专利名称：Braf基因突变检测特异性引物和液相芯片的制作方法IE^I 1 ^ ! !^! ] !^ Bl (v-taf mourine sarcoma viral oncogene homolog Bi, BRAF)基因，定位于人染色体7q34，其具有功能的编码区由2510对碱基组成， 编码MAPK通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，该酶将信号从Ras转导至MEK1/2，从而参与调控细胞内多种生物学事件。研究表明，BRAF主要有两种突变类型①11%的突变位于外显子11上的甘氨酸环，如G463、G465、G468等点突变；②89%的突变发生于外显子15上的激活区，其中约92%位于第1799位核苷酸上(T突变为A)，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(V600E)。目前，已经建立的BRAF基因突变检测技术，主要是PCR-测序法和实时荧光定量 PCR检测技术。PCR-测序法具有能够确定突变范围和类型的优点，是目前应用较为广泛的检测方法，但测序法的灵敏度只有20% _25%，远远不能满足实际应用的需要，尤其是对于异质性的肿瘤体细胞突变，低灵敏度将导致大量的漏检。同时，测序法检测操作复杂，时效性差，对于要求高时效性和高灵敏度实际应用检测，测序法的局限性早已凸显。而实时荧光定量PCR检测技术，其检测效率高，时效性强，但其高居不下的假阳性率也为实际应用所诟病。基于上述检测技术存在的问题，申请人前期成功开发的“BRAF基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法”(申请号200910037357. 6)检测方法操作简单，通过酶切富集排除了大量野生型序列造成的干扰，结果特异性好，灵敏度高，准确度达99 %以上，但该方法涉及两轮PCR操作，较易造成污染，且杂交检测步骤探针较为接近(只有突变位点不同)，不便于多种基因突变位点并行检测。
本发明的目的之一是提供BRAF基因突变检测液相芯片。该液相芯片可用于检测 BRAF基因的正常基因型和V600E突变型。实现上述目的的技术方案如下一种BRAF基因突变检测液相芯片，主要包括有，(A)针对BRAF的V600E突变位点，分别设计的野生型和突变型的一对ASPE引物 每种ASPE弓丨物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物组成，所述 tag序列选自SEQID NO. 25-SEQ ID NO. 30中的任2种序列；所述特异性引物是来源于SEQ ID NO. 1和SEQ IDN0. 2或其反向互补序列SEQ ID N0. 13和SEQ ID N0. 14中的碱基序列， 且特异性引物的3’端的最后3位碱基中的一个碱基为突变位点，所述特异性引物的Tm值在52 58°C之间；(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的2种微球，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO. 31 SEQ ID NO. 36中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C)用于扩增具有V600E突变位点的BRAF基因目标序列的扩增引物。优选地，所述扩增引物为SEQ ID NO. 37和SEQ ID NO. 38。优选地，所述野生型的特异性引物为SEQ ID NO. 3 SEQ ID N0. 7中的一条，所述突变型的特异性引物为SEQ ID N0. 8 SEQ ID N0. 12中的一条；或所述野生型的特异性引物为SEQID N0. 15 SEQ ID N0. 19中的一条，所述突变型的特异性引物为SEQ ID N0. 20 SEQ IDN0. 24 中的一条。优选地，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述间隔臂序列为5-10个T。本发明的另一目的是提供一种用于BRAF基因突变检测的特异性引物。具体技术方案如下用于BRAF基因V600E突变检测的特异性引物，所述特异性引物是来源于SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2或其反向互补序列SEQ ID N0. 13和SEQ ID N0. 14中的碱基序列，且特异性引物的3’端的最后3位碱基中的一个碱基为突变位点，所述特异性引物的Tm值在 52 58°C之间。本发明的主要优点在于1.本发明所制备的BRAF基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，可实现多个突变位点的并行检测。2.本发明所设计的针对野生型和突变型的特异性ASPE引物，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，探针之间不存在非特异性结合，检测特异性及准确性高，检测结果与测序法吻合率达到100%。3、本发明检测体系效果稳定可靠，特异性引物、Tag序列、扩增引物等组合使用使液相芯片和检测方法形成一个检测效果完好的系统。本发明公开了一种BRAF基因突变检测液相芯片，主要包括有，(A)针对BRAF的V600E突变位点，分别设计的野生型和突变型ASPE引物对每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物组成，特异性引物的3’端的最后3位碱基中的一个碱基为突变位点，所述特异性引物的Tm值在52～58℃之间；分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的2种微球所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；用于扩增具有V600E突变位点的BRAF基因目标序列的扩增引物。本发明所制备的BRAF基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。