专利名称：确定生物通路活性的方法确定生物通路活性的方法本发明涉及一种确定生物通路活性的方法，所述生物通路与疾病相关联的。更精确地说，该方法包括基于基因表达图谱，评估所述通路在患者中的活性水平，所述患者患有所述疾病。本发明还涉及该方法在定向性治疗中的应用。已逐步形成了广泛的微阵列数据分析方法，范围包括从简单的倍数变化方法，到许多复杂的有计算要求的技术。通过微阵列技术的基因表达图谱已成为在研究许多复杂疾病的分子机制时被广泛使用的策略。然而，通过对大多数疾病遇到的生物异质性所进行的分析更加复杂。基因表达分析中一个常见的现象是，许多基因表现出类似的表达模式(I )，其可以分享共同调节控制下的生物学功能。此外，在实验条件(2)的子集中，这些共表达的基因根据它们的表达模式经常组成簇。因此，基因共表达，而不是差异表达，也可能提供信息。 然而,在文献通常使用的方法中不考虑生物识别标志(biological signature)的激活状态，这可以产生一些错误分类(3-7)。因此，本发明人已经开发了一种用于确定患有一种疾病的患者的生物通路的活性水平的方法，提供了一个所述生物通路的活性或非活性的响应指示，其避免了错误分类。本发明的方法允许确定真正的活性生物学网络，所述网络只与高水平的生物识别标志成分的相关性相关联。事实上，考虑到生物网络解释的这种新的相关方面，应允许在细胞水平上捕获实际的激活机制。生物识别标志是指共享一个或多个生物过程的一组基因或它们的产物。当基因在各种生物条件下被共调控或共激活时，相应的表达图谱可能会显示出相对的相似性，或者共表达。以下关于本发明方法的发展，关注，和说明显示出与类风湿关节炎(RA)有关。当然，本发明并不限于RA，其延伸至与其中至少一个生物通路相关联的任何病状之中。作为进一步的例子，所述病状可能是系统性红斑狼疮(SLE)，多发性硬化症(MS)，干燥综合征，I型糖尿病，皮肌炎等……。本发明的用于确定生物样品生物通路的活性水平的方法包括以下步骤，所述生物样品来源于正遭受病状的患者:为建立阴性参考，测量至少三个基因的表达水平，所述基因来自于由个体、对照个体或正遭受病状的患者所组成的组，该组的生物通路是失活的，所述的至少三个基因与所述的生物通路相关联，并且为建立阳性参考，测量上述至少三个基因的表达水平，所述基因来自于由个体、对照个体或正遭受病状的患者所组成的组，该组的生物通路是活性的，所述的至少三个基因与所述的生物通路相关联，并且测量所述患者样品中所述至少三个基因的表达水平，并且将所述患者样品中所述至少三个基因的表达水平与阴性参考中所述至少三个基因的表达水平进行比较，并确定C-值，其对应于所述阴性参考中所述至少三个基因的表达水平与所述患者中所述至少三个基因的表达水平之间的相关联水平，并且将所述患者样品中所述至少三个基因的表达水平与阳性参考中所述至少三个基因的表达水平进行比较，并确定C+值，其对应于所述阳性参考中所述至少三个基因的表达水平与所述患者中所述至少三个基因的表达水平之间的相关联水平，并且建立C+/C-的比率，其给出了相关性得分，其中如果相关性得分低于1，表明生物通路不具备活性，并且如果相关性得分高于或等于1，表明生物通路具备活性。根据本发明，短语“对照个体”包括任何个体，其中所述病状并未进行诊断，特别是包括健康个体，患有所述病状之外的任何其它病状的患者，患有所述病状的无症状患者。本发明还涉及一种通过确定生物通路的活性水平体外建立预测健康个体发生病状的方法，所述方法包括以下步骤:提供健康个体的样品，为建立阴性参考，测量至少三个基因的表达水平，所述基因来自于由个体、对照个体或正遭受病状的患者所组成的组，该组的生物通路是失活的，所述的至少三个基因与所述的生物通路相关联，并且为建立阳性参考，测量上述至少三个基因的表达水平，所述基因来自于由个体、对照个体或正遭受病状的患者所组成的组，该组的生物通路是活性的，并且测量所述健康个体的样品中所述至少三个基因的表达水平，并且将所述健康个体的样品中所述至少三个基因的表达水平与阴性参考中所述至少三个基因的表达水平进行比较，并确定C-值，其对应于所述阴性参考中所述至少三个基因的表达水平与所述对照个体中所述至少三个基因的表达水平之间的相关联水平，并且将所述健康个体的样品中所述至少三个基因的表达水平与阳性参考中所述至少三个基因的表达水平进行比较 ，并确定C+值，其对应于所述阳性参考中所述至少三个基因的表达水平与所述对照个体中所述至少三个基因的表达水平之间的相关联水平，并且建立C+/C-的比率，其给出了相关性得分，其中如果相关性得分低于1，表明生物通路不具备活性，这意味着，健康个体不可能发生病状，并且如果相关性得分高于或等于1，表明生物通路具备活性，这意味着，健康个体可能发生病状。在另一实施例中，本发明还涉及一种通过确定生物通路的活性水平体外建立患者病状诊断的方法，所述方法包括以下步骤:提供患者的样品，为建立阴性参考，测量至少三个基因的表达水平，所述基因来自于由个体、对照个体或正遭受病状的患者所组成的组，该组的生物通路是失活的，所述的至少三个基因与所述的生物通路相关联，并且为建立阳性参考，测量上述至少三个基因的表达水平，所述基因来自于由个体、对照个体或正遭受病状的患者所组成的组，该组的生物通路是活性的，并且测量所述患者样品中所述至少三个基因的表达水平，并且将所述患者样品中所述至少三个基因的表达水平与阴性参考中所述至少三个基因的表达水平进行比较，并确定C-值，其对应于所述阴性参考中所述至少三个基因的表达水平与所述患者中所述至少三个基因的表达水平之间的相关联水平，并且将所述患者样品中所述至少三个基因的表达水平与阳性参考中所述至少三个基因的表达水平进行比较，并确定C+值，其对应于所述阳性参考中所述至少三个基因的表达水平与所述患者中所述至少三个基因的表达水平之间的相关联水平，并且建立C+/C-的比率，其给出了相关性得分，其中如果相关性得分低于1，表明生物通路不具备活性，这意味着，患者不遭受与生物通路活性相关的病状，并且如果相关性得分高于或等于1，表明生物通路具备活性，这意味着，患者正遭受与生物通路活性相关的病状。正如上文所述，本发明还涉及使用上述方法进行定向性/个性化治疗。因此，本发明还涉及一种评估表现病状的患者是否确实需要给药的方法，所述药物直接或间接地与生物通路相互作用，所述方法确定生物通路的生物活性，并且所述生物活性与所述病状相关联，所述方法包括以下步骤: 提供患者的样品，为建立阴性参考，测量至少三个基因的表达水平，所述基因来自于由个体、对照个体或患者所组成的组，该组的生物通路是失活的，所述的至少三个基因与所述的生物通路相关联，并且为建立阳性参考，测量上述至少三个基因的表达水平，所述基因来自于由个体、对照个体或患者所组成的组，该组的生物通路是活性的，并且测量所述患者 样品中所述至少三个基因的表达水平，并且将所述患者样品中所述至少三个基因的表达水平与负参考中所述至少三个基因的表达水平进行比较，并确定C-值，其对应于所述阴性参考中所述至少三个基因的表达水平与所述患者中所述至少三个基因的表达水平之间的相关联水平，并且将所述患者样品中所述至少三个基因的表达水平与阳性参考中所述至少三个基因的表达水平进行比较，并确定C+值，其对应于所述阳性参考中所述至少三个基因的表达水平与所述患者中所述至少三个基因的表达水平之间的相关联水平，并且建立C+/C-的比率，其给出了相关性得分，其中如果相关性得分低于1，表明生物通路不具备活性，这意味着，患者需要给药，并且如果相关性得分高于或等于1，表明生物通路具备活性，这意味着，患者不需要给药。本发明的再一主题涉及一种监测给药患者的治疗反应的方法，所述药物直接或间接地与生物通路相互作用，所述方法确定生物通路的生物活性，并且所述生物活性与所述病状相关联，所述方法包括以下步骤:提供患者的样品，为建立阴性参考，测量至少三个基因的表达水平，所述基因来自于由个体、对照个体或患者所组成的组，该组的生物通路是失活的，所述的至少三个基因与所述的生物通路相关联，并且为建立阳性参考，测量上述至少三个基因的表达水平，所述基因来自于由个体、个体或患者所组成的组，该组的生物通路是活性的，并且测量所述患者样品中所述至少三个基因的表达水平，并且将所述患者样品中所述至少三个基因的表达水平与阴性参考中所述至少三个基因的表达水平进行比较，并确定C-值，其对应于所述阴性参考中所述至少三个基因的表达水平与所述患者中所述至少三个基因的表达水平之间的相关联水平，并且将所述患者样品中所述至少三个基因的表达水平与阳性参考中所述至少三个基因的表达水平进行比较，并确定C+值，其对应于所述阳性参考中所述至少三个基因的表达水平与所述患者中所述至少三个基因的表达水平之间的相关联水平，并且建立C+/C-的比率，其给出了相关性得分，其中如果相关性得分低于1，表明生物通路不具备活性，这意味着，患者对药物具有不良的反应，并且如果相关性得分高于或等于1，表明生物通路具备活性，这意味着，患者对药物具有良好的反应。下面公开根据本发明方法的优选实施例，所述实施例单独或组合使用。因此，根据优选的实施例，通过分析所述样品中核酸或蛋白质的表达水平确定所述至少三个基因的活性水平。所述核酸包括RNAs或由所述RNAs获得的cDNAs，RNAs包括长和短 RNAs，如 mRNA，miRNA。来自患者的生物样品可以是组织样品或流体样品，例如血液，血浆，血清，尿，滑液和脑脊液样品。在他们的研究中，本发明人选择干扰素(IFN)诱导基因识别标志作为例子来研究构成该识别标志的基因之间的相关性水平。因此，如上所述优选的方法涉及I型干扰素(type I IFN)的生物通路。事实上，已经报道在不同的疾病中干扰素调节基因均增加，如类风湿关节炎(RA)，系统性红斑狼疮(SLE) (4)，全身性硬化症(8)，多发性硬化(9)和来自干燥综合征患者的组织中(10)，I型糖尿病(11-13)和皮肌炎(12)。但是，为表征IFN识别标志，采用普通的方法来计算IFN“得分”，即基于组成该识别标志的基因的平均表达，为每一个患者和对照计算IFN “得分”。然而，正如上面所解释的，这种方法不考虑这些干扰素诱导基因的共调节。事实上，具有类似功能的基因通常是仅在特定的实验条件下才共表达。根据本发明提供了一种替代的方法，依据该方法可以通过整体相关性水平，而不仅仅是表达水平，对IFN的识别标志进行表征。事实上，我们基于IFN相关基因平均表达的分析结果，表明HC和RA患者在分类上的不一致性(9%，图6)。可以采用不同的因素对IFN识别标志中基因表达与相关性水平之间的这些差异进行解释。研究表明，可以通过IFN信号传输上几个独立的途径对IFN相关基因进行调节[14，15]。也可以通过主要组成这些基因启动子区域的多态性序列进行控制[16，17]。这些不同的因素可以解释这些基因表达中个别异质性的存在，以及由此带来的两种方法之间所观察到的差异。下面的实验部分，通过示例的方式，而不是通过限制的方式，阐示了本发明方法的开发，其中所述生物通路涉及人I型干扰素 (IFN)的表达以及类风湿关节炎(RA)的病状，所述方法涉及与所述通路相关联的35个基因。附1:1FN识别标志的基因表达图谱。35个干扰素诱导基因的非监督层次聚类(unsupervised hierarchicalclustering)，所述基因用于从RA患者IFNffi(树图②)中区别类风湿关节炎(RA)患者IFN高(树图①)。每一行代表一个基因；每一列显不每一患者表达的35个IFN诱导基因的表达。深灰色表示以较高水平表达的基因，浅灰色表示以较低水平表达的基因。图2:来自类风湿关节炎(RA)患者亚组的相关性图谱。相关性指数被定义为每个IFN识别标志基因作为其与其余基因的相关性的中位数。因此，使用35个计算出的相关性索引来代表不同组的相关性图谱，RA IFNffi(虚线)和RA IFN*(连续线)。从不同组获得的相关性索引的中位数值分别为0.33和0.63。图3:根据 IFN 识别标志的个体分层(Stratification of individuals)。每一个点代表了一个具有决定变量的单个个体，所述决定变量基于生物识别标志(CABS)，从分类算法计算而来。阴影框表示根据CABS规则的正常范围:如果Ds 1“高识别标志”，并且如果Ds低〈1 “低识别标志”，已知D高低=COR高/COR低。图4:来自于不同组的相关性图谱。相关性指数被定义为每个IFN识别标志基因作为其与其余基因的相关性的中位数。因此，使用来自 IFN识别标志基因的35丨个计算出的相关性索引来代表不同组的相关性图谱:健康对照组(HC) IFNffi (③)，HC IFN高(④)，类风湿关节炎患者(RA) IFNffi (①)和RAIFNS(②)，以及系统性红斑狼疮患者(SLE) IFNs((S))0从不同组获得的相关性索引的中位数值分别为 0.27,0.44,0.33,0.63 和 0.68。图5:采用抗-TNF治疗的类风湿关节炎(RA)患者中后续的IFN识别标志。每一个点代表了一个具有决定变量的单个个体，所述决定变量基于生物识别标志(CABS)，从分类算法计算而来。阴影框表示根据CABS规则的正常范围:如果Ds 1“高识别标志”，并且如果Ds 低识别标志”，已知Ds ffi=C0Rs/C0Rffi。威尔科克森符号秩次检验(Wilcoxon signed rank test)用来评估抗-TNF治疗前和治疗后A) (*P=0.0186)B)(**P=0.002)。结果表明，经抗-TNF治疗后，高IFN识别标志被保留(图5A)，而治疗后的6个月，RA IFNffi中观察到显著的增加(图5B)。图6:1FN识别标志的表征方法的比较分析。每一个点代表一个单个个体。y轴代表由CABS计算出的IFN识别标志的决定变量。灰色的虚线表示根据CABS规则的阈值:如果Ds 1，识别标志被定义为“高识别标志”，并且如果D高低〈1，识别标志被定义为“低识别标志”，已知D高低=COR高/COR低。X轴代表识别标志的基因表达的平均值。固体灰色线表示IFN反应的阈值，通过计算HC(正常值，定义为35个IFN-相关基因的平均(SD)表达，±1.96SD)的95%限制而来。如果平均基因表达彡9.68，识别标志被定义为“高识别标志”，并且如果平均基因表达比率〈9.68，识别标志被定义为“低识别标志”。阴影框显示这两种方法之间观察到分歧。黑色三角形代表了具有基因表达高平均值和低决定变量的个体。黑色的正方形代表了具有基因表达低平均值和高决定变量的个体。举例说明本发明。方法患者和对照102例符合经修订的美国风湿性学会1987年风湿病标准的患者进行了登记。其临床特征示于表I。作为IFN阳性对照组(IFNs)，对10例符合美国风湿性学会系统性红斑狼疮标准的系统性红斑狼疮患者(SLE)进行了研究。此外，还招募了 100名年龄和性别匹配的无任何RA、自身免疫性疾病和合并用药家族史的健康对照组(HC)。所有受试者签署了知情同意书，并且这项研究得到了当地临床研究伦理委员会的批准。表I描述了患者和健康对照组的人口统计学和临床特征。表1:患者和健康对照组的人口统计学和临床特征 用于确定正遭受病状的患者的生物样品中生物通路的活性水平的方法，所述方法包括以下步骤建立阴性参考，测量至少三个基因的表达水平，所述基因来自于由个体、对照个体或患者所组成的组，该组的生物通路是失活的，所述的至少三个基因与所述的生物通路相关联，并且建立阳性参考，测量所述至少三个基因的表达水平，所述基因来自于由个体、对照个体或患者所组成的组，该组的生物通路是活性的，并且测量所述患者样品中所述至少三个基因的表达水平，并且将所述患者样品中所述至少三个基因的表达水平与阴性参考中所述至少三个基因的表达水平进行比较，并确定C-值，其对应于所述阴性参考中所述至少三个基因的表达水平与所述患者中所述至少三个基因的表达水平之间的相关联水平，并且将所述患者样品中所述至少三个基因的表达水平与阳性参考中所述至少三个基因的表达水平进行比较，并确定C+值，其对应于所述阳性参考中所述至少三个基因的表达水平与所述患者中所述至少三个基因的表达水平之间的相关联水平，并且建立C+/C-的比率，其给出了相关性得分，其中如果相关性得分低于1，表明生物通路不具备活性，并且如果相关性得分高于或等于1，表明生物通路具备活性。