专利名称：具有更好稳定性和反义效果的新颖的反义寡核苷酸的制作方法图1显示c-myb CMAS-寡核苷酸的构建流程。图2显示CMAS-寡核苷酸的电泳图谱。A是用5％Metaphor琼脂糖凝胶分析的寡核苷酸，其中第1道大小标记物；第2道14mer连接反应引物；第3道线性60mer寡核苷酸；第4道CMAS-寡核苷酸。B显示线性和共价闭合的寡核苷酸在变性聚丙烯酰胺凝胶上的稳定性，其中第1和3道没有用外切核酸酶III处理；第2和4道用外切核酸酶III处理。图3显示c-myb RiAS-寡核苷酸的构建流程。图4显示RiAS-寡核苷酸的电泳图谱。A是用15％变性聚丙烯酰胺凝胶分析的寡核苷酸，其中第1道58mer MIJ-78分子；第2道116mer RiAS-寡核苷酸。B显示MIJ-78和RiAS-寡核苷酸用外切核酸酶III处理的稳定性试验，其中第1和3道没有用外切核酸酶III处理；第2和4道用外切核酸酶III处理。
图5显示在血清的存在下，线性与CMAS-寡核苷酸的降解图谱。
A显示线性AS-寡核苷酸的稳定性试验，其中第1道没有用血清处理(阴性对照)；第2道用50％未加工血清处理；第3道和第4道分别用FBS和CS处理24小时。
B显示CMAS-寡核苷酸的稳定性试验，其中第1道没有用血清处理(阴性对照)；第2道用50％未加工血清处理；第3道和第4道分别用FBS和CS处理24小时。
图6显示在血清的存在下，线性与RiAS-寡核苷酸的降解图谱。
A显示MIJ-78分子的稳定性试验，其中第1道没有用血清处理(阴性对照)；第2道用50％未加工血清处理；第3道和第4道分别用FBS和CS处理24小时。
B显示RiAS-寡核苷酸的稳定性试验，其中第1道没有用血清处理(阴性对照)；第2道用50％未加工血清处理；第3道和第4道分别用FBS和CS处理24小时。
图7显示c-myb CMAS-寡核苷酸对c-myb在HL-60细胞内表达的作用。
A显示用总RNA和两个c-myb引物进行的RT-PCR，其中第1道60mer CMAS-寡核苷酸0.3μg+脂转染试剂(Lipofectin)1μg；第2道60mer CMAS-寡核苷酸1μg+脂转染试剂1μg；第3道混杂的AS-寡核苷酸1μg+脂转染试剂1μg。
B显示用总RNA和两个c-myb引物进行的RT-PCR，其中上板c-myb mRNA的杂交RT-PCR带；下板β-肌动蛋白mRNA的杂交RT-PCR带。
图8显示c-myb RiAS-寡核苷酸对c-myb mRNA在HL-60细胞内表达的作用。
A显示用总RNA和两个c-myb引物进行的RT-PCR，其中第1道RiAS-寡核苷酸0.1μg+脂转染试剂0.8μg；第2道RiAS-寡核苷酸0.2μg+脂转染试剂0.8μg；第3道SC-寡核苷酸0.2μg+脂转染试剂0.8μg。
B显示用总RNA和两个c-myb引物进行的RT-PCR，其中上板c-myb mRNA的杂交RT-PCR带；下板β-肌动蛋白mRNA的杂交RT-PCR带。
图9显示60merCMAS或线性AS-寡核苷酸对HL-60细胞增殖的作用，其中-◆-CMAS-寡核苷酸(1)；-■-CMAS-寡核苷酸(2)；-●-AS-寡核苷酸；-▲-S-MIJ-7；●单独的脂转染试剂；○未处理的对照；(1)或(2)用AS-寡核苷酸处理的时间。
图10显示c-myb RiAS-寡核苷酸对HL-60细胞增殖的作用。
A显示c-myb RiAS-寡核苷酸的MTT测定。
B显示c-myb RiAS-寡核苷酸的[3H]胸苷掺入。
图11显示HL-60细胞被c-myb RiAS-寡核苷酸抑制的显微照片。
A是c-myb RiAS-寡核苷酸，B是SC-寡核苷酸，C是单独的脂转染试剂。
图12显示HT-29细胞被c-myb RiAS-寡核苷酸抑制的显微照片。
A是c-myb RiAS-寡核苷酸，B是SC-寡核苷酸，C是单独的脂转染试剂。
图13显示HT-29细胞被c-myc RiAS-寡核苷酸抑制的显微照片。
A是c-myc RiAS-寡核苷酸，B是SC-寡核苷酸，C是单独的脂转染试剂。
图14显示HT-29细胞被k-ras RiAS-寡核苷酸抑制的显微照片。
A是k-ras RiAS-寡核苷酸，B是SC-寡核苷酸，C是单独的脂转染试剂。
优选实施方式的详细说明下面，对本发明进行详细描述。
本发明在一方面提供新颖的AS-寡核苷酸，含有针对具有较小二级结构的区域的一个或更多反义序列。
具体地说，在优选的实施方式中，选择原癌基因之一c-mybmRNA的8个不同区域作为反义寡核苷酸的目标位点。对AS-寡核苷酸采用合理的目标位点搜索，以增加预测天然二级结构的机会。上述8个反义序列与所选择的目标位点是互补的。在所选择的8个对AS-寡核苷酸的目标位点中，最终选择了在形成CMAS分子时位于一个组合中的4个位点(MIJ-1、MIJ-2、MIJ-3和MIJ-4)和在形成RiAS分子时位于一个组合中的3个位点(MIJ-3、MIJ-4和MIJ-17)，因为它们形成最小的分子内二级结构(见表1)。
具有磷酸二酯主链的AS-寡核苷酸缺少成功的反义应用所必需的稳定性。修饰的寡核苷酸、例如PS-寡核苷酸或MP-寡核苷酸的稳定性提高了，但是稳定性的增益仅是部分性的，而且在DNA复制或修复期间产生潜在有害的水解修饰的核苷酸的错误掺入。据前人报道，与阳离子脂质体形成复合物的茎环寡核苷酸也部分提高了稳定性。不过，稳定性仍然是所要考虑的AS-寡核苷酸的主要问题所在。因此，本发明人试图开发具有更好稳定性的改进AS-寡核苷酸。
因此，本发明提供共价闭合的多重反义(CMAS)-寡核苷酸。
具体地说，在构建AS-寡核苷酸的细胞内二级结构时无需在AS-寡核苷酸与目标mRNA之间形成双螺旋。在优选的实施方式中，这些AS-寡核苷酸被设计成含有四个反义序列(MIJ-1、MIJ-2、MIJ-3和MIJ-4)(如SEQ ID NO1、NO2、NO3和NO4所述)的CMAS(共价闭合的多重反义)-寡核苷酸形式，将它们一前一后地放置在环内，以增加CMAS-寡核苷酸的长度(见图1)。CMAS-寡核苷酸在15％变性PAGE凝胶上的电泳迁移图谱比其线性前体减慢了约10％(见图2的A)。正如所预期的，CMAS-寡核苷酸对外切核酸酶III是耐受性的，如变性PAGE凝胶上的多条带所示，其中单体(60mer)是最丰富的，另有二聚体(120mer)和三聚体(180mer)。
与CMAS-寡核苷酸相反，线性寡核苷酸在用外切核酸酶III保温2小时后完全降解了(见图2的B)。
本发明也提供带型反义(RiAS)-寡核苷酸。
CMAS-寡核苷酸尽管是非常稳定的，也需要分子内连接反应的引物，而且在后来必须被消除。因此，为了避免使用连接反应引物和获得AS-寡核苷酸的同源种群，本发明人用酶学方法连接两个AS-寡核苷酸，形成带型闭合的分子，称为RiAS-寡核苷酸。
RiAS-寡核苷酸(116mer)由两个环和一个连接这两个环的茎组成(见图3)。在优选的实施方式中，将三个反义序列(MIJ-3、MIJ-4和MIJ-17)(如SEQ ID NO3、NO4和NO5所述)串联地放置在环内，以增加RiAS-寡核苷酸的长度。所以，RiAS-寡核苷酸中有三个不同反义序列的两个副本(共6个反义序列)。RiAS-寡核苷酸中这种加长的环将适应由与目标mRNA序列形成双螺旋所导致的扭力。
发现RiAS-寡核苷酸在变性PAGE凝胶上比其线性前体(MIJ-78)明显减慢了(见图4的A)。正如所预期的，RiAS-寡核苷酸对外切核酸酶III是耐受性的，如PAGE凝胶上的主要带(116mer)所示。与RiAS-寡核苷酸相反，MIJ-78在用外切核酸酶III孵育2小时后完全降解了(见图4的B)。
为了证明本发明的CMAS-寡核苷酸和RiAS-寡核苷酸抗核酸酶活性的稳定性增强了，将CMAS-寡核苷酸和RiAS-寡核苷酸与不加热灭活以保持核酸酶活性的血清一同孵育。
其结果是，在血清的存在下孵育24小时后，线性60mer寡核苷酸(CMAS-寡核苷酸的前体，见图5的A)和线性59mer寡核苷酸(RiAS-寡核苷酸的前体，见图6的A)被完全消化了。不过，CMAS-寡核苷酸和RiAS-寡核苷酸在用未加工的人血清、FBS和小牛血清孵育24小时后仍然保持大部分完整，说明其比线性前体显著提高了抗核酸酶活性的稳定性(见图5的B和图6的B)。
另外证明，CMAS-寡核苷酸能够按序列特异性方式充分消除目标mRNA。
具体地说，将CMAS-寡核苷酸与脂转染试剂联合运输到细胞内。采用脂转染试剂的原因是发现它对细胞较少毒性，并且产生一致性结果。MIJ-5是人c-myb的CMAS-寡核苷酸，与对照的SC-寡核苷酸相比能够减少95％以上的c-myb mRNA。同时，MIJ-5的线性配对物、即MIJ-5A减少37％的c-myb mRNA(见图7的A)。这些结果说明，即使使用更少的量，本发明的CMAS-寡核苷酸在消除目标mRNA方面也优于线性前体。
利用与CMAS-寡核苷酸相同的方法也证明了RiAS-寡核苷酸消除目标mRNA的功能。
将HL-60细胞用RiAS-寡核苷酸、混杂的(SC)-寡核苷酸以及单独的脂转染试剂进行试验。RiAS-寡核苷酸是在与脂转染试剂形成复合物之后被运输到细胞内的。所以，RiAS-寡核苷酸能够消除c-mybmRNA至完全。相形之下，与单独的脂转染试剂处理相比，SC-寡核苷酸温和地减少约30％的c-myb mRNA(见图8的A)。这些结果说明，即使使用更少的量，本发明的RiAS-寡核苷酸在消除目标mRNA方面也是优异的。
本发明人还利用PCR产物的DNA印迹法检查了CMAS-oilgo和RiAS-寡核苷酸的反义效果。
在CMAS-寡核苷酸的情况下，当c-myb信息用RT-PCR扩增时，发现用MIJ-5处理减少了超过90％的信息(见图7的B)。
在RiAS-寡核苷酸中，用经过标记的内部杂交寡核苷酸(30mer)检测用RT-PCR扩增的c-myb信息(图8的B)。结果确认所扩增的信息的确是来自c-myb的。
本发明还提供含有新型AS-寡核苷酸的药物组合物，用于治疗癌症、免疫疾病、传染病和其他由异常基因表达导致的人类疾病。
已经证明，c-myb CMAS-寡核苷酸或c-myb RiAS-寡核苷酸抑制白血病细胞生长。
具体地说，c-myb CMAS-寡核苷酸和c-myb RiAS-寡核苷酸对白血病细胞的生长抑制作用是通过三种方法测量的，即MTT测定法、[3H]胸苷掺入法或软琼脂糖上的集落形成。
作为MTT测定法的结果，当用递增量的MIJ-5、即针对人c-myb的CMAS-寡核苷酸处理时，细胞数逐渐减少。当细胞用MIJ-5处理两次时，更促进了对细胞生长的抑制作用。即使在低浓度下也观察到超过80％的HL-60细胞生长抑制(见图9)。同时，与伪对照相比，线性60mer AS-寡核苷酸、即MIJ-5A和线性有义寡核苷酸对细胞生长不起任何显著的抑制作用。这些结果说明，本发明的c-mybCMAS-寡核苷酸是有效的反义试剂，以浓度依赖性方式有效对抗肿瘤生长。
另外，观察到RiAS-寡核苷酸抑制91％的细胞生长(见图9的A)。
同时，与未经处理的对照相比，SC-寡核苷酸和单独的脂转染试剂并不显著地抑制细胞生长。这些结果说明，本发明的c-myb RiAS-寡核苷酸也是用于抑制白血病细胞生长的有效反义试剂。
在软琼脂糖上的集落形成中，MIJ-5减少超过90％的集落形成(见表2)。MIJ-5A也减少集落形成，但是关于生长抑制不太有效，集落减少约70％。另一方面，有义寡核苷酸和SC-寡核苷酸减少集落较少，分别约为11％和32％。
而且，与未经处理的对照相比，转染到细胞内的c-myb RiAS-寡核苷酸能够减少约92％的集落形成(见表3)。同时，SC-寡核苷酸和单独的脂转染试剂减少集落较少，分别约为7.9％和7.1％。
另外，利用[3H]胸苷掺入法观察c-myb RiAS-寡核苷酸对白血病细胞的生长抑制作用。具体地说，RiAS-寡核苷酸抑制93％的HL-60细胞生长。同时，SC-寡核苷酸和单独的脂转染试剂温和地抑制细胞生长，分别约为16.8％和15.4％(见图10的B)。在显微镜下观察，与用混杂的寡核苷酸和单独的脂转染试剂处理的细胞相比，用c-myb RiAS-寡核苷酸处理HL-60细胞后明显抑制其生长(见图11)。
受本发明的c-mybRiAS-ologo的显著抑制活性的鼓励，本发明人构建了抗两种不同原癌基因、即c-myc和k-ras的其他RiAS-寡核苷酸，并验证c-myc RiAS-寡核苷酸和k-ras RiAS-寡核苷酸是否能够充分抑制细胞生长。
作为显微镜观察的结果，与用混杂的寡核苷酸和单独的脂转染试剂处理的细胞相比，所有RiAS-寡核苷酸、c-myb RiAS-寡核苷酸、c-myc RiAS-寡核苷酸和k-ras RiAS-寡核苷酸都明显抑制HT-29细胞的生长(见图12、图13和图14)。
因此，本发明的新颖的针对各种目标序列的RiAS-寡核苷酸对肿瘤细胞显示出有效的生长抑制作用，对核酸酶活性的稳定性也增强了。因此，本发明的新颖的RiAS-寡核苷酸可以有效地用于开发治疗各种人类疾病的分子反义寡核苷酸。实施例下列实施例阐述本发明的实施和优选实施方式。
不过，将为本领域技术人员所领会的是，在公开内容的基础上可以在本发明的精神和范围内进行修饰和改进。
实施例1AS-寡核苷酸目标位点的选择已经发现AS-寡核苷酸的目标位点选择是达到反义效果、减少或切除目标mRNA的关键。不过，目标位点选择的方法一直是相当随意的。因此，在优选的实施方式中，本发明人浏览了全部人c-mybmRNA序列的公认的二级结构，以搜索合理的目标位点。
具体地说，利用DNAsis程序(Hitach Software，Japan)进行二级结构模拟。在100个碱基的邻近框架内循序扫描全部c-myb序列的二级结构形成。然后，将二级结构模拟框架向下错开30个碱基，导致在5’端有60个碱基交错。再次重复这个过程，以便扫描所有给定序列在三个不同框架内的潜在二级结构。
其结果是，从c-myb mRNA序列中选择在三个不同框架内具有最小二级结构的八个序列(表1)。采用AS-寡核苷酸的合理目标位点搜索的目的是增加预测天然二级结构的机会。
表1选自c-myb mRMA序列的八个反义寡核苷酸目标序列
如表1所述，上述8个反义序列与所选择的目标位点是互补的。在8个所选择的AS-寡核苷酸目标位点中，最后选择在形成CMAS分子时在一个组合中的4个位点(MIJ-1、MIJ-2、MIJ-3和MIJ-4)和在形成RiAS-寡核苷酸时在一个组合中的3个位点(MIJ-3、MIJ-4和MIJ-17)，因为它们形成最小的分子内二级结构。
实施例2共价闭合的多重反义(CMAS)-寡核苷酸的构建本发明人试图开发具有更好稳定性的改进AS-寡核苷酸。
实施例1所得4个不同AS-寡核苷酸(MIJ-1、MIJ-2、MIJ-3和MIJ-4)用于构建CMAS-寡核苷酸。为了更容易与目标位点结合，构建一个CMAS-寡核苷酸以包容在一个组合中的4个具有最小二级结构的不同反义序列。在合成期间磷酸化AS-寡核苷酸的5’末端，以遵循分子内或分子间共价连接反应(图1)。含有4个不同反义序列的60mer AS-寡核苷酸序列如SEQ ID NO7所述。用连接反应引物连接AS-寡核苷酸的两端，该引物在其两个搭接端具有与所述60mer AS-寡核苷酸的两个极末端序列(每侧各7个碱基)互补的序列。14mer连接反应引物的序列如SEQ ID NO6所述。将连接反应引物与AS-寡核苷酸混合，在85℃下加热2分钟，然后逐渐冷却至室温。加入一单位T4连接酶，在16℃下孵育16小时，以生成共价闭合的分子。将CMAS-寡核苷酸在5％MethphorTM琼脂糖凝胶(FMC，USA)或12％变性PAGE上电泳，鉴定其对外切核酸酶III的耐受性以及与线性60mer寡核苷酸相比的轻微凝胶缓聚作用。在90℃下加热后，通过变性凝胶电泳展开，连接反应引物被外切核酸酶III降解或者从CMAS-寡核苷酸分离。
所以，在构建AS-寡核苷酸的细胞内二级结构时无需在AS-寡核苷酸与目标mRNA之间形成双螺旋。这种AS-寡核苷酸被称为CMAS(共价闭合的多重反义)-寡核苷酸。CMAS-寡核苷酸在15％变性PAGE凝胶上的电泳迁移图谱比其线性前体减慢了约10％(图2的A)。正如所预期的，CMAS-寡核苷酸对外切核酸酶III是耐受性的，如变性PAGE凝胶上的多条带所示，其中单体(60mer)是最丰富的，另有二聚体(120mer)和三聚体(180mer)(图2的B)。与CMAS-寡核苷酸相反，线性寡核苷酸在用外切核酸酶III孵育2小时后完全降解了。
实施例3带型反义(RiAS)-寡核苷酸的构建本发明人用酶学方法连接两个AS-寡核苷酸，形成带型闭合的分子，称为RiAS-寡核苷酸。
具体地说，RiAS-寡核苷酸由两个环和一个连接这两个环的茎组成。每个环含有三个不同的反义(MIJ-3、MIJ-4和MIJ-17)序列，如SEQ ID NO3、NO4和NO5所述。为了更容易与目标位点结合，为AS-寡核苷酸选择三个反义序列与最小可能的二级结构的组合。在5’端磷酸化c-mybAS-寡核苷酸(MIJ-78)。58merMIJ-78的序列如SEQ ID NO8所述。MIJ-78用于形成茎环结构。茎是由每个寡核苷酸两端上的互补序列所形成的。茎的5’末端具有4碱基的单链序列5′-(p)GATC-3′。两个MIJ-78分子通过该互补的4碱基序列在两个5’末端连接。将MIJ-78分子混合，在85℃下加热2分钟，然后逐渐冷却至室温。加入一单位T4 DNA连接酶，在16℃下孵育24小时，以生成具有双对称性的共价连接分子(图3)。将该RiAS-寡核苷酸在15％变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，检查其对外切核酸酶III的耐受性以及凝胶缓聚作用。
其结果是，构建的RiAS-寡核苷酸(116mer)由两个环和一个连接这两个环的茎组成。将三个反义序列串联地放置在环内，以增加RiAS-寡核苷酸的长度。所以，在RiAS-寡核苷酸中有三个不同反义序列的两个副本(共6个反义序列)。RiAS-寡核苷酸中这种加长的环将适应由与目标mRNA序列形成双螺旋所导致的扭力。发现RiAS-寡核苷酸在变性PAGE凝胶上的迁移比其线性前体(MIJ-78)明显减慢了(图4的A)。正如所预期的，RiAS-寡核苷酸对外切核酸酶III是耐受性的，如PAGE凝胶上的主带(116mer)所示(图4的B)。与RiAS-寡核苷酸相反，MIJ-78在用外切核酸酶III孵育2小时后完全降解了。
实施例4CMAS-寡核苷酸和RiAS-寡核苷酸对核酸酶活性的稳定性增强为了试验本发明的CMAS-寡核苷酸和RiAS-寡核苷酸抗核酸酶活性的稳定性，将CMAS-寡核苷酸和RiAS-寡核苷酸与不加热灭活以保持核酸酶活性的血清孵育。
具体地说，将非特异性对照-磷酸二酯寡核苷酸(线性60mer)和CMAS-寡核苷酸各1μg分别与未加工人血清、FBS和小牛血清(未加热灭活；HyClone，Logan，Utah，USA)或外切核酸酶III一同孵育。向AS-寡核苷酸中分别加入15％各种血清，反应体积为100μl，在37℃下孵育24小时。然后用苯酚和氯仿抽提AS-寡核苷酸，在15％变性PAGE凝胶上检查。向线性与CMAS-寡核苷酸中加入160U/μg寡核苷酸的外切核酸酶III(Takara，Japan)，在37℃下孵育2小时。按相同方式抽提用外切核酸酶III处理的AS-寡核苷酸并进行电泳。
作为CMAS-寡核苷酸的结果，在血清的存在下孵育24小时后，线性60mer寡核苷酸被完全消化了(图5的A)。不过，本发明的CMAS-寡核苷酸在用未加工人血清、FBS和小牛血清培养24小时后仍然保持大部分完整，说明比其线性前体显著提高了抗核酸酶的稳定性(图5的B)。
在RiAS-寡核苷酸的情况下，在每种不同血清的存在下培养24小时后，线性58mer被完全水解了(图6的A)。不过，本发明的RiAS-寡核苷酸在用未加工血清培养24小时后仍然保持大部分完整，说明比其线性前体显著提高了抗核酸酶的稳定性(图6的B)。
实施例5CMAS-寡核苷酸和RiAS-寡核苷酸特异性地减少c-myb mRNA受本发明的CMAS-寡核苷酸和RiAS-寡核苷酸的显著稳定性的鼓励，本发明人检查AS-寡核苷酸是否能够以序列特异性方式充分消除目标mRNA。
<5-1>细胞系和组织培养物白血病细胞系HL-60(前髓细胞白血病细胞系)和K562(慢性骨髓性白血病细胞系)是从ATCC(美国典型培养物保藏中心)获得的，在补充有10％加热灭活的FBS(HyClone，USA)和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640(Gibco BRL，USA)中进行培养。在37℃下、在CO2孵箱内培养细胞。严格遵守例行细胞培养惯例，以保持适当的细胞密度和避免在解冻储备小瓶之后所培养的细胞超过5代。在用AS-寡核苷酸处理前一天更换培养基。
<5-2>与阳离子脂质体形成复合物的CMAS-寡核苷酸和RiAS-寡核苷酸的转染将0.3μgCMAS-寡核苷酸加0.8μg脂转染试剂(LipofectinTM)(Gibco BRL，USA)或0.2μg RiAS-寡核苷酸加0.8μg脂转染试剂分别稀释在20μl OPTI-MEMTM中，在室温下孵育40分钟。然后在室温下将每种组分混合15分钟形成复合物。在细胞中加入与不含抗生素的新鲜培养基(RPMI 1640+10％FBS)，1天后加入寡核苷酸，在开始实验前用OPTI-MEM洗涤细胞两次。将细胞密度调整为5×105细胞/ml，每100μl等分在48孔平板(Falcon，USA)中。向细胞加入40μl脂质体-寡核苷酸复合物两次，一次在第0天，一次在第1天。将用寡核苷酸处理的细胞在37℃、5％CO2下培养4小时，然后加入含10％FBS的100μl OPTI-MEM。第二天，小心地除去100μl上清液，用含有寡核苷酸-脂质体复合物的20μl新鲜OPTI-MEM代替。四小时后，细胞中加入与含有抗生素的另外100μl完全培养基，在37℃下培养超过1天，然后开始测定。
<5-3>总RNA的分离和RT-PCR按照厂商推荐的操作用TripureTM分离试剂(Boehringer Manhein，Germany)分离总RNA。简言之，向所收获的细胞中加入0.4ml Tripure试剂、10μg糖原和80μl氯仿，得到总RNA。在单反应试管内用AccessTMRT-PCR试剂盒(Promrga，USA)进行RT-PCR。在PCR试管内加入RNA、PCR引物、AMV逆转录酶(5U/μl)、Tfl DNA聚合酶(5U/μl)、dNTP(10mM，1μl)和MgSO4(25mM，2.5μl)。在48℃DNA热循环器(Hybaid，USA)内进行45分钟第一条cDNA链的合成。随后用厂商推荐的条件进行25个循环的PCR扩增。在1％琼脂糖凝胶中确认扩增后的PCR产物，利用凝胶文档程序(Bio-Rad，USA)进行量化。
<5-4>RT-PCR片段的DNA杂交在1％琼脂糖凝胶上进行RT-PCR产物电泳。在0.4M NaOH中4小时，将DNA转移到尼龙膜(New England Biolab，USA)上。将膜与30mer内部引物杂交，后者已用ECL 3’末端寡核苷酸-标记与检测系统(Amersham Life Science，England)标记。30mer内部引物的序列如SEQ ID NO9所述。在含有5×SSC、0.02％SDS的6ml缓冲液中、在62℃下进行杂交60分钟。膜用含有0.1％SDS的5×SSC洗涤两次，用含有0.1％SDS的1×SSC洗涤两次每次15分钟。膜用封闭溶液封闭，然后用HRP(辣根过氧化酶)抗荧光素共轭抗体处理30分钟，然后进行放射自显影。
证明本发明的CMAS-寡核苷酸能够以序列特异性方式充分消除目标mRNA。
具体地说，CMAS-寡核苷酸与脂转染试剂形成复合物，运输到细胞内。采用脂转染试剂的原因是发现它对细胞较少毒性，并且产生一致性结果。其结果是，0.3μg MIJ-5、即人c-myb的CMAS-寡核苷酸与1μg脂转染试剂形成复合物，转染到HL-60细胞内。与对照SC-寡核苷酸相比，MIJ-5能够减少超过95％的c-myb mRNA。同时，MIJ-5的线性配对物MIJ-5A减少37％的c-myb mRNA(图7的A)。这些结果说明，即使使用更少的量，本发明的CMAS-寡核苷酸在切除目标mRNA方面也优于线性前体。
这也证明了本发明的RiAS-寡核苷酸能够以序列特异性方式充分消除目标mRNA。
将HL-60细胞用RiAS-寡核苷酸、SC-寡核苷酸以及单独的脂转染试剂转染。RiAS-寡核苷酸是在与脂转染试剂形成复合物之后被运输到细胞内的。人c-myb的RiAS-寡核苷酸(0.1μg或0.2μg)与0.8μg脂转染试剂形成复合物，转染到HL-60细胞内。所以，0.2μg RiAS-寡核苷酸(40nM)能够切除c-myb mRNA至完全。同时，0.1μgRiAS-oilgo减少约70％c-myb mRNA(图8的A)。相形之下，与单独的脂转染试剂处理相比，SC-寡核苷酸温和地减少约30％c-mybmRNA。不过，如底板所示的β-肌动蛋白表达不受RiAS-寡核苷酸处理以及其他处理条件的影响。这些结果说明，即使使用更少的量，RiAS-寡核苷酸在切除目标mRNA方面也是优异的。
本发明人还利用PCR产物通过DNA印迹法检查了CMAS-oilgo和RiAS-寡核苷酸的反义效果。将HL-60细胞用包括MIJ-5在内的寡核苷酸和对照寡核苷酸转染，这些细胞用于分离总DNA。
在CMAS-寡核苷酸的情况下，当用RT-PCR扩增c-myb信息时，发现用MIJ-5处理减少了超过90％的信息(图7的B)。不过，如底板所示的β-肌动蛋白表达不受MIJ-5处理的影响。
在RiAS-寡核苷酸中，用经过标记的内部杂交寡核苷酸(30mer)检测用RT-PCR扩增的c-myb信息(图8的B)。结果证实所扩增的信息的确是来自c-myb的，用0.2μg c-myb RiAS-寡核苷酸处理完全消除了该信息。
实施例6c-myb CMAS-寡核苷酸和c-myb RiAS-寡核苷酸对白血病细胞的有效生长抑制作用据报道，c-myb在白血病细胞增殖中扮演重要角色。另据报道c-myb的AS-寡核苷酸也优先抑制白血病细胞生长。因此，本发明人试验了本发明的c-myb CMAS-寡核苷酸和c-myb RiAS-寡核苷酸抑制白血病细胞生长的作用。
具体地说，c-myb CMAS-寡核苷酸和c-myb RiAS-寡核苷酸对白血病细胞的生长抑制作用是通过三种方法测量的，即MTT测定法、[3H]胸苷掺入法或软琼脂糖上的集落形成。
<6-1>MTT测定法关于MTT(3，-[4，5-二甲基噻唑-2-基]2，5-二苯基溴化四唑鎓，以下称之为“MTT”)测定法，将HL-60细胞用OPTI-MEM洗涤两次，以50μl体积等分在96孔平板中(5×103细胞/孔)。将细胞用预先在不同量寡核苷酸(0.01-1μg/15μl CMAS-寡核苷酸或0.2μg/15μlRiAS-寡核苷酸)与脂转染试剂(0.2μg/15μl)之间形成的复合物处理5小时，并培养5天。然后收获100μl体积的细胞，加入20μl(100μg)MTT试剂(在5mg/ml PBS中；Sigma，USA)，然后在37℃下培养4小时。向细胞加入100μl异丙醇(含有0.1N HCl)，在室温下培养一小时。利用ELISA读数器测量570nm下的吸光度，统计存活的细胞数。
在CMAS-寡核苷酸中，当用递增量的MIJ-5处理时，细胞数逐渐减少。当细胞用MIJ-5处理两次时，更促进了对细胞生长的抑制作用。即使在低浓度下、即0.13μg(共0.24μg)CMAS-寡核苷酸也观察到超过80％的HL-60细胞生长抑制(图9)。同时，与伪对照相比，线性60mer AS-寡核苷酸、即MIJ-5A和线性有义寡核苷酸对细胞生长不起任何显著的抑制作用。这些结果说明，c-myb CMAS-寡核苷酸是有效的反义试剂，是以浓度依赖性方式有效对抗肿瘤生长的试剂。
在RiAS-寡核苷酸中，也观察到RiAS-寡核苷酸抑制91％的细胞生长(图10的A)。
同时，与未经处理的对照相比，SC-寡核苷酸和单独的脂转染试剂并不显著地抑制细胞生长。这些结果说明，c-myb RiAS-寡核苷酸是用于抑制白血病细胞生长的有效反义试剂。
<6-2>软琼脂糖上的集落形成还用另一种方法、即软琼脂糖上的集落形成测量了c-mybCMAS-寡核苷酸和c-myb RiAS-寡核苷酸对白血病细胞的生长抑制作用。
具体地说，如实施例6所述转染K562细胞，在37℃和5％CO2下培养24小时。向细胞加入0.8％低熔点琼脂糖与2(含有20％FBS加抗生素的RPMI 1640)的等体积混合物，接种在6孔平板上，固结。将6孔平板冷却至4℃达5分钟，并培养15天。含有超过20个细胞的集落记为阳性。
其结果是，CMAS-寡核苷酸MIJ-5减少超过90％的集落形成(表2)。MIJ-5A也减少集落形成，但是关于生长抑制不太有效，集落减少约70％。另一方面，有义寡核苷酸和SC-寡核苷酸较少地减少集落，分别约为11％和32％。
表2c-myb寡核苷酸对K562细胞集落形成的作用
另一方面，与未经处理的对照相比，用c-myb RiAS-寡核苷酸转染的细胞能够减少约92％的集落形成(表3)。同时，SC-寡核苷酸和单独的脂转染试剂较少地减少集落，分别约为7.9％和7.1％。
表3c-myb寡核苷酸对K562细胞集落形成的作用
<6-3>[3H]胸苷掺入还用[3H]胸苷掺入法测量了c-myb RiAS-寡核苷酸对白血病细胞的生长抑制作用。
关于[3H]胸苷掺入法，如上所述将HL-60细胞用AS-寡核苷酸处理。向细胞加入0.5μCi的[3H]胸苷(2.0Ci/mmol；Amersham，England)，培养16小时，一式三份。然后在玻璃微纤维滤器(WhatmanGF/C，England)上收获细胞。滤器按顺序用冷PBS、5％TCA和纯乙醇洗涤。在含有甲苯、Triton X-100，PPO和POPOP的鸡尾酒溶液中，利用液体闪烁计数器测量[3H]胸苷掺入。
结果，RiAS-寡核苷酸(0.2μg)抑制93％HL-60细胞生长(图10的B)。同时，SC-寡核苷酸和单独的脂转染试剂温和地抑制细胞生长，分别约为16.8％和15.4％。在显微镜下观察，与用混杂的寡核苷酸和单独的脂转染试剂处理的细胞相比，用c-myb RiAS-寡核苷酸处理HL-60细胞后明显抑制其生长(图11)。
实施例8c-mycRiAS-寡核苷酸和k-rasRiAS-寡核苷酸的有效生长抑制作用受本发明的c-myb RiAS-ologo的显著抑制活性的鼓励，本发明人构建了抗两种不同原癌基因、即c-myc和k-ras的其他RiAS-寡核苷酸，方法同实施例3。
然后检查c-myc RiAS-寡核苷酸和k-ras RiAS-寡核苷酸是否能够充分抑制细胞生长。
具体地说，使用不同的细胞系，即结肠直肠腺癌细胞系HT-29。c-myc RiAS-寡核苷酸和k-ras RiAS-寡核苷酸对肿瘤细胞的生长抑制作用是用[3H]胸苷掺入法测量的，方法同实施例<6-3>。将HT-29细胞分别用0.2μg c-myb RiAS-寡核苷酸加0.6μg脂转染试剂或0.5μg c-myc RiAS-寡核苷酸加1.5μg脂转染试剂或0.5μg k-rasRiAS-寡核苷酸加1.5μg脂转染试剂的阳离子脂质体复合物处理。用以上RiAS-寡核苷酸处理5天后，利用显微镜检查观察HT-29细胞的生长。各用RiAS-寡核苷酸(A)、混杂的寡核苷酸(B)和单独的脂转染试剂(C)处理后，每个显微照片都表现对生长抑制的作用。
作为显微镜观察的结果，与用混杂的寡核苷酸和单独的脂转染试剂处理的细胞相比，所有RiAS-寡核苷酸、c-myb RiAS-寡核苷酸、c-myc RiAS-寡核苷酸和k-ras RiAS-寡核苷酸都明显抑制HT-29细胞的生长(图12、图13和图14)。
因此，本发明的新颖的各种目标序列RiAS-寡核苷酸对肿瘤细胞显示有效的生长抑制作用，对核酸酶活性的稳定性也增强了。因此，本发明的新颖的RiAS-寡核苷酸可以有效地用于开发治疗各种人疾病的分子反义寡核苷酸。
工业实用性本发明提供新颖的AS-寡核苷酸，含有针对具有较小二级结构的mRNA区的一个或更多反义序列，并且具有更好的目标序列特异性和对核酸酶活性的稳定性。
具体地说，本发明提供共价闭合的多重反义(CMAS)-寡核苷酸，含有针对c-myb mRNA的多目标反义序列，其构建方法是利用互补引物的连接反应形成闭合型。另外，本发明提供带型反义(RiAS)-寡核苷酸，含有c-myb mRNA的多目标反义序列，其构建方法是利用互补序列的连接反应在两个5’末端上形成茎环结构。
已经证明，当人肿瘤细胞用本发明的c-myb RiAS-寡核苷酸和c-myb CMAS-寡核苷酸以及c-myc RiAS-寡核苷酸和k-ras RiAS-寡核苷酸处理时，本发明的新颖的AS-寡核苷酸有效去除异常基因表达。因此提示了本发明的新颖的AS-寡核苷酸可以用于开发各种致病基因的分子反义药物，以及用于基因的功能研究。具体地说，本发明的新颖的AS-寡核苷酸可以用于开发药物组合物，用于治疗癌症、免疫疾病、传染病和其他由异常基因表达导致的人类疾病。
将为本领域技术人员所领会的是，在上述说明中公开的概念和
易于用作修饰或设计其他实施方式的基础，以实现本发明的相同目的。也将为本领域技术人员所领会的是，这些等价的实施方式并不背离如所附权利要求所阐明的本发明精神和范围。


本发明涉及新颖的反义(AS)寡核苷酸,含有针对具有较小二级结构的mRNA区的一个或更多反义序列。具体地说,本发明涉及共价闭合的多重反义(CMAS)－寡核苷酸,其构建方法是利用互补引物的连接反应形成闭合型,和带型反义(RiAS)－寡核苷酸,由两个含有多重反义序列的环和连接这两个环的茎组成,其构建方法是利用互补序列的连接反应在两个5’末端上形成茎环结构。由于本发明的新颖的AS－寡核苷酸对外切核酸酶活性是极为稳定的,并显示显著的肿瘤细胞生长抑制作用,含有本发明的新型AS－寡核苷酸的药物组合物有效治疗癌症、免疫疾病、传染病和其他由异常基因表达导致的人疾病。