%。近年来，花生病毒病在我国北方花生产区多次爆发，给生产带来严重损失。其中花生条纹病毒G^eanut Stripe Virus，PStV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)引起的花生条纹病毒病和花生黄花叶病毒病由于种传率高，病害发生早，在田间扩散快，严重影响花生的产量和品质，是生产上危害最严重的两种花生病毒病。PStV属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，CMV是黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)，PMV和CMV基因组均为正义、单链RNA。花生病毒病的检测技术包括症状观察、电镜观察、酶联免疫等方法， 由于PStV存在不同症状类型株系，在中国占优势的轻斑驳株系，引起花生症状较轻，并且与CMV和其他病毒病症状类似，不易分辨；而电镜观察、酶联免疫等方法操作繁琐且不同检测方法的灵敏度及准确度相差明显。RT-PCR方法是目前研究花生病毒病的主要方法。多重RT-PCR可以在同一反应体系中进行两个以上目标序列的特异性扩增，已经广泛应用于植物病毒的检测，但采用多重PCR同时检测花生CMV和PStV在国内外尚未见。目前主要利用RT-PCR方法对PStV进行检测，由于PStV和CMV经常混合发病，常规RT-PCR方法需要逐一检测费时费力，多重 PCR(M-PCR)是在一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。与常规的单一 PCR相比，多重PCR可以同时检测多种病害，极大地提高检测效率，降低检测成本。鉴于上述技术问题，迫切需要出现一种方法简单，能在一次反应中对材料中的CMV 和PStV单独或混合侵染进检测及鉴定，特异性良好，能够特异性的扩增CMV和PStV ；敏感高，需要时间短，可在数小时内完成检测，降低成本，对控制花生病毒病在田间的发生， 减少经济损失，抗病筛选和病害流行预测具有十分重要的意义，应用前景广阔的一种双重 RT-PCR检测花生条纹病毒和黄瓜花叶病毒的方法。
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种方法简单，能在一次反应中对材料中的CMV和PStV单独或混合侵染进检测及鉴定，特异性良好，能够特异性的扩增CMV和PStV ；敏感高，需要时间短，可在数小时内完成检测，降低成本，对控制花生病毒病在田间的发生，减少经济损失，抗病筛选和病害流行预测具有十分重要的意义，应用前景广阔的一种双重RT-PCR检测花生条纹病毒和黄瓜花叶病毒的方法。为了实现上述目的，本发明提供了一种双重RT-PCR检测花生条纹病毒和黄瓜花5叶病毒的方法，其中，包括如下步骤a.总RNA提取和cDNA第一链合成；b.引物的设计c.双重 RT-PCR 扩增d.同时检测PStV和CMV的双重RT-PCR体系的建立。进一步包括如下步骤f.单一 RT-PCR 扩增以反转录的cDNA为模板，建立25 μ L反应体系10 Xbuffer 2. 5 μ L，正向引物/ 反向引物(lOpmol/μ 1)各 lyL，dNTPS (2. 5mmol/L)2y L, Taq 酶 0.5 μ 1，cDNA 4 μ 1，加去离子水至25 μ L 反应条件94°C预变性:3min ；94°C变性45s，51°C退火50s，72°C延伸Imin循环30 次，72°C延伸lOmin，取5μ L扩增产物1. 5%琼脂糖凝胶电泳分析；g.双重RT-PCR与单一 RT-PCR的灵敏性比较h.双重RT-PCR检测的特异性的检测。步骤a为分别采集PStV和CMV健康和感病植株叶片，置_70°C冰箱冻存；提取总RNA，具体步骤如下(1)称量IOOmg冻存的叶片，迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵充分研磨组织直至研磨成粉末状，其间补加液氮；(2)将研磨成粉末状的样品转移至离心管中，加入Iml TransZol，用勻浆仪进行勻浆处理，用枪反复吹吸；(3)室温静置 5min ；(4)加0. 2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育3分钟；(5) 10, 000 Xg 4°C离心15分钟，此时样品分成三层，无色的水相(上层)，中间层， 粉红色有机相(下层)；RNA主要在水相中，水相体积为所用TransZol试剂的60%。(6)转移无色的水相于新的离心管中，加入0. 5ml异丙醇，颠倒混勻，室温孵育10 分钟；(7) 10，OOOXg 4°C离心10分钟，去上清，在管侧和管底形成胶状沉淀；(8)加Iml 75%乙醇(DEPC处理的水配制)，剧烈涡旋(每使用ImlTransZol至加 75% 乙醇 Iml)；(9) 7500 Xg 4°C离心 5 分钟；(10)弃上清，室温晾干沉淀5分钟；(11)沉淀溶于50-100 μ 1 RNA溶解液中；(12)55°C -60°C孵育10分钟，保存样品于_70°C以备用；以提取的总RNA为模板，合成cDNA第一链，具体步骤如下(1)建立 20 μ 1 反转录体系总 RNA6y 1, Oligo (dT) 18 (0. 5 μ g/μ 1) 1 μ 1，2XES Reaction Mix 10 μ 1, EasyScript RT/RI Enzyme Mixl μ 1, RNase-free Water _卜20μ 1 ；(2)轻轻混勻，42°C孵育30min，85°C加热5min终止反应，合成的cDNA置_70°C保存备用。步骤b中CMV设计的弓丨物及序列为引物，CMV-F ；序列，5，-GCAGGTGGTTAACGGTCTTTAG-3，；引物，CMV-R ；序列，5，-CTGGATGGACAACCCGTTC-3，；扩增片段长度为IOMbp。步骤b中PStV设计的弓丨物及序列为引物，PMV-F ；序列，5，-ATGGCTTTATGGTGTGGTGTAT-3，；引物，PMV-R ；序列，5，-CACGATCTGATGTCTTGGAAGT-3，；扩增片段长度为300bp。步骤c为在步骤f的基础上，对主要影响因子进行优化后的25 μ L扩增体系为10Xbuffer 2. 5μ L, CMV-F/CMV-R(10pmol/y 1)各 1. 5 μ L，PStV-F/PStV-R (IOpmol/μ 1)各 1 μ L, dNTPS(2. 5mmol/L)2y L, Taq 酶 1 μ 1，cDNA 4μ 1 ；反应条件94°C预变性:3min ；94°C变性45s，51°C退火50s，72°C延伸Imin循环30 次，72°C延伸 IOmin ；PCR扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳，经胶回收试剂盒回收目的条带，连接于载体 PMD18-T后转化大肠杆菌DH5 α，再进行序列测定。步骤d为以感病的总RNA反转录物为模板建立的双重RT-PCR方法，分别检测PStV与CMV 单一感病样品和混合感病样品，均可得到相同的特异性条带，扩增产物电泳结果表明，在单一感染样品中呈单一明亮条带；在混合感染样品中，扩增产物呈两条明亮的电泳条带，根据扩增条带判断检出的病毒种类。步骤g为按10倍递进稀释法稀释PStV与CMV单一感病样品和混合感病样品后分别进行检测，单一 RT-PCR扩增可以从稀释10_6倍的cDNA中扩增出PMV、可以从稀释10_7倍的cDNA 中扩增出CMV，双重RT-PCR能够从1(Γ6倍的cDNA中同时检测到CMV和PStV。步骤h为对不同病毒和健康植株进行双重RT-PCR检测，只有PStV与CMV混合样品能够扩增到特异性条带，PSV, PeMoV和健康植株样品均无特异性条带产生。步骤f进一步包括单一 RT-PCR及扩增产物序列分析，以cDNA为模板，分别进行PStV和CMV的单一 PCR扩增，PCR产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳观察结果(1) CMV扩增产物为1054bp，与预期片段大小相符，与GenBank中其它CMV分离物的核苷酸序列同源性为90% 99% ；(2)PStV扩增片段为300bp，与预期的产物大小相同，与GenBank中其它PS tV分离物的核苷酸序列同源性为93% 99%。本发明的优点为方法简单，能在一次反应中对材料中的CMV和PStV单独或混合侵染进检测及鉴定，特异性良好，能够特异性的扩增CWV和PStV ；敏感高，需要时间短，可在数小时内完成检测，降低成本，对控制花生病毒病在田间的发生，减少经济损失，抗病筛选和病害流行预测具有十分重要的意义，应用前景广阔。RT-PCR方法是目前研究花生病毒病的主要方法。多重RT-PCR可以在同一反应体系中进行两个以上目标序列的特异性扩增，已经广泛应用于植物病毒的检测，但采用多重PCR同时检测花生CMV和PStV在国内外尚未见报导，笔者根据CMV和PStV核苷酸保守序列设计引物，建立CMV和PStV的双重RT-PCR检测方法，未发现引物之间、引物与其它模板之间的非特异性互作干扰，从本发明结果可知该双重RT-PCR检测体系对单个或是混合病原的检测均能获得较好的扩增效果。在进行多重PCR的研究中，引物的设计至关重要，本研究设计的引物是针对2种病毒各自相对保守的CP基因序列，CP基因具有高度保守性，因此能够用作PCR扩增的目的基因；在引物设计上利用扩增片段长度的不同(CMV10Mbp，PMV 300bp)直接判定扩增结果， 使结果判定时更简便、直观和实用；设计的两对引物G+C含量相近，这样能确保两对引物在相近的退火温度进行双重RT-PCR扩增，为成功进行双重RT-PCR反应奠定了基础；并且利用 BLAST和DNAMAN等对引物进行分析，使引物之间不存在互补，以避免两对引物之间形成复杂的二级结构及引物二聚体而影响扩增结果的判定。花生病毒病对花生的产量和质量造成的危害日趋严重，相对于单一 RT-PCR检测， 本发明建立的双重RT-PCR方法能在一次反应中对材料中的CMV和PStV单独或混合侵染进检测及鉴定，该方法特异性良好，能够特异性的扩增CMV和PStV ；敏感高，能够从稀释10-6 倍的cDNA中同时检测到CMV和PMV，与单一 RT-PCR具有相同的检测灵敏度；并且需要时间短，可在数小时内完成检测，降低了成本，对控制花生病毒病在田间的发生，减少经济损失， 抗病筛选和病害流行预测具有十分重要的意义，具有广阔的应用前景。图1为CMV和PMV的单一 RT-PCR扩增结果图。 图2为PMV和CMV的双重RT-PCR扩增3为双重RT-PCR与单RT-PCR检测灵敏度比较4为双重RT-PCR的特异性图

反应条件94°C预变性:3min ；94°C变性45s，51°C退火50s，72°C延伸Imin循环30 次，72°C延伸lOmin，取5μ L扩增产物1. 5%琼脂糖凝胶电泳分析；g.双重RT-PCR与单一 RT-PCR的灵敏性比较h.双重RT-PCR检测的特异性的检测。步骤a为分别采集PStV和CMV健康和感病植株叶片，置_70°C冰箱冻存；提取总RNA，具体步骤如下(1)称量IOOmg冻存的叶片，迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵充分研磨组织直至研磨成粉末状，其间补加液氮；(2)将研磨成粉末状的样品转移至离心管中，加入Iml TransZol，用勻浆仪进行勻浆处理，用枪反复吹吸；(3)室温静置 5min;(4)加0. 2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育3分钟；(5) 10, 000 Xg 4°C离心15分钟，此时样品分成三层，无色的水相(上层)，中间层， 粉红色有机相(下层)；RNA主要在水相中，水相体积为所用TransZol试剂的60%。(6)转移无色的水相于新的离心管中，加入0. 5ml异丙醇，颠倒混勻，室温孵育10 分钟；(7) 10，OOOXg 4°C离心10分钟，去上清，在管侧和管底形成胶状沉淀；(8)加Iml 75%乙醇(DEPC处理的水配制)，剧烈涡旋(每使用ImlTransZol至加 75% 乙醇 Iml)；(9) 7500 Xg 4°C离心 5 分钟；(10)弃上清，室温晾干沉淀5分钟；(11)沉淀溶于50-100 μ 1 RNA溶解液中；(12)55°C -60°C孵育10分钟，保存样品于_70°C以备用；以提取的总RNA为模板，合成cDNA第一链，具体步骤如下(1)建立 20μ 1 反转录体系总 RNA6y 1，Oli go (dT) 18 (0. 5 μ g/μ 1) 1 μ 1，2XES Reaction Mix 10 μ 1, EasyScript RT/RI Enzyme Mixl μ 1, RNase-free Water _卜20μ 1 ；(2)轻轻混勻，42°C孵育30min，85°C加热5min终止反应，合成的cDNA置_70°C保存备用。步骤b中CMV设计的弓丨物及序列为引物，CMV-F ；序列，5，-GCAGGTGGTTAACGGTCTTTAG-3，；引物，CMV-R ；序列，5，-CTGGATGGACAACCCGTTC-3，；扩增片段长度为IOMbp。步骤b中PStV设计的弓丨物及序列为引物，PMV-F ；序列，5，-ATGGCTTTATGGTGTGGTGTAT-3，；引物，PMV-R ；序列，5，-CACGATCTGATGTCTTGGAAGT-3，；扩增片段长度为300bp。步骤c为
在步骤f的基础上，对主要影响因子进行优化后的25 μ L扩增体系为10Xbuffer 2. 5 μ L, CMV-F/CMV-R(10pmol/ μ 1)各 1.5yL，PS tV-F/PStV-R(10pmol/μ 1)各 1 μ L， dNTPS(2. 5mmol/L)2y L, Taq 酶 1 μ 1，cDNA 4μ 1 ；反应条件94°C预变性:3min ；94°C变性45s，51°C退火50s，72°C延伸Imin循环30 次，72°C延伸 IOmin ；PCR扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳，经胶回收试剂盒回收目的条带，连接于载体 PMD18-T后转化大肠杆菌DH5 α，再进行序列测定。步骤d为以感病的总RNA反转录物为模板建立的双重RT-PCR方法，分别检测PStV与CMV 单一感病样品和混合感病样品，均可得到相同的特异性条带，扩增产物电泳结果表明，在单一感染样品中呈单一明亮条带；在混合感染样品中，扩增产物呈两条明亮的电泳条带，根据扩增条带判断检出的病毒种类。步骤g为按10倍递进稀释法稀释PStV与CMV单一感病样品和混合感病样品后分别进行检测，单一 RT-PCR扩增可以从稀释10_6倍的cDNA中扩增出PMV、可以从稀释10_7倍的cDNA 中扩增出CMV，双重RT-PCR能够从1(Γ6倍的cDNA中同时检测到CMV和PStV。步骤h为对不同病毒和健康植株进行双重RT-PCR检测，只有PStV与CMV混合样品能够扩增到特异性条带，PSV, PeMoV和健康植株样品均无特异性条带产生。步骤f进一步包括单一 RT-PCR及扩增产物序列分析，以cDNA为模板，分别进行PStV和CMV的单一 PCR扩增，PCR产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳观察结果(I)CMV扩增产物为1054bp，与预期片段大小相符，与GenBank中其它CMV分离物的核苷酸序列同源性为90% 99% ；(2)PStV扩增片段为300bp，与预期的产物大小相同，与GenBank中其它PStV分离物的核苷酸序列同源性为93% 99%。具体实施例1材料与方法1.1材料和试剂PStV和CMV感病植株叶片采自山东省花生研究所莱西试验基地，置_70°C冰箱冻 #。 #1 ;) (Peanut mottle virus, PeMoV)(Peanut stunt virus, PSV)样品由本实验室检测保存。TranSZol、CDNA第一链合成试剂盒、Taq DNA聚合酶、逆转录酶购自北京全式金生物技术有限公司，凝胶回收试剂盒和PMD18-T克隆载体购自宝生物工程(大连)有限公司，其余试剂均为进口或国产分析纯。1.2引物设计根据GenBank中已登陆的CMV和PStV的核苷酸序列，选取保守区域设计引物(表 1)，由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。表1双重RT-PCR扩增的特异性引物Table 1 Specific primer for Duplex RT-PCR


本发明公开了双重RT-PCR检测花生条纹病毒和黄瓜花叶病毒的方法，其中，包括如下步骤a.总RNA提取和cDNA第一链合成；b.引物的设计；c.双重RT-PCR扩增；d.同时检测PStV和CMV的双重RT-PCR体系的建立；f.单一RT-PCR扩增；g.双重RT-PCR与单一RT-PCR的灵敏性比较；h.双重RT-PCR检测的特异性的检测。本发明方法简单，能在一次反应中对材料中的CMV和PStV单独或混合侵染进检测及鉴定，特异性良好，能够特异性的扩增CMV和PStV；敏感高，需要时间短，可在数小时内完成检测，降低成本，对控制花生病毒病在田间的发生，减少经济损失，抗病筛选和病害流行预测具有十分重要的意义，应用前景广阔。