新颖乳发酵产物及其用途[0002]按，全球人口结构已逐步迈向高龄化的社会，银发族除了面对癌症、脑中风、心肌梗塞等疾病的威胁外，骨质疏松症(osteoporosis)也逐渐受到重视。详言之，人体的骨骼质量自出生后逐渐增加，直到三十岁前为最高峰，尔后则逐年下降，尤其停经后的妇女因大幅减少可促骨质生成的荷尔蒙雌激素，骨质流失速率更快。而患有骨质疏松症者，骨骼变得松脆，很容易发生骨骼碎裂等情形，尤其是老年人跌倒时容易引起大腿骨、颈部骨折，造成从此卧床或经常性腰痛，并且骨骼碎裂极难治愈。根据统计，台湾地区因骨质疏松症而发生骨折的机率，约为脑中风的2至4倍。估计到2050年，全世界因骨质疏松症引起的骨折发生率将比现在增加六倍，其中以亚洲地区为最多。台湾的健保局于2009的数据显示，台湾地区停经后妇女的骨质疏松症发生率约为25%，而男性也无可幸免，至少每五位将有一位会罹患骨质疏松症。再者，统计显 示，约10-20%的髋骨骨折病人在第一年会死亡，几乎和乳癌末期的死亡率相当。此外，骨质疏松症患者有50%无法独立生活，20-25%无法独立行动，换言之，医疗体系及社会必须付出庞大的社会成本与医疗资源。因此，正视骨质疏松的预防保健，为刻不容缓的重要研究议题。[0003]骨质疏松症造成骨折的因素主要决定于骨密度，因此，治疗的目标在于防堵骨质流失或补强已流失的骨质量。目前已有数种治疗药剂具有减缓骨质流失速度的效果，包含抑钙素(calcitonin)、荷尔蒙疗法(hormone therapy)和双憐酸盐药物(bisphosphonate)等，其作用原理主要为降低骨骼吸收作用(bone resorption);另一类是「同化性」药物,如以副甲状腺素(简称PTH)刺激骨母细胞，加速骨质生成(Riggs and Melton, 1988)。此二类药物主要用于治疗已发生骨质疏松症的患者，但，仍具有以下缺失，其一、对于年过三十骨质开始流失但未达骨质疏松标准者，则无法使用药物；其二、服用双磷酸盐药物会使患者产生颚骨坏死的副作用。而为了避免上述缺失，市面上亦推出众多用以补充钙质的营养品，目的在于防止骨质流失且补充骨骼钙质，然营养补充品对于骨骼流失的控制并无实际效用，且无法有效地使人体吸收钙质，难以补充骨骼钙质。[0004]近年来,天然物中生物活性肽(bioactive peptide)的研究发展快速,研究的结果已指出许多来自牛乳蛋白质的胜肽系具有生理活性，如抗高血压(antihypertensive)、类吗啡(opioid-like)、免疫调节(immunomodulating)、抗血栓(antithromobotic)、抗菌(antimicrobial)、与促进?丐质吸收(calcium-absorption enhancing)等(Zinn, 1998; Yamamoto, 1998; Shan，2000)。是以，若干研究皆致力于自天然物中获得能够具有改善骨质疏松症的蛋白质，但，天然物中虽具有不同生理活性的胜肽，并不具有如化学合成药物所产生的副作用，然，大部分的生物活性肽，包含ACE抑制肽、抗菌胜肽以及抗高血压肽，都需要从原先的蛋白质被酵素水解成小片段的寡肽后，方能发挥其生理活性作用(Meisel，1999)，且发酵食品或非发酵食品经适当的酵素水解后可增进其功能性(Vermeirssen et al., 2003 ；Hernandez-Ledesma et al., 2004)。[0005]据此，如何自天然物中获得具有生理活性的小分子胜肽，使该胜肽于生物体发挥其生理活性作用而能够确切地具有改善骨质疏松症的症状，实为目前生医药学研究的重要课题。
[0007]更进一步而言，该新颖乳发酵产物是以动物乳经克弗尔(kefir)菌元或至少一个由克弗尔菌元所分离的菌株于预定发酵条件下进行发酵反应而得。[0008]其中，该动物乳可取自牛、羊、绵羊、猪、马等动物。
[0009]本发明的次一目的在于提供一种营养补充品，其成份至少包含一个胜肽群及一种预定营养成份，其中，该营养成份为一矿物元素，例如钙离子，其中，该胜肽群为图11至图18中的任一图中标号I至7所组成的胜肽群。
[0010]本发明的另一目的在于提供一种食品，如发酵乳制品，其成份至少包含一个胜肽群及一种食品成份，其中，该胜肽群为图11至图18中的任一图中标号I至7所组成的胜肽群。
[0011]本发明的再一目的在于提供一种治疗骨质疏松症的医药组合物，其包含胡有效成份及医药上可接受的载体和/或赋形剂，而得以口服方式给予，其中，该有效成份为图11至图18中的任一图中标号I至7所组成的胜肽群。
[0012]本发明的又一目的在于提供一种用以抑制骨质流失的医药组合物，其包含有有效成份及医药上可接受的载体和/或赋形剂，而得以口服方式给予，其中，该有效成份为图11至图18中的任一图中标号I至7所组成的胜肽群。
[0013]该新颖乳发酵产物用以于生物体上提供降低骨质流失的效果，而可应用于食品、营养补充品及医药制品，以达到预防或治疗骨质疏松症以及补充骨质所需营养的功效。



[0014]图1为各组小鼠分别饲养不同周数的体重变化图。
[0015]图2A为第一组小鼠的膝盖端生长板横向截面μ -CT扫描影像图。
[0016]图2Β为第二组小鼠的膝盖端生长板横向截面μ -CT扫描影像图。
[0017]图2C系为第三组小鼠的膝盖端生长板横向截面μ -CT扫描影像图。
[0018]图2D系为第四组小鼠的膝盖端生长板横向截面μ -CT扫描影像图。
[0019]图3Α为第一组小鼠的膝盖端生长板μ -CT扫描3D影像图。
[0020]图3Β为第二组小鼠的膝盖端生长板μ -CT扫描3D影像图。
[0021]图3C为第三组小鼠的膝盖端生长板μ -CT扫描3D影像图。
[0022]图3D为第四组小鼠的膝盖端生长板μ -CT扫描3D影像图。
[0023]图4Α为第一组小鼠的膝盖端生长板纵向截面μ -CT扫描影像图。
[0024]图4Β为第二组小鼠的膝盖端生长板纵向截面μ -CT扫描影像图。
[0025]图4C为第三组小鼠的膝盖端生长板纵向截面μ -CT扫描影像图。[0026]图4D为第四组小鼠的膝盖端生长板纵向截面μ -CT扫描影像图。
[0027]图5Α为图4Α的局部放大图。
[0028]图5Β为图4Β的局部放大图。
[0029]图5C为图4C的局部放大图。
[0030]图为图4D的局部放大图。
[0031]图6A为第一组小鼠的膝盖端生长板纵向截面电子显微镜扫描影像图。
[0032]图6B为第二组小鼠的膝盖端生长板纵向截面电子显微镜扫描影像图。
[0033]图6C为第三组小鼠的膝盖端生长板纵向截面电子显微镜扫描影像图。
[0034]图6D为第四组小鼠的膝盖端生长板纵向截面电子显微镜扫描影像图。
[0035]图7为各组小鼠的骨占组织体积的统计柱形图。
[0036]图8为各组小鼠的骨小梁骨矿物质密度的统计柱形图。
[0037]图9为各组小鼠的骨小梁数量的统计柱形图。
[0038]图10为各组小鼠的骨小梁分离度的统计柱形图。
[0039]图11为第一批次的发酵乳的HPLC层析图。
[0040]图12为第二批次的·发酵乳的HPLC层析图。
[0041]图13为第三批次的发酵乳的HPLC层析图。
[0042]图14为第四批次的发酵乳的HPLC层析图。
[0043]图15为第五批次的发酵乳的HPLC层析图。
[0044]图16为第六批次的发酵乳的HPLC层析图。
[0045]图17为第七批次的发酵乳的HPLC层析图。
[0046]图18为第八批次的发酵乳的HPLC层析图。
[0047]图19为蛋白质标准品的HPLC层析图。
[0048]图20A 为图 11。
[0049]图20B 为图 19。
[0050]图21为未经发酵的原料乳的HPLC层析图。
[0051]图22A 为图 12。
[0052]图22B 为图 21。
[0053]图23为经喷雾干燥处理的发酵乳的HPLC层析图。
[0054]图24A 为图 23。
[0055]图24B 为图 12。

[0056]本发明所揭示的一种新颖乳发酵产物，其由动物乳以克弗尔菌元或是由该克弗尔菌元所分离出的菌株经由发酵而产制成，组成至少包含一个胜肽群，其中，该胜肽群是图11至图18中的任一图中标号I至7所组成的胜肽群。更进一步而言，经由发酵反应能有效地将该动物乳中的大分子蛋白质分解为如图11至图18中的任一图中标号I至7所示的小片段胜肽群，并各该胜肽未被发现于未经发酵反应的动物乳中。
[0057]而由先前文献(ZEYNEP B.⑶ZEL-SEYD.IM et al.2011)中可知，由克弗尔菌元所分离出的菌株包含有乳酸菌及酵母菌，其中，乳酸菌的菌属更包含有乳酸杆菌属(Lactobacillus),乳酸球菌属(Lactococcus),链球菌属(Streptococcus),明串球菌属(Leuconostoc)及醋酸菌属(Acetobacter);酵母菌的菌属更包含有酵母真菌属(Saccharomyces),假丝酵母属(Candida),克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces),伊萨酵母属(Issatchenkia),毕赤氏酵母属(Pichia)及球拟酵母属(Torulopsis)。
[0058]再者，该新颖乳发酵产物于生物体中具有良好地改善骨质疏松症、防止骨质流失、促进钙质吸收等功效。[0059]因此，该新颖乳发酵产物得以直接应用于生物体中，亦得经由纯化分离而可得到如图11至图18中的任一图中标号I至7所示的胜肽群。该胜肽群得以作为一种食品的组成成份，如发酵乳制品；或该胜肽群得以搭配至少一种营养成份，作为营养补充品，如含有钙离子的营养补充品；或将该胜肽群与至少一种医药上可接受的载体以传统已知方法，制备成医药组合物，用以治疗骨质疏松症或是抑制骨质流失。
[0060]其中，该医药组合物可依据口服投予的需要而选择适合的形式，如颗粒状、丸型、锭剂、粉末、液体等。
[0061]以下，将藉由若干实施例搭配图式更详细地说明本发明。
[0062]实施例一:制备新颖乳发酵产物
[0063]取一定量的动物乳作为原料乳,并以一定量的克弗尔菌元(kefir grain)进行发酵反应，而产制出发酵乳，此即为本发明所揭示的新颖乳发酵产物。
[0064]实施例二:骨质疏松症小鼠动物模式的试验
[0065]本实施例采用复数只雌性C57BL/6J纯品系的黑鼠，其购自台大实验动物中心。
[0066]将该小鼠于八周龄时分别以手术操作切除卵巢，用以作为模拟停经后的骨质疏松症小鼠。再将该骨质疏松症小鼠分为三组，并增加一组经手术处理但未切除卵巢的小鼠做为假手术对照组，而各该组小鼠皆以不同条件处理，其中，第一组为仅喂食水的假手术对照组；第二组为仅喂食水的骨质疏松症小鼠；第三组为喂食该发酵乳的骨质疏松症小鼠；第四组为喂食该发酵乳加钙的骨质疏松症小鼠。各该组小鼠分别生长至一定周龄后予以牺牲，而各组小鼠的每周体重变化如图1所示。
[0067]实施例三:该发酵乳及其与钙的组合物具有延缓骨质疏松的活性
[0068]将各组小鼠牺牲后，分别将第一组至第四组小鼠以高解析X-光微型计算机断层扫描及电子显微镜分析各组小鼠的膝盖端生长板骨小梁(Trabecular bone)。
[0069]各组小鼠的膝盖端生长板横向截面μ -CT扫描影像图及μ _CT扫描3D影像图分别如图2及图3所示，其中，图2A及图3A为第一组小鼠，图2B及图3B为第二组小鼠，图2C及图3C为第三组小鼠，图2D及图3D为第四组小鼠。
[0070]各组小鼠的膝盖端生长板纵向截面μ -CT扫描影像图及其局部放大μ _CT扫描影像图分别如图4及图5所示，其中，图4A及图5A为第一组小鼠，图4B及图5B为第二组小鼠，图4C及图5C为第三组小鼠，图4D及图为第四组小鼠。
[0071]各组小鼠的膝盖端生长板向纵向截面电子显微镜扫描影像图如图6所示，其中，图6A为第一组小鼠，图6B为第二组小鼠，图6C为第三组小鼠，图6D为第四组小鼠
[0072]更进一步以计算机软件(CTAn)分析图2至图6，计算出各组小鼠的骨占组织体积比例、骨小梁矿物质密度(Bone Mineral Density ;BMD)、骨小梁数量(Trabecular Number,Tb.N)及骨小梁分离度(Trabecular Separation/Spacing, Tb.Sp),统计结果依序如图7至图10所示。
[0073]由图2至图6的比对可知，相较于第一组小鼠，仅喂食水的第二组小鼠的骨质结构明显松散、骨小梁数量较少，而喂食该发酵乳的第三组小鼠及同时喂食钙及该发酵乳的第四组小鼠的骨质结构皆与第一组小鼠无显著差异。
[0074]而再分析图7至图10，更可清楚得知仅喂食水的第二组小鼠骨占组织比例、骨小梁矿物质密度及数量显著降低，而骨小梁分离度提高，皆显示出第二组小鼠的骨质严重流失、骨吸收增加、骨质结构松散；而相对于第二组小鼠，喂食该发酵乳的第三组小鼠及同时喂食该发酵乳及钙的第四组小鼠不论骨占组织比例、骨小梁矿物质密度及数量皆显著提升，并有效降低骨小梁分离度，而皆与第一组小鼠的各项数据无显著差异。
[0075]因此，由该实例可知该发酵乳及其与钙的组合物确实可以延缓骨质疏松、增加骨矿物质密度。
[0076]实施例四:分离纯化该发酵乳
[0077]收集实施例 一中所制备的该发酵乳，分批取一定量以高效能液相层析系统(HPLC)将该发酵乳分离，其中，检测波长为215nm，分离管柱为SEC管柱，充提液为IOOmM磷酸盐缓冲液、IM 氯化钠以及 ImM 乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid ;EDTA),酸喊值 6.5,流速为 0.5ml/min。
[0078]各批发酵乳的分离结果分别如图11至图18所示，比对各图的结果，可知各批发酵乳经高效能液相层析系统分离后可得到图中标号为I至7的胜肽群，换言之，可知图11至图18中任一图标号I至7的胜肽群于该发酵乳中具有再现性。
[0079]实施例五:标号I至7的各该胜肽为小片段胜肽
[0080]请参阅图19，其为一定量的蛋白质标准品以高效能液相层析系统，并依据实施例四中的分离条件进行分离所得的图。
[0081]由于标号I至7的胜肽群于该发酵乳中皆有再现性，因此，于该实施例中仅取图11为例而与该蛋白质标准品的HPLC图谱比对。将图11及图19相比对的结果如图20所示，其中，图20A为图11，图20B为图19。
[0082]由图20可知该发酵乳中的标号为I至7的胜肽群的分子大小分别小于2kD，换言之，该发酵乳中标号为I至7的各该胜肽皆为小片段的胜肽。
[0083]实施例六:标号I至7小片段胜肽群具有抗骨质疏松症的活性
[0084]请参阅图21，其是取实施例一中一定量的未经发酵的该原料乳以高效能液相层析系统，并依据实施例四中的分离条件进行分离所得的图。
[0085]由于标号I至7的胜肽群于该发酵乳具有再现性，因此，于本实施例中取图12为例而与的该原料乳的HPLC图谱相比对。将图12及图21相比对的结果如图22所示，其中，图22A为图12，图22B为图21。
[0086]据此，由图22可知未经发酵反应的该原料乳所分离出的蛋白质，相对于该发酵乳，大多属于大分子，且并未出现如图22A所示标号I至7的小片段胜肽群。
[0087]藉由实施例四至实施例六的结果可知该发酵乳中所包含的小片段胜肽群I至7为未发酵乳中所没有，而该发酵乳具有显著延缓骨质疏松及提升骨矿物质密度的能力，因此，图11至图18中任一图中标号I至7所组成的胜肽群为具有抗骨质疏松症活性的胜肽群。
[0088]实施例七:喷雾干燥处理的该发酵乳具有标号I至7所组成的胜肽群[0089]于本实施例中，将该发酵乳经喷雾干糙处理后，取一定量以高效能液相层析系统(HPLC)进行分离粉末状的该发酵乳，其中，分离条件如同实施例四中所述，而得到HPLC图谱，如图23所示。
[0090]由于实施例二中各批次的该发酵乳中皆含有标号I至7的胜肽群，因此，仅取图12为例而与图23相比对，结果如图14所示，其中，图24A为图23，图24B为图12。[0091]由图24可知，即使将该发酵乳以喷雾干燥处理后，仍会具有标号为I至7的小片段胜肽群。换言之，该小片段胜肽群不会因为该发酵乳的处理方式而被破坏。
[0092]由上述各该实施例的说明，可知本发明所揭示的新颖乳发酵产物中至少包含有图11至图18中任一图的标号I至7所组成的胜肽群，而该胜肽群分别为小片段而具有抗骨质疏松症的活性，用以增加骨占组织比例、骨矿物质密度及数量、降低骨小梁分离率。再者，将该发酵乳添加钙后，亦仍具有上述功效。
[0093]以上仅是藉由各该实施例详细说明本发明，熟知该【技术领域】者于不脱离本发明精神下，而对于说明书中的实施例所做的任何简单修改或是变化，均应为本案申请专利范围所涵摄。