专利名称：使用包含抗体-受体组合的多特异性结合蛋白的组合物和方法使用包含抗体-受体组合的多特异性结合蛋白的组合物和方法血管发生是从现有血管形成新血管。其在发育中起必要作用。在成人中，血管发生在创伤愈合过程中发生以在损伤或创伤后对组织恢复血流。血管发生也在肿瘤形成和其它疾病，包括类风湿性关节炎，动脉粥样硬化，牛皮癣，糖尿病性视网膜病和黄斑变性中起重要作用。(参见，例如，Fan 等人，Trends Pharmacol. Sci. 16 :57,1995 ；Folkman, Nature Med. 1 27,1995)。生理或病理条件下新血管的生长需要血管发生的活化剂和抑制剂的协调作用。血管发生的活化剂包括血管内皮生长因子-A(VEGF-A)，成纤维细胞生长因子(FGFs)，胎盘生长因子(PlGF)，和肝细胞生长因子(HGF)和一些细胞因子如白介素-8 (IL-8)。血管发生的内源性抑制剂包括血小板反应蛋白、内皮他丁、血管他丁和白介素-12。血管发生的活化剂和抑制剂之间的平衡生理和病理血管发生过程中向活化剂倾斜。VEGF-A为生理和病理血管发生的关键调节剂。其通过调节内皮细胞的增殖、迁移和存活在血管的规格、形态形成、分化和体内稳态方面起到重要作用。(参见，例如，Ferrara 等人，Nat Med 9:669,2003·)。研究表明VEGF-A在多种人肿瘤中高度表达。(参见，例如， Ellis和Hicklin，Nat. Rev. Cancer 8 :579,2008)。VEGF-A表达通过低氧诱导因子 1 (HIF-1) 转录因子调节。(参见，例如，Wang*kmenza，J.Biol. Chem. 270 :1230,1995) 肿瘤细胞的快速增殖和差的血液流动导致肿瘤中的低氧-传导性环境，导致VEGF-A的快速上调。(参见，例如，Brahimi-Horn 禾口 Pouyssegur，Bull. Cancer 93 :E73，2006)。已描述了由不同的mRNA剪接变体编码的121，145，165，189或206个氨基酸长度的5种人VEGF-A亚型(VEGF-A121_2J，它们都能刺激内皮细胞的有丝分裂发生。这些亚型在生物活性、受体特异性、以及对细胞表面及细胞外基质关联的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(该蛋白聚糖作为VEGF-A的低亲和力受体起作用)的亲和力方面不同=VEGF-A121不结合至肝素或硫酸乙酰肝素；VEGF-A145和VEGF-A165 (GenBank Acc. No. M32977)都能结合至肝素；而 VEGF-A189和VEGF-A2tl6对肝素和硫酸乙酰肝素显示最强的亲和力。VEGF_A121、VEGF-A145和 VEGF-A165以可溶形式分泌，尽管大多数VEGF-A165仅限制于细胞表面和细胞外基质蛋白聚糖，而VEGF-A189和VEGF-A2tl6保持与细胞外基质相关联。VEGF-A189和VEGF-A2tl6都可通过被肝素或肝素酶处理释放，这表明这些亚型是通过蛋白聚糖连接于细胞外基质的。细胞结合的VEGF-A189也可被蛋白酶如纤维蛋白溶酶所裂解，导致活性可溶的VEGF-Alltl的释放。 人VEGF-A165是丰度最高而且是有生物活性的形式，它的Asn74被糖基化，并且典型地作为 46kDa的23kDa亚单位同型二聚体表达。已鉴定出了与VEGF-A相互作用的4种细胞表面受体。这些包括VEGFR-I/ Flt-l(fins 状酪氨酸激酶-1 ;GenBank Acc. No. X51602 ；De Vries 等人，Science 255 989-991,1992) ；VEGFR-2/KDR/Flk-l (包含受体 / 胎肝激酶-1 的激酶插入域；GenBank Acc. Nos. X59397 (Flk-I)和 L04947 (KDR) ；Terman 等人，Biochem. Biophys. Res. Comm. 187 1579-1586,1992 ；Matthews 等人，Proc. Natl. Acad. ki. USA 88 :9026-9030, 1991)；神经纤毛蛋白-1 (Gen Bank Acc. No.匪00387；3)，和神经纤毛蛋白-2 (Gen Bank Acc. No. NM003872)。VEGF121 和 VEGF165 结合 VEGFR-I ；VEGF121、VEGF145 和 VEGh65 结合 VEGFR-2 ； VEGF165结合神经纤毛蛋白-1 ；而VEGF165和VEGF145结合神经纤毛蛋白_2。(参见，例如， Neufeld等人，FASEB J. 13 :9-22,1999 Jtacker和Achen，Growth Factors 17 :1-11,1999 ； Ortega 等人，Fron. Biosci. 4 141—152，1999 ；Zachary, Intl. J. Biochem. Cell Bio. 30 1169-1174，1998 ；Petrova 等人，Exp. Cell Res. 253 :117-130,1999)。人们对VEGF-A对于几类重要癌症的发生的重要性的认识终于导致了一种人源化VEGF-A单克隆抗体AVASTIN 在最近被批准用于与化学治疗联合治疗转移性结肠直肠癌、非小细胞肺癌和转移性乳腺癌。(参见，例如，Hervitz等人，N. Engl. J. Med. 350 2335-2342,2004 ；Sandler 等人，N. Engl. J. Med. 355 :2542-2550,2006 ；Miller 等人，2008)。 类似的，LUCENTIS (—种人源化单克隆抗体片段)最近被批准用于治疗新生血管(湿型) 年龄相关的黄斑变性(AMD)，这反映了 VEGF-A在新生血管性眼病的发病机理中的重要性。成纤维细胞生长因子(FGFs)为一个肝素结合性生长因子的家族，在哺乳动物中具有22个家族成员(FGF1-14，16-23)。FGF在多种生物功能如细胞增殖、分化、迁移、血管发生和肿瘤发生中起重要作用。它们通过结合、二聚化、并且活化细胞表面FGF受体而发挥它们的多效生物作用。(参见,例如,Eswarakumar等人Cytokine Growth Factor Rev. 16 139-149,2005)。哺乳动物中有四种FGF受体基因，fgfRl_fgfR4。FGFRs的细胞外域包含三个免疫球蛋白状域。FgfRl-FgfR3的膜近端Ig环处的可变剪接产生更多的变体。该环 N-端的一半由不变的外显子(IIIa)编码，且另外一半由选自称为Inb或IIIc的外显子编码。FGF配体和受体的过表达和FGF受体中的突变体与许多类型的癌症相关，所说的癌症包括前列腺、乳腺、卵巢、膀胱、结肠直肠、胰腺、肝、肺、成胶质细胞瘤癌症，多发性骨髓瘤和白血病。(参见例如，Grose 等人，Cytokine Growth Factor Rev. 16 179-186，2005)。 FGFl，2，6，8b，9和17在前列腺肿瘤组织中过表达，且FGF8b和17的表达水平与肿瘤阶段、 级别和预后不良相关(Dorkin 等人，Oncogene 18 :2755-2761,1999 ；Gnanapragasam 等人， Oncogene 21 :5069-5080,2002 ；Heer 等人，J Pathol. 204 :578-586. 2004)。FGF9 促使前列腺癌-诱导的新骨形成且可参与雄激素受体-阴性的前列腺癌在骨中成骨细胞的进展(Li 等人，J Clin Invest. 118 :2697-2710,2008) FGFRl 和 FGFR4 在前列腺肿瘤组织中过表达，且FGFR2IIIb至IIIc的亚型转换促进前列腺癌起始和进展(Giri等人，Clin Cancer Res. 5 :1063-1071,1999 ；Wang等人，Clin. Cancer Res. 10 :6169-6178,2004 ；Kwabi-Addo等人，Prostate 46 :163-172, 2001) FGF1，2，8在乳腺肿瘤组织中过表达。所有乳腺癌中高达8. 7%具有FGFRl基因扩增，且该扩增为整体存活率的独立预测因素。FGFR4过表达与复发性乳腺癌患者的他莫昔芬治疗失败相关(参见，例如，ElsheiW1等人，Breast Cancer Res. 9，2007 ;Meijer 等人，Endocrine-Related Cancer 15 :101-111,2008) FGF1，8，9，18 和FGFRlinc，FGFR2inc, FGFR4在卵巢肿瘤组织中过表达。FGFR3过表达和激活突变在膀胱癌的膀胱上皮细胞癌中有报道。在非侵入性、低等级和阶段的膀胱肿瘤中的FGFR3突变与较高的复发率显著相关。(参见，例如，Knowles，World J. Urol. 25 :581_593，2007)。FGF-2， FGFRl和FGFR2经常在肺的腺癌和鳞状细胞癌中过表达。FGF-2信号途径活化可能是鳞状细胞癌发病的早期现象(Behrens，等人，Clin Cancer Res. 14 :6014-6022,2008) 许多FGF家族成员，包括FGF1，FGF2，FGF4和FGF6，也具有强的体外和体内促血管生成活性，且可通过调节肿瘤血管化而促进肿瘤进展O^esta等人，Cytokine Growth Factor Rev. 16 :159-178，2005)。在血管发生过程中在FGF家族和VEGF家族成员之间存在密切的相互沟通(cross-talk)。在产生自发性胰腺肿瘤的Ripl_Tag2转基因小鼠肿瘤组织中，用抗VEGFR2单克隆抗体阻断VEGF促进缺氧，并且诱导FGFl，FGF2和FGF7的表达 (Casanovas等人，Cancer Cell 8 :299_309，200 。FGF的上调与血管发生的再诱导和逃避 VEGF阻断同时发生。该模型中联合抑制VEGF和FGF信号传递导致进一步的肿瘤抑制，表明 FGF信号途径的上调对于VEGF靶向性治疗后的逃避机理至少部分有帮助。而且，在多种小鼠肿瘤模型(包括T3M4，Panel和QG56异种移植模型)中阻断VEGF和FGF信号显示加和性的或协同性的抗肿瘤作用(Ogawa等人，Cancer Gene Ther. 9 :633_640，2002)。最近，用泛VEGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗的成胶质细胞瘤患者的临床研究显示FGF2的血清水平在复发患者中比在响应阶段中的相同患者的水平高，表明一种类似的涉及FGF2上调的补偿机理(Batchelor 等人，Cancer Cell 11 :83-95,2007) 总之，上述临床前数据和临床数据支持以下观点，即阻止VEGF和FGF信号传递途径二者的联合治疗在许多实体瘤中比单独的VEGF阻断可产生更好的抗肿瘤作用。这些数据为肿瘤学中靶向这两种途径提供了强有力的概念证明性论据(proof-of-conc印t rationale)。阻断这两种途径也可在其它血管发生疾病，包括AMD中提供更好的功效。本发明提供用于所述这些和其它用途的多特异性蛋白，在本文的教导下，其对本领域技术人员将是显而易见的。
本发明提供双特异性结合蛋白，其包含减少VEGF-A和FGF两者的生物活性的抗体/可溶受体双特异性结合蛋白。根据本发明，该双特异性结合蛋白包含抗VEGF-A抗体 (VEGF-A抗体)部分的VEGF-A结合区和FGF受体的TOF结合部分，如本文所述。本文所述的FGF结合部分通常为可溶FGF受体(FGFR)。本发明在某些实施方案中提供，该双特异性结合蛋白的可溶FGF受体部分包含本文所述的FGFR3或FGFR2的FGF受体部分。在其它实施方案中，Fc多肽融合至FGFR的C-端。在某些实施方案中，该FGF结合部分和VEGF-A结合部分为使用肽或多肽接头序列融合的多肽，并且在这些情况下，编码所述实施方案的多核苷酸可表达为单一双特异性结合蛋白。本发明还提供，双特异性结合蛋白的某些实施方案包含本文所述的VEGF-A抗体部分。该VEGF-A抗体部分可进一步由本文所述的scFV多肽或VL和VH多肽构成。在某些实施方案中，该FGF结合部分为FGF受体部分，且可为FGFR3，特别是本文所述的FGFR3in。。在某些实施方案中，双特异性抗体/可溶受体蛋白质包含FGF受体部分，其为选自以下的 FGFR3 :SEQ ID NO 13 所示的 FGFR3m。(23-375)，SEQ ID NO :2 所示的 FGFR3mj23-375) (S249W)，SEQ ID NO :19 所示的 FGFR3IIIc(143-375)，SEQ ID N0: 10 所示的 FGFR3IIIC (143-375) (S249W)，SEQ ID NO 15 所示的 FGFR3mj23-375) (P250R)， 和SEQ ID NO 22所示的FGFR3IIIc(143-375) (P250R)，以及选自以下的VEGF-A抗体部分 SEQ ID NO 44 所示的 c870. Ie6 scFV, SEQ ID NO :46 所示的 cl094. 1 scFV, SEQ ID NO 52所示的c870scFV，和SEQ ID NO :70所示的cl039scFV。在其它实施方案中，双特异性抗体/可溶受体组合包含FGF结合部分，其为选自以下的FGFR3 :SEQ ID NO :13所示的 FGFR3IIIC (23-375)，SEQ ID NO 2 所示的 FGFR3mj23_375) (S249W)，SEQ ID NO 19 所示的 FGFR3IIIC (143-375)，SEQ ID NO 10 所示的 FGFR3IIIc (143-375) (S249W)，SEQ ID NO 15 所示的 FGFR3IIIC (23-375) (P250R)，和 SEQ ID NO 22 所示的 FGFR3nic; (143-375) (P250R)，和选自以下的VEGF-A结合部分SEQ ID NO :48所示的c870VL和SEQ ID NO 50所示的VH，SEQ ID NO 54 所示的 C1094VL 和 SEQ ID NO 56 所示的 VH，以及 SEQ ID NO 66 所示的 1039VL 和 SEQ ID NO 68 所示的 VH0在其它实施方案中，本发明的双特异性结合蛋白包括FGFR3部分和VEGF-A抗体部分，其选自 FGFR3 (143-375) (S249W) Fc5cl094. lpZMP31(SEQ ID NO :58) ；FGFR3 (23-375) (S249ff)Fc5cl094. 1ρΖΜΡ31 (SEQ ID NO :60) ；FGFR3 (143-375) (S249ff)Fc5 c870e6 pZMP31(SEQ ID NO :62)；和 FGFR3 Q3-375) (S249W) Fc5 c870e6 pZMP31(SEQ ID NO :64)。在其它实施方案中，该FGF结合部分为FGFR2。在某些实施方案中，该FGFR2 包括FGFR2m。。在某些实施方案中，双特异性抗体/可溶受体组合包含FGF结合部分， 其为选自以下的FGFR2 =SEQ ID NO』4所示的I7GFI^lllc (22-377)，SEQ ID NO』9所示的 FGFR2IIIC (22-377) (S252W)，SEQ ID NO 33 所示的 FGFR2IIIc (22-377) (P253R)，SEQ ID NO 37 所示的 FGFR2IIIC (145-377)，SEQ ID NO 40 所示的 FGFR2IIIc(145-377) (S252W)， 和 SEQ ID NO 42 所示的 FGFR2IIIc(145-377) (P253R)；和选自以下的 VEGF-A 结合部分 SEQ ID NO 44 所示的 c870. Ie6 scFV, SEQ ID NO :46 所示的 cl094. IscFV, SEQ ID NO 52所示的c870scFV，和SEQ ID NO :70所示的cl039scFV。在其它实施方案中，双特异性抗体/可溶受体组合包含FGF结合部分，其为选自以下的FGFR2 :SEQ ID NO : 所示的 FGFR2IIIC (22-377), SEQ ID NO : 所示的 FGFR2m。(22-377) (S252W), SEQ ID NO :33 所示的 FGFR2IIIC (22-377) (P253R)，SEQ ID NO 37 所示的 FGFR2IIIc(145-377)，SEQ ID NO 40 所示的 FGFIi2111c (145-377) (S252W)，和 SEQ ID NO 42 所示的 FGFR2IIIc (145-377) (P253R)；和选自以下的VEGF-A结合部分SEQ ID NO :48所示的c870VL和SEQ ID NO 50所示的VH，SEQ ID NO 54 所示的 C1094VL 和 SEQ ID NO 56 所示的 VH，以及 SEQ ID NO 66 所示的 1039VL 和 SEQ ID NO 68 所示的 VH0在其它方面，本发明提供使用本文所述的双特异性抗体/可溶受体结合蛋白的方法。在某些实施方案中，该双特异性抗体/可溶受体结合蛋白可给予受试者以治疗以实体瘤生长为特征的癌症，如前列腺癌，乳腺癌，胰腺癌，肾细胞癌(RCC)，结肠直肠癌，成胶质细胞瘤，非小细胞肺癌(NSCLC)和胃肠道间质瘤(GIST)。本发明的这些和其它方面在参考以下发明详述和附图后将会是明显的。定义除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的所述方法和组合物的意思相同的意思。如本文所述，以下术语和短语具有属于它们的意思，除非另有所述。“多肽”为通过肽键结合的氨基酸残基的聚合物，无论天然或合成产生的。少于约 10个氨基酸残基的多肽通常称为“肽”。“蛋白质”为包含一个或多个多肽链的大分子。蛋白质也可包含非肽组分，如碳水化合物基团。碳水化合物和其它非肽取代基可通过产生蛋白质的细胞添加至蛋白质，且将随着细胞的类型而改变。蛋白质在此根据它们的氨基酸主链结构定义；取代基如碳水化合物基团通常没有规定，但仍然可存在。术语“氨基-端”和“羧基-端”在本文使用以表示多肽中的位置。当上下文允许时，这些术语用于以具体的多肽序列或的部分为参考表示近似或相关的位置。例如，位于多肽中相关序列的羧基-端的某一序列是与该相关序列的羧基端相邻，而不一定位于完整多肽的羧基端。如本文所述，“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，寡核苷酸，聚合酶链反应(PCR)产生的片段，和连接、分裂、核酸内切酶作用，和核酸外切酶作用中的任一种产生的片段。核酸分子可由单体构成，该单体为天然存在的核苷酸(如DNA和RNA)，或天然存在的核苷酸的类似物(例如，天然存在的核苷酸的α-对映体形式)，或两者的组合。修饰的核苷酸可在糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱基部分具有变化。糖修饰包括，例如，用卤素、烃基、胺和叠氮基代替一个或多个羟基，或糖可官能化为醚或酯。而且，整个糖部分可用立体上和电子上类似的结构，如氮杂-糖和碳环的糖类似物代替。碱基部分的修饰的实例包括烃基化嘌呤和嘧啶、酰基化嘌呤或嘧啶，或其它众所周知的杂环的代替物。核酸单体可通过磷酸二酯键或此类键的类似物连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，硒代磷酸酯，硒代磷酸酯，苯胺基硫代磷酸酯 (phosphoroanilothioate)，苯胺基磷酸酯(phosphoranilidate)，氨基磷酸酯，等。术语“核酸分子”也包括所谓的“肽核酸”，其包括连接至聚酰胺主链的天然存在的或修饰的核酸碱基。核酸可为单链或双链。如本文所述，术语“拮抗剂”表示在某个生物环境中减少另一化合物的活性的化合物。例如，VEGF-A拮抗剂为减少VEGF-A的生物活性的化合物，且FGFR拮抗剂为减少FGF 的生物活性的化合物。因为VEGF-A和FGF两者的活性取决于多种分子(包括配体、受体和信号转导物)的相互作用，拮抗剂可通过直接作用于VEGF-A或FGF，或通过作用于同源生物途径中的另一分子来减少活性。例如，FGF拮抗剂可通过以下方式减少FGF活性，例如， 通过结合至受体本身，通过结合至其配体之一，通过干扰受体二聚体化，或通过干扰受体磷酸化。拮抗剂包括但不限于抗体、可溶受体、和结合至配体或其受体，或以其他方式干扰配体-受体相互作用和/或其它受体功能的非蛋白质化合物。术语"受体"表示细胞相关的蛋白质，其结合至生物活性分子(即，配体)且介导配体对细胞的作用。膜结合的受体以多域或多肽结构为特征，其包含细胞外配体-结合域和通常在信号转导中涉及的细胞内效应物结构域。配体与受体的结合导致受体中构象变化，导致效应物结构域和细胞中其它分子的相互作用。该相互作用进而导致细胞中代谢变化。与受体-配体相互作用相关的代谢事件包括基因转录、磷酸化、脱磷酸化、环状AMP产生的增加、细胞钙动员、膜脂质动员、细胞粘附、肌醇脂质的水解和磷脂的水解。通常，受体可为膜结合的、可溶的或核内的；单体的(例如，甲状腺刺激激素受体，肾上腺素能受体) 或多聚体的(例如，PDGF受体、生长激素受体、IL-3受体、GM-CSF受体、G-CSF受体、红细胞生成素受体和IL-6受体)。“可溶受体”是不结合于细胞膜的受体多肽。最常见的情况下，可溶受体是缺乏跨膜和胞浆域的配体-结合受体多肽。可溶受体可包括另外的氨基酸残基，如提供多肽的纯化或提供用于多肽连接至底物的位点的亲和标签。许多细胞表面受体具有天然存在的可溶对应物，它们是通过蛋白水解产生或从可变剪接的mRNAs翻译的。当受体多肽分别缺少跨膜和细胞内多肽区段的足够部分以提供膜锚定或信号转导时，称该受体多肽基本上没有跨膜和细胞内多肽区段。如本文所述，术语"Fc-融合蛋白"表示兼具异源蛋白质的结合特异性与免疫球蛋白恒定域的效应物作用的抗体状分子。结构上，Fc-融合蛋白包含具有所需结合特异性的氨基酸序列(其不同于抗体的抗原识别和结合位点(即，为"异源的"))，和免疫球蛋白恒定域序列的融合。Fc-融合蛋白分子通常包括连续氨基酸序列，其至少包含受体或配体的结合位点。Fc-融合蛋白中的免疫球蛋白恒定域序列可获自任何免疫球蛋白，如IgG-1， IgG-2，IgG-3，或 IgG-4 亚型，IgA (包括 IgA-I 和 IgA-2)，IgE, IgD 或 IgM0 例如，根据本发明可用的Fc-融合蛋白为包含FGFR3受体的FGF结合部分而没有FGFR3受体的跨膜或细胞质序列的多肽。在一个实施方案中，FGFR3的细胞外域融合至免疫球蛋白序列的恒定域。术语“抗体”在本文使用是指机体响应抗原的存在而产生的、结合至抗原的蛋白质，及其抗原-结合片段和工程化变体。因此，术语“抗体”和“抗体”包括多克隆抗体、亲和纯化的多克隆抗体、单克隆抗体、和抗原-结合抗体片段，如F(ab’)2*Fab片段。遗传工程完整的抗体和片段，如嵌合抗体、人源化抗体、单链Fv片段、单链抗体、双抗体、迷你抗体、线性抗体、多价或多特异性杂合抗体等也包括在内。因此，术语“抗体”可广义地用于包括任何包含抗体的抗原结合位点且能结合至其抗原的蛋白质。术语“遗传工程抗体”是指以下抗体，其中氨基酸序列在天然抗体的氨基酸序列的基础上被改变。因为重组DNA技术在抗体产生中的重要性，不必限制为在天然抗体发现中的氨基酸序列；可重新设计抗体以得到所需特征。可能的变化非常多，可从仅改变一个或一些氨基酸到例如可变区或恒定区的完全重新设计。通常，对恒定区进行改变以改善或改变如补体结合、与细胞的相互作用和其它效应物作用等特征。通常，将对可变区进行变化以改善抗原结合特征、改善可变区稳定性、或减少免疫原性风险。“抗体的抗原结合位点”为抗体的足以结合至其抗原的部分。最小的该区通常为可变域或其遗传工程变体。单域结合位点可产生自骆驼抗体(参见Muyldermans和 Lauwereys, J. Mol. Recog. 12 131-140，1999 ；Nguyen 等人，EMBO J. 19 :921-930,2000)或其它物种的Vh域以产生单域抗体(“dAbs” ；参见Ward等人，Nature 341 =544-546,1989 ； 美国专利No. 6，248，516 to Winter等人)。在某些变化中，抗原结合位点为仅具有2个天然或非天然(例如，诱变处理的)存在的重链可变域或轻链可变域，或其组合的互补决定区(CDR)的多肽区(参见，例如，Pessi 等人，Nature 362 :367_369，1993 ;Qiu 等人，Nature Biotechnol. 25 =921-929,2007)。更一般的，抗体的抗原结合位点包含结合至相同表位的重链可变域和轻链可变域两者。在本发明中，“包含抗体的抗原结合位点”的分子可进一步包含一个或多个抗体的第二抗原结合位点(其可结合至相同或不同表位或相同或不同抗原)，肽接头，免疫球蛋白恒定域，免疫球蛋白铰链，两亲性螺旋(参见I^ack和Pluckthim， Biochem. 31 :1579-1584,1992)，非肽接头，寡核苷酸(参见 Chaudri 等人，FEBSLetters 450 =23-26,1999)等，且可为单体或多聚蛋白质。包含抗体的抗原结合位点的分子的实例是本领域已知的，包括例如Fv片段，单链Fv片段(scFv)，Fab片段，双抗体，迷你抗体， Fab-scFv融合物，双特异性(ScFv)4-IgG,和双特异性(ScFV)2-Fab。(参见，例如，Hu等人， Cancer Res. 56 :3055-3061,1996 ；Atwell 等人，Molecular Immunology 33 :1301-1312,1996 ；Carter 禾口 Merchant，Curr. Opin. Biotechnol. 8 :449-454,1997 ；Zuo 等人，Protein Engineering 13 :361-367,2000 ；and Lu 等人，J. Immunol. Methods 267 :213-226,2002) 如本文所述，术语“免疫球蛋白”是指由一个或多个基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质。免疫球蛋白的一种形式构成抗体的基本结构单位。该形式为四聚物， 且由两个相同的免疫球蛋白链对组成，每个对具有一个轻链和一个重链。在每个对中，轻链和重链可变区一起负责结合至抗原，且恒定区负责抗体效应物作用。免疫球蛋白通常在脊椎动物生物中作为抗体起作用。已在高等脊椎动物中鉴定出五种免疫球蛋白(IgG，IgA， IgM，IgD和IgE)。IgG是主要的种类；它通常作为血浆中第二丰富的蛋白质存在。在人中， IgG由四个亚类组成，称为IgGl，IgG2，IgG3和IgG4。IgG类的重链恒定区用希腊字母γ 标识。例如，IgGl亚类的免疫球蛋白包含Yl重链恒定区。各个免疫球蛋白重链具有由恒定区蛋白质域％1，铰链，CH2jPCH3 ；IgG3也包含CH4域)组成的恒定区，该恒定区蛋白质域基本上为物种的给定亚类的变体。编码人和非人免疫球蛋白链的DNA序列是本领域已知的。(参见，例如，Ellison等人，DNA 1 :11_18，1981 ;Ellison等人，Nucleic Acids Res. 10: 4071-4079，1982 ；Kenten 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 :6661-6665,1982 ；Seno 等人， Nuc. Acids Res. 11 :719-726,1983 ；Riechmann 等人，Nature 332 :323-327,1988 ；Amster 等人，Nuc. Acids Res. 8 :2055-2065,1980 ；Rusconi and Kohler,Nature 314 :330-334,1985 ； Boss 等人，Nuc. Acids Res. 12 :3791-3806,1984 ；Bothwell 等人，Nature 298 :380-382, 1982 ；van der Loo 等人，Immunogenetics 42 :333-341,1995 ；Karlin 等人，J. Mol. Evol. 22 :195-208,1985 ；Kindsvogel 等人，DNA 1 :335-343,1982 ；Breiner 等人，基因 18 165-174，1982 ；Kondo 等人，Eur.J. Immunol. 23 :245-249,1993 ；and GenBank Accession No. J002^)。关于免疫球蛋白结构和功能的综述可参见Putnam，The Plasma Proteins, Vol V, Academic Press, Inc.，49—140，1987 ；禾口 Padlan，Mol. Immunol. 31 :169-217,1994。术语 “免疫球蛋白，，在此使用为其一般意思，表示完整抗体，其组成链，或链的片段，依上下文而定。全长免疫球蛋白“轻链”(约25Kd或214个氨基酸)由NH2-端的可变区基因(编码约110个氨基酸)和C00H-端的K或λ恒定区基因所编码。全长免疫球蛋白“重链”(约 50Kd或446个氨基酸)由可变区基因(编码约116个氨基酸)和Y，μ , α，δ，或ε恒定区基因(编码约330个氨基酸)编码，后者分别定义抗体的同种型为IgG，IgM，IgA，IgD， 或IgE。在轻链和重链中，可变区和恒定区通过约12或更多个氨基酸的“J”区连接，且重链还包括约10个或更多氨基酸的“D”区。(通常参见Fundamental Immunology (Paul, ed., Raven Press, N. Y.，2nd ed. 1989)，Ch. 7)。免疫球蛋白“Fv”片段包含重链可变域(Vh)和轻链可变域，二者通过非共价相互作用保持在一起。因此免疫球蛋白Fv片段包含单一抗原结合位点。Fv片段的二聚结构可进一步通过突变发生引入二硫键而稳定化。(参见Almog等人，Proteins 31:128-138， 1998.)如本文所述，术语“单链Fv”和“单链抗体”是指这样的抗体片段，其在单一多肽链中包含重链和轻链两者的可变区，但缺乏恒定区。通常，单链抗体进一步包含Vh和域之间的多肽接头，其使得单链抗体能够形成允许抗原结合的所需结构。单链抗体详细讨论于， 例如，Pluckthun 的 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol. 113 (Rosenburg禾口Moore eds. ,Springer-Verlag,New York，1994)，pp. 269-315。(也参见 WIPO Publication WO 88/01649 ；U. S. Patent Nos. 4, 946, 778 和 5，260，203 ;Bird 等人，Science 242 423-426，1988)。单链抗体也可为双特异性的和/或人源化的。"Fab片段”包含一个轻链以及一个重链的ChI和可变区。Fab片段的重链不能与另一重链分子形成二硫键。“Fab’片段”包含一个轻链和一个重链，所述重链还包含ChI和CH2域之间的恒定区部分，以使两个重链之间能够形成链间的二硫键而形成F(ab’)2分子。“F(ab’)2片段”包含两个轻链和含一部分ChI和CH2域之间的恒定区的两个重链， 以使两个重链之间形成链间二硫键。免疫球蛋白“Fe片段”(或Fc域)为抗体中负责结合至细胞上的抗体受体和补体的Clq组分的部分。Fc代表“片段结晶”，即容易形成蛋白质晶体的抗体的片段。独特的蛋白质片段(最初基于蛋白水解消化描述)可定义免疫球蛋白的总体一般结构。如文献中最初定义的，Fc片段由二硫键连接的重链铰链区、CH2和Ch3域组成。然而，后来该术语被用于指由下述部分组成的单链CH3、CH2、和至少一部分铰链，其中所述铰链的至少一部分足以与另一条这样的链形成二硫键连接的二聚物。免疫球蛋白结构和功能的综述可参见Putnam， The Plasma Proteins,Vol. V(Academic Press, Inc. , 1987) ,pp. 49-140 ；and Padlan,Mol. Immunol. 31 :169-217,1994。如本文所述，术语Fc包括天然存在的序列的变体。免疫球蛋白轻链或重链可变区由被三个高变区间断的“框架”区组成。因此，术语“高变区”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。该高变区包含来自“互补决定区” 或“CDR”的氨基酸残基(例如，在人中，轻链可变域中的残基24-34 (Li)，50-56 (L2)，和 89-97 (L3)，和重链可变域中的残基31-35 (Hl)，50-65 (H2)和95-102 (H3)(氨基酸序列号基于 EU 索弓I ；参见 Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md. (1991))禾口/ 或那些来自“高变环(loop)”的残基(在人中，轻链可变域中的残基沈-32 (Li)，50-52 (L2) 和 91-96 (L3)，和重链可变域中的 26-32 (Hl)，53-55 (H2)和 96-101 (H3) ；Chothia 和 Lesk, J. Mol. Biol. 196 :901-917,1987)(兹将上述文献引入并入本文)。“框架区”或“FR”残基为除在此定义的高变区残基之外的那些的可变域残基。不同轻链或重链的框架区的序列在一个物种中相对保守。因此，“人框架区”为基本上等同于(约85%或更多，通常90-95% 或更多)天然存在的人免疫球蛋白的框架区的框架区。抗体的框架区(其为组分轻链和重链的框架区的总体)起到定位和对准CDR的作用。该CDR主要负责对抗原表位的结合。 域的CDR Li、L2和L3在这里也分别称为LCDRl、LCDR2和LCDR3 ；Vh域的CDR HI、H2和H3 在这里也分别称为H⑶Rl、H⑶R2和HCDR3。“嵌合抗体”是这样的抗体，其轻链和重链基因是从属于不同物种的免疫球蛋白可变区和恒定区基因构建的(典型地通过基因工程)。例如，可以把小鼠单克隆抗体的基因的可变区段连接于编码人恒定区的区段(例如，人Y 1或Y 3重链基因，和人K轻链基因)。因此，治疗嵌合抗体是一种杂合蛋白，通常由小鼠抗体的可变域或抗原-结合域以及人抗体的恒定域构成，但也可使用其它哺乳动物物种。具体地，嵌合抗体通过重组DNA技术制备， 其中用免疫球蛋白轻链、重链或两者的铰链和恒定区的全部或部分代替另一动物的免疫球蛋白轻链或重链的相应区域。这样，亲本单克隆抗体的抗原-结合部分被嫁接到另一物种的抗体的骨架上。任选地可以通过替换暴露的残基来用类人表面(human-like surface) 来“遮掩”(cloak)嵌合抗体，其结果获得“表面装饰的抗体”(veneered antibody) 0如本文所述，术语“人抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，且包括从人免疫球蛋白库或从这样的动物分离的抗体该动物转入了一种或多种人免疫球蛋白基因且不表达内源性免疫球蛋白，这样的动物描述于例如Kucherlapati等人的美国专利号 5，939，598。术语“人源化免疫球蛋白”是指包含人框架区和源自非人(例如，小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供者”，而提供框架的人免疫球蛋白称为“受者”。恒定区不需要存在，但如果存在的话，它们必须基本上相同于人免疫球蛋白恒定区，即，至少约85-90%，优选约95%或更多的相同。因此，人源化免疫球蛋白的所有部分，除了可能的CDR，都基本上相同于天然人免疫球蛋白序列的对应部分。在一些情况下，人源化抗体可在人可变区框架域内保持非人残基以增强适当的结合特征(例如，当抗体被人源化时可能需要框架中的突变以保留结合亲和力)。“人源化抗体”为包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。例如，人源化抗体不会涵盖如上定义的典型嵌合抗体，因为，例如，嵌合抗体的整个可变区都是非人的。“双特异性抗体”或“双功能抗体”为具有两个不同的重/轻链对和两个不同的结合位点的杂合抗体。双特异性抗体可通过多种方法制备，包括但不限于杂交瘤的融合或Fab’ 片段的连接。参见，例如，Songsivilai & Lachmann，Clin. Exp. Immunol. 79 :315-321,1990 ； Kostelny 等人，J. Immunol. 148 1547-1553，1992。“二价抗体”不同于“多特异性”或“多功能”抗体，在某些实施方案中，为包含两个具有相同抗原特异性的结合位点的抗体。术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，这样的片段在同一多肽链(Vh-VJ中包含连接至轻链可变域的重链可变域(Vh)。通过使用太短而不允许在相同链上的两个域之间配对的接头，各个域被强迫与另一链的互补域配对，产生两个抗原结合位点。双抗体更详细描述于，例如，EP 404, 097 ；WO 93/11161 ；和Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444-6448,1993。术语“迷你抗体”在此是指仅编码天然或非天然(例如，经诱变处理的)存在的重链可变域或轻链可变域的2个互补决定区(CDR)，或其组合的多肽。迷你抗体的实例描述于，例如，Pessi 等人，Nature 362 :367-369,1993 ；和 Qiu 等人，Nature Biotechnol. 25 921-929，2007。术语“线性抗体”是指Zapata等人，Protein Eng. 8 1057-1062，1995描述的抗体。 简言之，这些抗体包含一对串联Fd区段(Vh-Chi-Vh-Chi),形成一对抗原结合区。线性抗体可为双特异性的或单特异性的。本文使用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指衍生自单一克隆的抗体，包括任何真核、原核、或噬菌体克隆，而非其制备的方法。本文使用的术语“亲本抗体”是指通过用于制备变体的氨基酸序列编码的抗体。优选地，该亲本抗体具有人框架区，且如果存在的话，具有人抗体恒定区。例如，该亲本抗体可为人源化的或人抗体。“变体”抗VEGF-A抗体，在此是指由于在在亲本抗体序列中添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基而与“亲本”抗VEGF-A抗体氨基酸序列的氨基酸序列不同的分子。 在优选的实施方案中，该变体在亲本抗体的一个或多个高变区中包含一个或多个氨基酸取代。例如，该变体在亲本抗体的一个或多个高变区中可包含约1至约10个，优选约2至约5 个取代。通常，该变体具有这样的氨基酸序列，其与亲本抗体重链或轻链可变域序列具有至少75 %的氨基酸序列同一性，更优选至少80 %，更优选至少85 %，更优选至少90 %，且最优选至少95%的氨基酸序列同一性。相对于该序列的同一性或同源性在在此定义为，在比对序列并引入缺口(如果必要的话)以达到最大百分比序列同一性后，候补序列中与亲本抗体残基相同的氨基酸残基的百分比。N-端、C-端、或内部延伸、缺失、或插入抗体序列中都不应解释为影响序列同一性或同源性。该变体保持结合人VEGF-A的能力，且优选具有优于亲本受者或抗体的性质。例如，该变体可具有更强的结合亲和力、增强的抑制VEGF-A-诱导的生物活性(例如血管发生或增殖)的能力。为分析这样的性质，人们应将变体的Fab形式与亲本抗体的Fab形式，或变体的全长形式与亲本抗体的全长形式进行比较，例如，因为已发现在本文公开的生物活性测试中抗VEGF-A抗体的形式影响其活性。本文特别感兴趣的变体抗体为当与亲本抗体相比，显示约至少3倍，5倍，10倍，20倍，或50倍的生物活性增强的抗体。术语“表位”包括任何能特异结合至免疫球蛋白或T-细胞受体的蛋白质决定簇。 表位决定簇通常由化学活性表面分子群如氨基酸或糖侧链组成，且通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。更具体地，本文使用的术语“VEGF-A表位”是指VEGF-A多肽的在动物、优选哺乳动物、最优选小鼠或人中具有抗原性或免疫原性活性的部分。具有免疫原性活性的表位是VEGF-A多肽的可引发动物抗体应答的部分。具有抗原活性的表位是 VEGF-A多肽中被抗体免疫特异性结合(通过任何本领域众所周知的方法测定的，例如通过免疫测试测定的)的部分。抗原性表位不一定是免疫原性的。“载体(vector) ”是这样的核酸分子，如质粒、粘粒、或噬菌体，其具有在宿主细胞中自主复制的能力。克隆载体通常包含一个或少数个限制核酸内切酶识别位点(其允许以可确定的方式插入核酸分子而不丧失载体的必需生物功能)，以及编码适用于鉴别和选择克隆载体转化的细胞的标记基因的核苷酸序列。标记基因通常包括提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。“表达载体”是编码在宿主细胞中表达的基因的核酸分子。通常，表达载体包括转录启动子、基因和转录终止子。通常将基因表达置于启动子的控制下，这样的基因被称为 “可操作连接”于启动子。同样，如果调节元件调节核心启动子的活性，则调节元件和核心启动子是可操作连接的。术语“表达”是指基因产物的生物合成。例如，在结构基因的情况下，表达包括将结构基因转录为mRNA和将mRNA翻译为一个或多个多肽。关于本文所述的蛋白质，称“与SEQ ID NO规定的氨基酸残基对应的氨基酸残基” 包括这些残基的翻译后修饰物。术语“新血管形成”和“血管发生”在此可互换使用。新血管形成和血管发生是指新血管在细胞、组织或器官中的生成。血管发生的控制通常在某些疾病状态中改变，而且在许多情况下，与疾病相关的病理损害与血管发生改变的不受调节的相关。持续性的、不受调节的血管发生在多种疾病状态(包括那些以内皮细胞的异常生长为特征的疾病)中发生， 且支持在这些症状(包括血管的泄漏和渗透)中观察到的病理损害。本文使用的术语“新生血管疾患”是指任何具有如下所述的病理的疾病或疾患，所述的病理至少部分地由增加的或不受调节的血管发生活性所介导。这样的疾病或疾患的实例包括各种癌症，包括实体瘤(例如，胰腺癌，肾细胞癌(RCC)，结肠直肠癌，非小细胞肺癌 (NSCLC)和胃肠道间质瘤(GIST))以及某些涉及新血管形成的眼病(“新生血管性眼病”)。 该疾病或障碍特别适于某些抑制血管发生的治疗方法，如本文进一步描述的。术语“有效量”，在通过向本文所述的受试者给药FGFR和/或VEGF-A拮抗剂治疗新生血管疾病的背景下，是指该药物的量，其足以抑制受试者的血管发生以抑制一种或多种新生血管疾病的发生或改善所述疾病的症状。有效量的药剂根据本发明方法以“有效方案”给药。术语“有效方案”是指足以实现治疗或预防疾病或疾患的给药的量和剂量频率的组合。术语“患者”或“受试者”，在治疗本文所述疾病或障碍的背景下，包括哺乳动物，例如，人和其它灵长类。该术语还包括家养动物，例如，牛，猪，羊，马，狗和猫。如果当将两个氨基酸序列以最大对应性比对时，两个氨基酸序列的氨基酸残基相同，则两个氨基酸序列具有“100%氨基酸序列同一性”。类似的，如果当以最大对应性比对时两个核苷酸序列的核苷酸残基相同，则两个核苷酸序列具有“ 100 %核苷酸序列同一性”。 序列比较可使用标准软件程序(如包括在LASERGENE生物信息学计算程序组中的程序，由 DNASTAR(Madison,Wisconsin)出品)来进行。其它用于通过确定最佳比对来比较两种核苷酸或氨基酸序列的方法是本领域技术人员众所周知的。(参见，例如，Peruski和Peruski， The Internet and the New Biology :Tools for Genomic and Molecular Research(ASM Press, Inc. 1997) ；Wu^A (eds.) ,"Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins,"Methods in Gene Biotechnology 123-151(CRC Press, Inc. 1997) ；Bishop(ed. ), Guide to Human Genome Computing(2nd ed·, Academic Press, Inc. 1998))。如果两个核苷酸或氨基酸序列相对彼此具有至少80 %，至少90 %，或至少 95%序列同一性，则两个核苷酸或氨基酸序列认为是具有“基本上类似的序列同一性”或 “基本上序列同一性”。百分比序列同一性通过常规方法测定。参见，例如，Altschul等人，Bull. Math. Bio. 48 :603,1986，和 Henikoff 和 Henikoff，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915,1992。 例如，可比对两个氨基酸序列以优化排列得分，其使用的缺口形成罚分(gap opening penalty)为 10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)为 1，和上文的 Henikoff■和 Henikoff的“BL0SUM62”评分矩阵，如表1所示(氨基酸通过标准单字母代码表示)。然后百分比同一性如下计算([相同匹配的总数]/[较长序列的长度加上引入较长序列以比对该两个序列的缺口数])(100)。表1 :BL0SUM62 评分矩阵

本发明公开了包含抗体/可溶受体双特异性结合蛋白的双特异性结合蛋白，其可减少VEGF-A和FGF两者的生物活性。FGF结合部分通常为可溶FGFR3或FGFR2。Fc多肽融合于FGF结合部分的C-端，VEGF-A结合部分为使用肽或多肽接头序列融合的多肽，且可表达为单一的双特异性结合蛋白。该双特异性抗体/可溶受体结合蛋白可用于治疗以实体瘤生长为特征的癌症以及其它疾病。