专利名称：一种草鱼注射疫苗增效剂及其制备方法目前，草鱼病害问题仍是决定养殖成功与否的重要因素之一。传统的化学药物防 治虽可起到一定的作用，但也引起了病原体产生耐药性、病原变异频率加快、养殖环境失衡 等问题，严重威胁人类健康，不利于水产养殖可持续发展。免疫防治是通过免疫接种的方式 提高水产动物对病原的特异性抗体水平，从而减少疾病的发生。免疫防治无毒副作用，绿色 环保，且能从根本上提高机体的抵抗力，是将来水产动物疾病防治的必然趋势。国内从上世 纪70年代开始，先后开展了草鱼组织浆疫苗、出血病疫苗及草鱼细菌性烂鳃、赤皮、肠炎等 疫苗方面的工作，但免疫效果不稳定，因此一直没有得到广泛推广应用。佐剂能一定程度上 提高水产疫苗的免疫效果，如铝胶、矿物油等，但这些常用的佐剂对很多抗原效果不确定， 或对鱼体有较大的副作用。β -葡聚糖具有较强的免疫调节作用，能促进机体巨噬细胞吞噬和杀菌活性，刺激 机体B细胞、T细胞的生成，提高机体对抗原的免疫应答水平，β-葡聚糖作为非特异性的 免疫调节剂，不仅能激活免疫细胞，还能促进细胞因子生成，激活补体系统，促进抗体产 生，对免疫系统发挥多方面的调节作用。与其他免疫增强剂不同，葡聚糖对免疫系统 不会造成过度刺激，因此体弱和免疫机能受损的鱼体同样可以使用。半乳甘露寡糖不仅能够激活巨噬细胞，诱导机体体液免疫反应，增强动物体的非 特异性免疫功能，且具有特殊的抗菌效果，能显著增强动物对各种环境的应激机能。枯草芽孢杆菌外膜蛋白和多糖能刺激机体免疫细胞，促进细胞活力，起到佐剂的 作用，且枯草芽孢杆菌可作为一种“自然微粒”佐剂使机体免疫相关的组织处于高度的“免 疫准备状态”，从而促进机体较快的产生相应的抗体，促进Τ、Β淋巴细胞的产生，提高机体体 液和细胞免疫水平。中国专利申请公开号CN101390925A (
本发明的目的在于克服现有技术中免疫注射剂佐剂效果不稳定、对动物体副作用 大等缺陷，提供一种用于草鱼的注射疫苗增效剂。本发明的另一目的在于提供上述用于草鱼的注射疫苗增效剂的制备方法。本发明的又一目的是提供上述用于草鱼的注射疫苗增效剂在免疫草鱼中的应用。本发明的上述目的通过以下技术方案实现一种草鱼注射疫苗增效剂，每毫升增效剂有效成分为酵母β -1，3葡聚糖0. 1 0. 2g，半乳甘露寡糖0. 05 0. Ig,枯草芽孢杆菌3X IO8CFU 3X 101(ICFU。优选方案为酵母 β -1，3葡聚糖0. 2g，半乳甘露寡糖0. lg，枯草芽孢杆菌3X 101(ICFU。上述增效剂中，酵母β-1，3葡聚糖为水溶性的，能够激活机体免疫细胞，增强和 刺激动物体的非特异性免疫功能和产生特异性免疫功能，提高机体的免疫能力。上述增效剂中半乳甘露寡糖激活巨噬细胞，诱导机体体液免疫反应，且具有特殊 的抗菌效果，能显著增强动物对各种环境的应激机能。上述增效剂中，枯草芽孢杆菌作为一种“自然微粒”佐剂使机体免疫相关的组织处 于高度的“免疫准备状态”，从而促进机体较快的产生相应的抗体，促进τ、B淋巴细胞的产 生，提高机体体液和细胞免疫水平。上述草鱼注射疫苗增效剂的制备方法，包括以下步骤称取1 2g酵母β -1，3葡聚糖，0. 5 Ig半乳甘露寡糖加入到IOmL枯草芽孢杆菌菌 液中，充分混和均勻。优选方案为将枯草芽孢杆菌用0. 01 M PBS, ρΗ7. 2的磷酸盐缓冲液调整到3 X IO8 CFU/mL 3X 101(lCFU/mL，4°C保存；称取酵母β _1，3葡聚糖和半乳甘露寡糖加入到上述枯 草芽孢杆菌菌液中，用0.01Μ，ρΗ7. 2的无菌PBS调节浓度，使酵母β _1，3葡聚糖终浓度为 0. 1 0. 2g /mL,更优选0. 2g/mL ；半乳甘露寡糖终浓度为0. 05 0. Ig /mL,优选0. Ig / mL，充分混和均勻。上述草鱼注射疫苗增效剂在免疫草鱼中的应用，是在注射疫苗前配制增效剂，现 配现用，然后与注射疫苗按1:50 100的体积比混合，最大体积比为1 100，注射剂量为按 鱼体重注射0. 1 0. 3ml。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果在疫苗口服和浸泡效果不稳定的情况下，疫苗注射仍为首选的免疫方式，本发明将酵 母β -1，3葡聚糖、半乳甘露寡糖及枯草芽孢杆菌联合制成免疫增效剂，是专门针对草鱼的 生物学特性制备而成的。该增效剂对注射用疫苗具有明显的增强作用，起到较好的免疫效 果，提高疫苗的保护期，能够满足生产需求。枯草芽孢杆菌与现有的注射用佐剂相比，这种 天然的微粒佐剂对鱼体没有副作用，且能刺激细胞活性，产生快速、持久的免疫应答反应。 酵母β -1，3葡聚糖和半乳甘露寡糖作为免疫增强剂在注射疫苗方面未见应用。本发明增效剂组分较少，制备方法简单易操作，成本低廉，增效作用明显，适于广 泛应用。
培养基配方20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0. 5g牛肉膏+20g琼脂，溶于IL蒸 馏水后高压灭菌。将枯草芽孢杆菌在上述液体培养基中培养12小时后，用0.01 M PBS, PH7. 2的磷酸盐缓冲液洗涤3次，然后用PBS调整到3X 101(lCFU/mL，4°C保存。注射前根据 菌液体积称量酵母β -1，3葡聚糖、半乳甘露寡糖，使其在增效剂中的终浓度分别为0. 2g/ mL、0. 1 g/mL，将增效剂按1 :50加入疫苗中，现配现用。实施例2 增效剂的制备
培养基配方20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0. 5g牛肉膏+20g琼脂，溶于IL蒸馏水后高压灭菌。将枯草芽孢杆菌在上述液体培养基中培养12小时后，用0.01 M PBS, PH7. 2的磷酸盐缓冲液洗涤3次，然后用PBS调整到3X 101(lCFU/mL，4°C保存。注射前根据 菌液体积称量酵母β -1，3葡聚糖、半乳甘露寡糖，使其在增效剂中的终浓度分别为0. 2g/ mL、0. 1 g/mL，将增效剂按1 100加入疫苗中，现配现用。
实施例3 本发明增效剂对草鱼弱毒疫苗的增效作用
选取实施例1和2中的增效剂对草鱼弱毒疫苗增效。草鱼弱毒疫苗为珠江水产研究所 生产的草鱼冻干细胞弱毒苗。选择体质健壮的草鱼种，体重50士5g，共600尾，放养于3个 : X an X an的网箱中，水温洲士 2 °C，暂养7d确定无病后进行免疫注射，分别为增效组、正 常疫苗组、对照组(PBS)，背鳍基部注射0. 2mL/尾，免疫观天后，随机抽取网箱内的试验鱼
；，连续观察14d，统计死亡率，按下列公式计算
30尾，注射1 10病毒组织浆0. 3mL进行攻 成活率和相对免疫保护率，实验结果见表1。
成活率=(攻毒数-死亡数)/攻毒数X 100%
相对保护率=(PBS对照组死亡数-实验组死亡数)/PBS对照组死亡数X 100%
表1本发明对草鱼疫苗的免疫增强效果


本发明公开了一种草鱼注射疫苗增效剂，每毫升增效剂有效成分为酵母β-1,3葡聚糖0.1～0.2g，半乳甘露寡糖0.05～0.1g，枯草芽孢杆菌3×108CFU～3×1010CFU。本发明还公开了上述增效剂的制备方法，是将1～2g酵母β-1,3葡聚糖，0.5～1g半乳甘露寡糖加入到10mL枯草芽孢杆菌菌液中，充分混和均匀。本发明还公开了上述草鱼注射疫苗增效剂在免疫草鱼中的应用。与现有技术相比，本发明增效剂组分较少，制备方法简单，且对草鱼疫苗具有明显的增效作用，能够提高疫苗对草鱼的保护效果，延长免疫保护期。

公开日2011年5月18日 申请日期2011年1月26日 优先权日2011年1月26日