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含有短暂性存活ctl的医药品组合物制作方法

  • 专利名称
    含有短暂性存活ctl的医药品组合物制作方法
  • 发明者
    山下直秀, 藤田成晴, 长山人三
  • 公开日
    2012年7月18日
  • 申请日期
    2010年8月4日
  • 优先权日
    2009年8月17日
  • 申请人
    国立大学法人东京大学
  • 文档编号
    A61P35/00GK102596209SQ20108003626
  • 关键字
  • 权利要求
    1.一种医药品组合物,其特征在于,含有来自人造血干细胞的细胞,其中,所述细胞的人HLA I类分子的任一基因座至少含有一个所述细胞的匹配型与患者的匹配型一致的抗原;以及所述细胞的人HLA I类和II类分子的基因座的抗原至少含有一个所述细胞的匹配型与患者的匹配型不一致的抗原,并且,来自所述造血干细胞的细胞在所述患者体内既不发生永久存活,也不引起重症度为III或IV的急性GVH病2.根据权利要求1所述的医药品组合物,其特征在于,所述医药品组合物在除去所述患者的淋巴细胞后给予;该医药品组合物在所述患者体内短暂性地存活,伴随着所述患者的淋巴细胞再增殖而消失3.根据权利要求1或2所述的医药品组合物,其特征在于,所述细胞的人HLAI类分子的任一基因座选自HLA-A、HLA-B和HLA-C,所述细胞的人HLA II类分子的基因座为DRBl ; 以及所述细胞的人HLA I类和II类分子的基因座的抗原至少含有一个所述细胞的匹配型与患者的匹配型不一致的抗原,并且,来自所述造血干细胞的细胞在所述患者体内既不发生永久存活,也不引起重症度为III或IV的急性GVH病4.根据权利要求3所述的医药品组合物,其特征在于,所述细胞的HLA-A、HLA-B和 DRBl基因座的抗原含有5 6个所述细胞的匹配型与患者的匹配型不一致的抗原,并且,来自所述造血干细胞的细胞在所述患者体内既不发生永久存活,也不引起重症度为III或IV 的急性GVH病5.根据权利要求1 4中任一项所述的医药品组合物,其特征在于,所述人造血干细胞为脐带血干细胞6.根据权利要求1 5中任一项所述的医药品组合物,其特征在于,来自所述人造血干细胞的细胞为对人HLA I类分子限制性表位特异性的细胞毒性T细胞7.根据权利要求1 6中任一项所述的医药品组合物,其特征在于,用于治疗癌症8.根据权利要求1 6中任一项所述的医药品组合物,其特征在于,用于治疗感染症9.根据权利要求8所述的医药品组合物,其特征在于,所述对人HLAI类分子限制性表位特异性的细胞毒性T细胞未受到利用所述人HLA I类分子限制性表位的刺激地得到扩+曰O10.根据权利要求9所述的医药品组合物,其特征在于,所述细胞的HLA-A基因座至少含有一个所述细胞的匹配型与患者的匹配型一致的抗原,以及所述细胞毒性T细胞对Wilms瘤致病基因产物(WTl)具有特异性11.一种医药品组合物,其特征在于,含有来自人脐带血的细胞毒性T细胞,其中, 所述细胞毒性T细胞对HLA-A、HLA-B和HLA-C中的任一种基因座的HLA I类分子限制性表位具有特异性;对所述人HLA I类分子限制性表位特异性的细胞毒性T细胞未受到利用所述人HLA I 类分子限制性表位的刺激地得到扩增;所述细胞的任一种基因座的HLA I类分子至少含有一个所述细胞的匹配型与患者的匹配型一致的抗原;以及所述细胞的HLA-A、HLA-B和DRBl基因座含有5 6个所述细胞的匹配型与患者的匹配型不一致的抗原,并且,来自所述造血干细胞的细胞在所述患者体内既不发生永久存活, 也不引起重症度为III或IV的急性GVH病12. —种权利要求9所述的医药品组合物的制造方法,其特征在于,包括用⑶3/^拟8免疫珠刺激人脐带血的步骤
  • 技术领域
    本发明涉及一种含有来自人造血干细胞的细胞的医药品组合物,更具体而言,涉及一种医药品组合物,其含有来自脐带血的细胞毒性T细胞,能够识别患者的HLA I类分子呈递的疾病相关抗原,并且,来自前述造血干细胞的细胞在前述患者体内既不发生永久存活,也不引起重症度为III或IV的急性GVH病
  • 背景技术
  • 具体实施例方式
    以下说明的本发明的实施例仅以例示为目的,并不限定本发明的技术范围本发明的技术范围仅由专利保护范围而限定本说明书中提及的全部专利文献和非专利文献的整体以引用的方式并入本说明书中用以下实施例进行说明的实验为经东京大学医科学研究所的伦理审查委员会批准后实施的实施例1人脐带血人脐带血试样为在得到母亲的知情同意署名后进行采血,利用理化学研究所生物资源中心内的液氮系统冷冻保存采血方法如Rubinstein,P.等(Blood,81 1679-1690(1993))中所说明,冷冻保存方法如 Rubinstein,P.等(Proc. Natl. Acad. ki. USA,92 10119-10122(1995))中所说明培养基和试剂作为培养基,使用X-Vivol5(商标,TaKaRa Bio,滋贺)在一部分实验中,添加有最终浓度为0 5%的人AB型血清(Lonza) 0添加有P印rotech(Rocky Hill,新泽西州) 制的重组人白细胞介素_2(IL-2),使其最终浓度为0 1500IU/mL来自脐带血的⑶3阳性细胞的精制将从理化学研究所得到的脐带血25mL在37°C的温水浴中解冻,覆盖在 Ficoll-Paque (商标,GE Healthcare)上,在室温下进行1500rpm、30分钟的离心回收血沉棕黄层,将其再次悬浮于PBS中,将所得白细胞进一步用PBS清洗3次然后,在前述白细胞悬浊液中,每IO7个细胞添加25 μ L的Dynal (商标)免疫磁珠CD14 (Invitrogen),在冰上或者于4°C搅拌30分钟以上利用磁性粒子分离器(MPC-l,Dynal)除去⑶14阳性细胞和将珠吞噬的单核巨噬细胞将残余的细胞再次悬浮于PBS中,每IO7个细胞添加有25 μ L 的Dynal (商标)免疫磁珠⑶3 (Invitrogen),在冰上或者于4°C搅拌30分钟以上利用磁性粒子分离器(MPC-1,Dynal)分离⑶3阳性细胞来自脐带血的⑶3阳性细胞的培养将前述⑶3阳性细胞以IO6个/mL的浓度悬浮于添加有5%人AB型血清的XVivo15 培养基中,添加 Dynabeads CD3/CD28T cell expander (Invitrogen)和重组 IL-2,进行培养在培养的第4、7、9、12和14天,利用锥虫蓝染色测定活细胞数用添加有包含重组 IL-2的5%人AB型血清的ExVivo-15培养基,以成为IO6个/mL的细胞浓度的方式进行稀释结果图1中示出来自脐带血的CD3阳性细胞的增殖条件的研究结果图1中的纵轴表示将培养开始时的CD3阳性细胞的总数设为1的增殖倍数,横轴表示培养开始后的天数 用于刺激的CD3/CD^免疫珠以每个细胞为约2个珠的比例加以使用与添加在培养基中的重组IL-2和人血清的浓度无关地,在任何培养条件下,来自脐带血的⑶3阳性细胞到培养第9天为止基本上以相同的速度进行增殖但是,若在培养的第12天,则IL-2浓度为 1500IU/mL,并且,仅人血清为5%的培养条件下的细胞维持增殖速度,而其他培养条件下的细胞出现增殖速度下降、细胞数目减少若在培养的第14天,则仅在IL-2浓度为1500IU/ mL的条件下进行培养的细胞以相同的速度增殖如上所示,可由来自脐带血的白细胞仅将 CD3阳性的T细胞进行精制,对其给与分裂刺激而选择性地进行增殖实施例2癌抗原特异性细胞毒性T细胞的扩增将用⑶3/^拟8免疫珠进行刺激、用添加有5%人AB型血清和1500IU/mL IL-2的 ExVivol5培养基进行培养扩增的来自脐带血的CD3阳性细胞在培养的第14天进行回收,利用APC标记抗人CD8小鼠单克隆抗体和PE标记HLA-A * 2402WT1 (wild) CMTffNQMNL-四聚物进行双重染色,进行流式细胞术分析结果图2中示出前述流式细胞术分析结果图中的纵轴以PE的荧光强度表示与HLA-A 女2402WT1 (wild) CMTffNQMNL-四聚物的反应,横轴以APC的荧光强度表示与抗⑶8抗体的反应如图2所示,在经扩增的来自脐带血的CD3阳性细胞中,CD8阳性细胞即细胞毒性T细胞中的约11. 6%在HLA-A 2402等位基因的环境中特异性地识别来自作为癌抗原的WTl 的肽已知WTl特异性细胞毒性T细胞与淋巴瘤或其它过度表达WTl的恶性细胞反应,但是不攻击仅较少量地表达WTl的正常细胞(Gao, L.等,Blood, 95 2198-2203(2000), Oka, Y.等,Curr.Op.in Immunol. ,20 211-220 (2008)) 由图2的结果可证明若对来自脐带血的白细胞基于特定表面抗原进行选择,在适当条件下进行刺激和扩增,则可大量地得到以特定等位基因的HLA-A限制性而特异性地识别癌抗原的细胞毒性T细胞在本实施例中,WTl肽未被用于细胞毒性T细胞的增殖刺激,但是得到了特异性地识别来自WTl的肽的细胞毒性T细胞,这有可能是由于WTl在脐带血白细胞中进行表达,在用于培养的淋巴细胞中含有分化成树突状细胞的细胞,因此在培养过程中WTl被作为抗原从树突状细胞呈递给细胞毒性T细胞在脐带血中存在不在成人外周血中存在的受到胸腺选择前的未成熟的CD4阳性CD8阳性T细胞群,这是对脐带血特异性的细胞群在抗原特异性地活化(引发)幼稚T细胞中,需要树突状细胞,但为如WTl之类的在正常细胞中也进行表达的自体蛋白时,受到胸腺选择前的未成熟的CD4阳性CD8阳性自体反应性记忆细胞已经存在于脐带血中,因此存在从这些细胞群中扩增WTl特异性细胞毒性T细胞的可能性在成人中,这些细胞群作为自体反应性克隆已在胸腺选择阶段被除去,因此在成人外周血的扩增中无法得到,而可仅由脐带血进行调整本实施例的实验在世界上首次示出可仅由脐带血调整该细胞群
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专利名称:含有短暂性存活ctl的医药品组合物的制作方法脐带血造血干细胞移植(UmbilicalCord Blood Hematopoietic Cell Transp 1 antation,以下称为“UCBHCT ”)为对患有急性骨髓性白血病或其它白血病、再生障碍性贫血或其它造血障碍、先天性免疫缺陷、先天性代谢异常、EBV感染症等的小儿和成人有效的治疗法(非专利文献1)。脐带血库制度已在各国普及,该脐带血在得到组织相容性的检测数据的基础上进行冷冻保存,因此UCBHCT成为当今最为普及的干细胞移植疗法。已知在UCBHCT中,一般而言,对于HLA-A、HLA-B和DRBl基因座,在6个抗原中含有4 6个接受移植的小儿患者的匹配型与非血缘脐带血的匹配型一致的抗原时,即,在含有0 2个患者的匹配型与脐带血的匹配型不一致的抗原时,大部分移植成功(非专利文献2和3)。 移植细胞永久地存活于作为宿主的患者体内。另一方面,过继性免疫疗法(Adoptive Cell "Transfer,以下称为“ACT”)最近作为治疗效果最高的癌症治疗法而受到关注(非专利文献4)。ACT为在存在白细胞介素2的情形下大量培养浸润在肿瘤组织中的患者自身(自体)淋巴细胞、疾病相关抗原在试管内经敏化的患者自身淋巴细胞,移植给经实施淋巴细胞除去的患者的治疗法。例如,关于转移性黑色素瘤,已报道在经实施使用肿瘤浸润淋巴细胞的自体淋巴细胞输液的大约50%的病例中客观上肿瘤消退。非专利文献非专利文献 1 =Broxmeyer, H. E.禾口 Smith,F. 0. ,"Thomas,Hematopoietic Cell Transplantation,,,4th ed. , Appelbaum, F. R.等编,Blackwell Publishing, ISBN 9781405153485 (2009),第 39 章,pp559_576非专利文献 2 :Gluckman,E.禾口 Rocha,V.,Curr. Opin. Immunol.,18 565-570(2006)非专利文献3 =Brunstein, C. G.等,Br. J. Haematol.,137 20-35 (2007)非专利文献 4 :Rosenberg,S. A.等,Nature Reviews Cancer 8,299-308(2008)
UCBHCT容许1或2个不一致抗原,但是仍存在找不到根据患者的HLA基因座的匹配型而适于移植的供者脐带血的情形。另外,存在由于供者脐带血被归入涉及重症GVH病与生存的不匹配HLA型的组合而不适于移植的情形。进而,即使用UCBHCT在患者中成功地永久存活,也存在下次发生移植物抗宿主疾病(以下称为“GVH病”)的情形。另外,与骨髓移植、外周血干细胞移植的情形相比,UCBHCT的情形发生来自经移植的细胞的白血病(所谓的供者细胞白血病)的危险高。ACT需要针对每位患者制备用于移植的淋巴细胞,该操作是相当劳动密集的且需要专门的技能。另外,在ACT中也存在发生来自经移植的细胞的白血病的危险。进而,无论在UCBHCT中还是在ACT中,均针对每位特定患者制备移植细胞,因此有可能因在无法检出如朊病毒之类难以检出的病原体的状态下进行移植而导致感染症传播。因此,有必要开发一种用于免疫疗法的移植细胞,其能够以与以往用于免疫疗法的移植细胞相比更广范围的患者为对象,并且短暂性地存活,也不引起重症GVH病。本发明提供含有来自人造血干细胞的细胞的医药品组合物。在本发明的医药品组合物中,前述细胞的人HLA I类分子的任一基因座至少含有一个前述细胞的匹配型与患者的匹配型一致的抗原。另外,前述细胞的人HLA I类和II类分子的基因座至少含有1个前述细胞的匹配型与患者的匹配型不一致的抗原,并且,来自前述造血干细胞的细胞在前述患者体内既不发生永久存活,也不引起重症度为III或IV的急性GVH病。本发明的医药品组合物存在以下情形在除去前述患者的淋巴细胞后给予,虽然在前述患者体内短暂性地存活,但是伴随着前述患者的淋巴细胞再增殖而消失。在本发明的医药品组合物中存在以下情形前述细胞的人HLA I类分子的基因座为HLA-A和HLA-B,前述细胞的人HLA II类分子的基因座为DRB1,前述细胞的HLA-A、 HLA-B, HLA-C和DRBl抗原基因座至少含有1个前述细胞的匹配型与患者的匹配型不一致的抗原,并且,来自前述造血干细胞的细胞在前述患者体内既不发生永久存活,也不引起重症度为III或IV的急性GVH病。在本发明的医药品组合物中存在以下情形前述细胞的HLA-A、HLA_B和DRBl抗原基因座含有5 6个前述细胞的匹配型与患者的匹配型不一致的抗原,并且,来自前述造血干细胞的细胞在前述患者体内既不发生永久存活,也不引起重症度为III或IV的急性GVH病。在本发明的医药品组合物中存在以下情形前述人造血干细胞为脐带血干细胞。在本发明的医药品组合物中存在以下情形来自前述人造血干细胞的细胞为对人 HLA I类分子限制性表位特异性的细胞毒性T细胞。本发明的医药品组合物存在用于癌症治疗的情形。本发明的医药品组合物存在用于感染症治疗的情形。在本发明的用于癌症治疗的医药品组合物中存在以下情形对前述人HLA I类分子限制性表位特异性的细胞毒性T细胞未受到利用前述人HLA I类分子限制性表位的刺激地得到扩增。在本发明的用于癌症治疗的医药品组合物中存在以下情形前述细胞的HLA-A基因座至少含有1个前述细胞的匹配型与患者的匹配型一致的抗原,前述细胞毒性T细胞对 Wilms瘤致病基因产物(WTl)具有特异性。本发明提供含有来自人脐带血的细胞毒性T细胞的医药品组合物。在本发明的含有细胞毒性τ细胞的医药品组合物中,前述细胞毒性T细胞对HLA-A、HLA-B和HLA-C中的任一种基因座的HLA I类分子限制性表位具有特异性,对前述人HLA I类分子限制性表位特异性的细胞毒性T细胞未受到利用前述人HLA I类分子限制性表位的刺激地得到扩增,前述细胞的任一种基因座的HLA I类分子至少含有1个前述细胞的匹配型与患者的匹配型一致的抗原,前述细胞的HLA-A、HLA-B和DRBl基因座含有5 6个前述细胞的匹配型与患者的匹配型不一致的抗原,并且,来自前述造血干细胞的细胞在前述患者体内既不发生永久存活,也不引起重症度为III或IV的急性GVH病。本发明提供用于癌症治疗的医药品组合物的制造方法,为本发明的用于癌症治疗的医药品组合物,对前述人HLA I类分子限制性表位特异性的细胞毒性T细胞未受到利用前述人HLA I类分子限制性表位的刺激地得到扩增。前述制造方法包括用⑶3/^拟8免疫珠刺激人脐带血的步骤。本发明提供感染症或者癌症的治疗方法。本发明的感染症或者癌症的治疗方法, 其特征在于,包括准备来自人造血干细胞的细胞的步骤和将来自前述人造血干细胞的细胞移植给患者的步骤;前述细胞的人HLAI类分子的任一基因座至少含有前述细胞的匹配型与患者的匹配型一致的抗原;以及前述细胞的人HLA I类和II类分子的基因座的抗原至少含有1个前述细胞的匹配型与患者的匹配型不一致的抗原,并且,来自前述造血干细胞的细胞在前述患者体内既不发生永久存活,也不引起重症度为III或IV的急性GVH病。在本发明的感染症或者癌症的治疗方法中存在以下情形其特征在于,包括在将前述细胞移植给患者的步骤前除去前述患者的淋巴细胞的步骤,以及来自前述人造血干细胞的细胞在前述患者体内短暂性地存活,但伴随着前述患者的淋巴细胞再增殖而消失。在本发明的感染症或者癌症的治疗方法中存在以下情形其特征在于,来自前述造血干细胞的细胞的人HLA I类分子的任一基因座选自HLA-A、HLA-B和HLA-C,前述人HLA II类分子的基因座为DRBl ;以及前述人HLA I类和II类分子的基因座的抗原至少含有1 个前述细胞的匹配型与患者的匹配型不一致的抗原,并且,来自前述造血干细胞的细胞在前述患者体内既不发生永久存活,也不引起重症度为III或者IV的急性GVH病。在本发明的感染症或者癌症的治疗方法中存在以下情形其特征在于,前述细胞的HLA-A、HLA-B和DRBl基因座的抗原含有5 6个前述细胞的匹配型与患者的匹配型不一致的抗原,并且,来自前述造血干细胞的细胞在前述患者体内既不发生永久存活,也不引起重症度为III或IV的急性GVH病。本发明的感染症或者癌症的治疗方法中存在以下情形前述人造血干细胞为脐带血干细胞。在本发明的感染症或者癌症的治疗方法中存在以下情形来自前述人造血干细胞的细胞为对人HLA I类分子限制性表位特异性的细胞毒性T细胞。在本发明的感染症或者癌症的治疗方法中存在以下情形准备来自前述人造血干细胞的细胞的步骤包括未受到利用前述人HLA I类分子限制性表位的刺激地扩增对该人 HLA I类分子限制性表位特异性的细胞毒性T细胞的步骤。在本发明的感染症或者癌症的治疗方法中存在以下情形未受到利用前述人HLA I类分子限制性表位的刺激地扩增对该人HLA I类分子限制性表位特异性的细胞毒性T细胞的步骤包括用CD3/CD^免疫珠刺激人脐带血的步骤。在本发明的感染症或者癌症的治疗方法中存在以下情形前述造血干细胞的 HLA-A基因座的至少1个抗原的匹配型与患者的匹配型一致,前述细胞毒性T细胞对Wilms 瘤致病基因产物(WTl)具有特异性。在本发明的感染症或者癌症的治疗方法中存在以下情形来自前述人脐带血的细胞毒性T细胞对HLA-A、HLA-B和HLA-C中的任一种基因座的HLA I类分子限制性表位具有特异性,对前述人HLA I类分子限制性表位特异性的细胞毒性T细胞未受到利用前述人 HLA I类分子限制性表位的刺激地得到扩增,前述细胞的任一种基因座的HLA I类分子至少含有1个前述细胞的匹配型与患者的匹配型一致的抗原,前述细胞的HLA-A、HLA-B和DRBl 基因座含有5 6个前述细胞的匹配型与患者的匹配型不一致的抗原,并且,来自前述造血干细胞的细胞在前述患者体内既不发生永久存活,也不引起重症度为III或IV的急性GVH 病。本发明的技术范围基于所附专利保护范围的记载而定。以不脱离本发明的主旨为条件,可对本发明进行改变,例如对本发明的构成要件进行追加、删除和取代。本发明的人造血干细胞包括脐带血、骨髓和给予G-CSF后的外周血,但是还存在来自不限于此的组织的情形。优选的人造血干细胞的来源为脐带血。但是,也可以为由胚性干细胞、成体干细胞和人工多能性干细胞(iPQ生成的造血干细胞。本发明的来自人造血干细胞的细胞包括T细胞、NK细胞、树突状细胞、B细胞、巨噬细胞,以及嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或其它粒细胞。本发明的来自人造血干细胞的细胞有时为将脐带血、骨髓和给予G-CSF后的外周血中所含的造血干细胞进行分化诱导而生成的,还有时为从胚性干细胞、成体干细胞和人工多能性干(iPQ细胞直接进行分化诱导而生成的。有时在确定HLA I类和II类分子的基因座的抗原的匹配型的基础上,预先冷冻保存包含脐带血或其它造血干细胞的组织,确定患者的HLA I类和II类分子的基因座的抗原的匹配型,然后将具有满足本发明要件的匹配型的前述组织解冻,给与增殖刺激,进行培养,从而生成本发明的来自人造血干细胞的细胞。作为替代法,有时预先给予增殖刺激,进行培养,从而生成本发明的来自人造血干细胞的细胞,将其在扩增后进行冷冻保存。在为后一情形时,因为被预先大量扩增,所以能够向患者给予可预先确认药效的细胞。另外,能够向1人以上的患者给予均一品质的细胞。在HLA I类分子中有HLA-A、HLA-B和HLA-C这3种。HLA I类分子的各个基因座的基因及其产物存在非常多的多态(polymorphism)。HLA I类分子具有将肽抗原呈递给细胞毒性T细胞的功能,另一方面,作为在同种间的组织移植时的自体-非自我识别基础的免疫原,还起到引起宿主细胞攻击移植细胞的HVG反应和移植细胞攻击宿主细胞的GVH反应的作用。从作为涉及所述组织相容性的免疫原的观点看,对于人的各个基因座,由分别来自母亲与父亲的2条染色体编码而得的2个基因产物被作为分别的抗原而加以区别。艮口, HLAI类分子的各个基因座具有2个抗原,HLA I类分子的全部基因座具有6个抗原。因此, 在表示HLA的匹配度时,将仅1个基因座的1个抗原的匹配型不同的情形表达为“1个抗原不一致”、将1个基因座的1个或者2个抗原的匹配型不同的情形表达为“1个座不一致”。 即,“1个座不一致”包括1个抗原不一致和2个抗原不一致的情形。同样地,“2个座不一致”包括2 4个抗原不一致的情形。另外,对于3个基因座,在5个或者6个抗原不一致时,3个座均不一致。在本说明书中,匹配型有时通过血清学检测或者DNA检测而确定。DNA检测中有荧光微珠法(PCR-rsso法)之类的中等程度分辨率方法、SBT法之类的高分辨率方法。在匹配型中,除了所谓的4位等位基因名称以外,还有考虑到翻译区域中的碱基取代的6位等位基因、考虑到非翻译区域中的碱基取代的8位等位基因。6位或者8位等位基因为不伴随氨基酸变化的多态,所以在免疫学上可与4位等位基因同样处理。HLA II类分子有HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ这样的3种异二聚体。构成各个异二聚体的α链和β链由染色体上邻接的基因座编码,但是仅存在2条HLA-DR的β链。因此,HLA 11类分子的基因座有0以、01 1、01 2、0 4、0 8、004和008这7个座。HLA II类分子具有将肽抗原呈递给辅助性T细胞的功能,另一方面,与HLA I类分子相同,作为在同种间组织移植时的自体-非自我识别基础的免疫原,还起到引起宿主细胞攻击移植细胞的 HVG反应和移植细胞攻击宿主细胞的GVH反应的作用。HLA II类分子的基因座的基因及其产物中也与HLA I类分子同样存在非常多的多态(polymorphism)。在本说明书中,短暂性存活是指从移植开始经过1个月后,移植细胞还能够在宿主体内,例如外周血中检出,但是在3个月后、6个月后、12个月后或者18个月后无法检出。 永久存活是指在宿主生存期间能够一直在宿主体内检出移植细胞。在此,移植细胞的检出可使用PCR法等的基因检测;FISH法、染色体分析等的染色体检测;使用抗HLA抗体的流式细胞术等的细胞免疫组织化学检测法。在本说明书中,重症度为III或IV的急性GVH病是指在1994年举办的有关急性GVH病的重症度的会议中提出的、Prez印iorka,D.等(Bone Marrow Transplant. , 15 825-855(2002))中记载的重症度分类的4个阶段等级中最严重的阶段和与其连续的阶段。 在万一发生GVH病时,可在移植本发明的医药品组合物前,从患者采血,利用白细胞去除术进行精制分离而冷冻保存,将所得淋巴细胞预先冷冻保存,利用白细胞介素2和/或CD3/ CD^对其进行刺激扩增,再返回给患者(自体淋巴细胞输液),从而进行治疗。已知HLA I类分子和II类分子基因座的抗原的不一致带给造血干细胞移植的影响因基因座不同而异,因被移植的干细胞的细胞数即给予量不同而异。一般而言,对于 HLA-A、HLA-B和DRBl基因座,在6个抗原中含有4 6个接受移植的小儿患者的匹配型与非血缘脐带血的匹配型一致的抗原时,即含有0 2个患者的匹配型与脐带血的匹配型不一致的抗原时,大部分移植成功(日本脐带血库网络·移植数据管理小委员会,“我国的非血缘者间脐带血移植的成果(2007年度分析结果)”、https://www. j-cord. gr. jp/ ja/wnew/isyokuseiseki2007. pdf, Gluckman, Ε.禾口 Rocha, V. , Curr. Opin. Immunol. ,18 565-570(2006),Brunstein, C. G.等,Br. J. Haematol.,137 :20-35 (2007))。前述日本脐带血库网络·移植数据管理小委员会的报告书中记载了对青年成人ALL患者进行1 4个抗原不一致的脐带血移植,结果术后500天的无事件生存率(ER5)为20 56%,但是进行 5个抗原不一致的脐带血移植的2名患者的术后500天的无事件生存率为0的数据(图 5-35)。由该结果启示不一致抗原有5个时,既不发生永久存活,也不引起重症度为III或者IV的急性GVH病。另一方面,有报告称对重症中子暴露患者移植脐带血时,即使移植仅 DRBl基因座的1个抗原不一致的脐带血,在移植后第51天来自经移植的脐带血的单核细胞无论从外周血还是从骨髓中均消失(Nagayama,H.等,Bone Marrow Transplant. ,29 197-204(2002))。由该结果显示出在存在至少1个不一致抗原时,既不发生永久存活,也不引起重症度为III或者IV的急性GVH病。因而,对于本发明的细胞的HLA-A、HLA-B和DRBl基因座,至少含有1个该细胞的匹配型与患者的匹配型不一致的抗原时,脐带血移植领域的专家能够确定来自脐带血的细胞在前述患者体内既不发生永久存活、也不引起重症度为III或者IV的急性GVH病的条件。对于本发明的细胞的HLA-A、HLA-B和DRBl基因座,更优选含有4、5或者6个该细胞的匹配型与患者的匹配型不一致的抗原。本发明的医药品组合物即使为来自1个供者的细胞,也能够移植给与以往相比格外广范围的患者。另外,能够制备有药效的细胞,例如能够由单一的脐带血制备对各种疾病相关抗原特异性的细胞毒性T细胞。因此,可通过准备与以往的脐带血库、骨髓库相比小规模的库而适用于许多不同患者的各种疾病。本发明的来自造血干细胞的细胞包括能够分化成树突状细胞和细胞毒性T细胞的任何细胞类型。即,包括淋巴系统共同前体细胞、树突状细胞、CD4和CD8两者均未表达的所谓双阴性T细胞、⑶4和⑶8两者均未表达的所谓双阳性T细胞、及⑶8阳性T细胞, 除此以外,还包括由桂和河本提出的骨髓-淋巴系统共同前体细胞、骨髓-τ细胞共同前体细胞和巨噬细胞-T细胞共同前体细胞,但并不限于此。为了准备本发明的来自造血干细胞的细胞,可以使用本技术领域的专家所知的各种步骤。例如,在从脐带血中分离白细胞时,可使用Ficoll比重离心法。在从前述白细胞中分离T细胞时,可使用免疫磁珠而分离精制表达细胞表面抗原CD3、CD14和/或CM8 的细胞,该免疫磁珠包括hvitrogen公司的Dynal珠(商标)、Miltenyi Biotec公司的 CliniMACS(商标),但不限于此。作为用于培养所得细胞的培养基,可以使用XVivol5培养基或其它适于淋巴细胞等血液系统细胞的增殖的无血清培养基。在该培养基中,有时添加可从BioWhittaker公司等获得的人AB型血清(O 15 %)、可从日本红十字会获得的献血者血清白蛋白(O 10%)。另外,有时添加细胞增殖因子,该细胞增殖因子包括可从 Peprotech公司等获得的白细胞介素2 (O 10000IU/mL)、白细胞介素15(0 100ng/mL) 和/或白细胞介素21 (O lOOng/mL),但不限于此。增殖刺激剂可为hvitrogen公司等的⑶3/^拟8珠。此时,本发明的来自人造血干细胞的细胞能够不利用HLA I类分子限制性表位地受到增殖刺激。作为替代法,本发明的来自人造血干细胞的细胞能够受到利用HLA I类分子限制性表位的增殖刺激。例如,作为 HLA I类分子限制性表位,已知由CMTWNQMNL(序列号1)的氨基酸序列构成的低聚肽(HLA-A * 2402限制性的来自WTl的肽片段)、由ADVEFCLSL(序列号2)或者SADVEFCLSL (序列号 3)的氨基酸序列构成的低聚肽(HLA-B * 4002限制性的来自酪氨酸酶的肽片段)、由癌抗原NY-ES0-1的第81 110位氨基酸序列构成的低聚肽(HLA-B * 3501或者HLA-C * 0304 限制性肽片段)这样的癌特异性肽;EB病毒、巨细胞病毒、艾滋病病毒或其它病毒的蛋白质或其肽片段。在添加有所述蛋白质或者肽的培养基中,本发明的来自人造血干细胞的细胞可例如通过培养对由脐带血的白细胞精制而得的细胞表面抗原CD3、CD14和/或CD^进行表达的细胞而进行利用HLA I类分子限制性表位的增殖刺激。利用HLA I类分子限制性表位的增殖刺激也可通过与来自脐带血的树突状细胞的共培养而加以实施,所述来自脐带血的树突状细胞经过与由癌细胞、病毒或其它病原体感染的细胞的溶解物进行共培养,但并不限于此。经增殖刺激的细胞有时在存在5 7% (X)2的情形下于37°C进行培养。细胞有时以 1 X IO6个/mL的浓度进行播种,2 4天后进行培养基更换,在新的培养基上以1 X IO6个/mL的浓度进行播种。在总数为IX IO8个以上的大量培养的情形下,有时使用GE Healthcare 公司的WAVE Bioreactor 2/10(商标)这样的装置。本发明的医药品组合物除含有来自前述人造血干细胞的细胞以外,作为用于在患者血管内进行移植的细胞制剂,还可含有在药学上容许的任何成分。在冷冻保存状态下运输本发明的医药品组合物时,有时含有在解冻时可得到足够量的有效细胞毒性T细胞作为移植用细胞制剂这样的冷冻保存液。本发明的医药品组合物有时在除去患者的淋巴细胞后进行移植。这是因为与普通的过继性免疫疗法(Adoptive Cell Transfer,ACT)相同,为了避免围绕本发明的医药品组合物所含的细胞增殖所需的细胞因子(白细胞介素7、白细胞介素15等)而与患者的淋巴细胞进行竞争,以及为了避免因与患者的淋巴细胞之间的细胞间相互作用而导致本发明医药品组合物中所含细胞的活性降低。除去患者淋巴细胞的方法包括给予环磷酰胺(例如 60mg/kg, 2天)、氟达拉滨(例如25mg/m2, 5天),和/或给予放射线照射(例如2或12Gy) 与白细胞介素2 (每8小时7. 2 X 105IU/kg, 2 3天),但并不限于此。如下面的实施例所示,本发明的医药品组合物含有对脐带血细胞的HLA-A限制性癌抗原WTl肽特异性的细胞毒性T细胞。因而,本发明的医药品组合物可在移植给就HLA-A 基因座而言至少具有1个与脐带血相同的匹配型的抗原的患者时,攻击过度表达WTl的患者的癌细胞。除此以外,目前还已知能够在试管内扩增对其他抗原特异性的细胞毒性T细胞, 以及若将所述细胞毒性T细胞移植给患者,则可获得临床效果。例如,Godet,Y.等(Cancer Immunol, Immunother. ,58 :271-280(2009))得到了对来自黑色素瘤特异性癌抗原酪氨酸酶的HLA-B限制性肽特异性的细胞毒性T细胞。Straathof, K. C. M.等(Blood, 105 1898-1904(2005))将对EB病毒相关抗原LMP2的HLA-B限制性表位、EB病毒相关抗原EBNAl 的HLA-B限制性表位、EB病毒相关抗原EBNA3的HLA-B限制性表位、EB病毒相关抗原BZLFl 的HLA-B限制性表位等特异性的CTL移植给EB病毒相关鼻咽癌患者,获得了临床效果。 Walter, Ε. Α.等(N. Engl. J. Med.,333 :1038-44(1995))将巨细胞病毒(CMV)特异性 CTL 移植给为了治疗白血病而从CMV阳性血缘者接受骨髓移植后在给予免疫抑制剂期间CMV经再活化的患者,获得了临床效果。应予说明,根据Bioley G.等(Clin. Cancer Res. 15 :299-306 Q009)),从接种有癌抗原NY-ES0-1的患者得到对来自该抗原的HLA-B或者HLA-C限制性肽特异性的细胞毒性T细胞。因此,细胞毒性T细胞不仅对来自WTl蛋白的肽这样的HLA-A限制性表位具有特异性,还可以对HLA-B或者HLA-C限制性表位具有特异性。在本发明的医药品组合物中,来自人造血干细胞的细胞的人HLA I类分子的任一基因座至少含有一个前述细胞的匹配型与患者的匹配型一致的抗原。因此,在患者细胞表达疾病相关抗原,例如表达癌抗原、来自病原体的抗原时,该疾病相关抗原可与人HLA I类分子一起被呈递给本发明的医药品组合物的细胞毒性T细胞。即,本发明的医药品组合物通过与患者共同的HLA I类分子基因座等位基因的环境而识别前述疾病相关抗原,特异性地攻击表达该疾病相关抗原的患者的细胞。患者细胞表达的疾病相关抗原存在为在癌细胞中(过度)表达的抗原的情形,以及为在感染细胞中表达的抗原的情形,其中,所述癌细胞中(过度)表达的抗原为例如包括WT1、酪氨酸酶、NY-ESO-U CEA、NSE、PSA、gplOO、MART-I和MAGE-3但不限于此的肿瘤相关抗原,以及EBER、LMP-I等的EB病毒相关抗原;所述在感染细胞中表达的抗原为例如包括 CMV gp65等巨细胞病毒特异性抗原、HIV gpl60等艾滋病病毒特异性抗原但不限于此的病毒特异性抗原。因而,本发明的医药品组合物存在用于癌症治疗的情形,以及存在用于感染症治疗的情形。图1表示来自脐带血的CD3阳性细胞的增殖条件的研究结果的图表。图2为利用APC标记抗人CD8小鼠单克隆抗体和PE标记HLA-A * 2402WT1 (wild) CMTWNQMNL-四聚物对来自经免疫珠刺激、经14天培养扩增而得的脐带血的⑶3阳性细胞进行双重染色而得的流式细胞术分析图。


本发明开发一种用于免疫疗法的移植细胞,其能够以与以往的用于免疫疗法的移植细胞相比更广范围的患者为对象,并且短暂性地存活,也不引起重症GVH病。本发明提供含有来自人造血干细胞的细胞的医药品组合物。在本发明的医药品组合物中,前述细胞的人HLA I类分子的任一基因座至少含有1个前述细胞的匹配型与患者的匹配型一致的抗原。另外,前述细胞的人HLA I类和II类分子的基因座至少含有1个前述细胞的匹配型与患者的匹配型不一致的抗原,并且,来自前述造血干细胞的细胞在前述患者体内既不发生永久存活,也不引起重症度为III或IV的急性GVH病。



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