专利名称：一种检测禽流感病毒通用亚型的液相芯片方法禽流感(Avian Influenza, Al)是由流感病毒属的A型流感病毒引起的禽类感染疾病的总称。鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽及野鸟、水禽、海鸟等均可感染。候鸟、观赏鸟、 散禽携带病毒迂徙可能是禽流感世界性流行的主要原因。禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)亚型众多、变异性强，存在抗原飘移和抗原转变，不同亚型、不同分离株病毒的差异很大。世界动物卫生组织(OIE)将高致病性禽流感(HPAI)规定为法定上报的动物疫病之一。禽流感的爆发一直是困扰全球养禽业的一个难题，尤其是HPAI可导致高达100% 的发病率和死亡率，并可感染人并致人死亡。禽流感检测方法包括传统方法和分子生物学方法，前者如病毒分离和血清学诊断等方法，其缺点是操作繁琐、诊断时间长等，而分子生物学方法如RT-PCR等具有特异、敏感、简便快捷等特点，克服了传统方法的局限性，但不能进行高通量检测，不能满足高通量检疫的要求，更不利于大量通关样品的检疫和疫情暴发时大批量样品的紧急筛查，因而需要建立一套简便、快速、准确的禽流感病毒筛查和检验技术，以满足日常检测的要求。液相芯片称为微球体悬浮芯片(suspension array, liquid chip)，是基于 xMAP (flexible Multi Analyte Profiling)技术的新型生物芯片技术平台，它是在不同荧光编码的微球上进行抗原抗体、酶、底物、配体、受体的结合反应及核酸杂交反应，通过红、 绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的，一个反应孔内可以完成多达100种不同的生物学反应，是继基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子检测技术平台。液相芯片技术平台是既能保证信息质量，又能提供相对高通量的新一代分子诊断技术平台，这个技术平台整合了生物检测，乳胶微球荧光编码，微液体传送系统，激光实时记录，先进电脑软件和数据处理模式等多种先进技术。液相芯片的核心技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色(固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置给基因的特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码)。应用时，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入微量待检测或分析标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合。结合的结果可以在瞬间经激光判定后由电脑以数据信息的形式记录下来。因为分子杂交是在悬浮溶液中进行，检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称。液相芯片技术平台具有高效性因为上百种颜色的乳胶微球可以在同一个反应体系内，所以一小份标本(血，或其它体液，组织)可以被用来同时检测上百个生理或病理指标。液相芯片技术平台具有高敏感性每个乳胶微球上都可以满满地(以共价键牢固结合的方式)包被上抗原、抗体、或核酸。因为探针密度高，产生的信号强，加上使用荧光检测， 所以敏感性大大高于任何现有分析、诊断方法，也高于其它芯片法。液相芯片技术平台是一种快速检测方法因为杂交在悬浮的液相中进行，所以反应需要时间短杂交后常不用清洗就可以直接读数，且检测效率大大高于固相杂交，所用时间从几小时缩短到十几分钟。
本发明的目的在于提供一种检测禽流感病毒通用亚型的液相芯片方法；本发明的目的还在于提供一种检测禽流感病毒通用亚型的液相芯片试剂盒。为实现上述目的，通过从GenBank (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)中收集禽流感病毒M基因序列，利用Bioedit分子生物学分析软件对大量收集的序列进行分析比较，筛选禽流感病毒M基因特异性保守序列。在对序列分析的基础上，根据筛选的保守序列，参照GenBank(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)中发表的禽流感病毒M基因组序列(登录号 FJ966954)，应用DNAMar、Bioedit、Primer5. O和OMIGA软件分别对其进行初步分析筛选， 设计了禽流感病毒通用亚型的特异性引物和探针，分别对引物进行生物素标记，对探针进行氨基修饰。本发明提供的用液相芯片检测禽流感病毒通用亚型的引物，其核苷酸序列为M-FP 5 ’ -CAAGACCAATCCTGTCACCT-3’，M-RP 5，-GGGTCTCCATTCCCATTTAG-3，，在 M-RP 引物的 5，端用生物素标记。本发明提供了一种用液相芯片检测禽流感病毒通用亚型的探针，其核苷酸序列为5，-GTGAGCGAGGACTGCAGCGTAG-3，，在其 5，端用氨基修饰。本发明提供了一种液相芯片，是特异性检测探针与荧光标记微球偶联制成的特异性检测微球，该特异性检测探针为5’ -GTGAGCGAGGACTGCAGCGTAG-3’，在其5’端用氨基修饰。本发明提供了一种用液相芯片检测禽流感病毒通用亚型的方法，用上述引物 (M-FP和M-RP)，对样品RNA进行RT-PCR扩增反应，将带生物素标记的RT-PCR产物与本发明提供的偶联在荧光微球上的探针进行分子杂交后，检测微球的荧光值，确定样品中是否含有禽流感病毒。本发明提供一种用液相芯片检测禽流感病毒通用亚型的方法，包括下列步骤1)提取样本中禽流感病毒RNA ；2)以步骤1)提取的样本RNA为模板，以本发明提供的引物进行RT-PCR反应；3)将本发明提供的探针与荧光标记微球偶联；4)杂交将带有生物素标记的步骤2)中的RT-PCR产物与步骤3)中的偶联到荧光微球上的探针在PCR仪上杂交；5)检测荧光值，以平均荧光值大于100且为阴性对照3倍以上荧光值所对应的检测标本为阳性。其中步骤2)的RT-PCR反应50 μ L反应体系为一步法 RT-PCR buffer(5 χ) dNTP ( 10mmol/L) 酶混合物 RNA酶抑制剂 RNA模板 M-FP (ΙΟμιηοΙ/L) M-RP (ΙΟμιηοΙ/L)ddH20(不含 RNA 酶)RT-PCR反应条件为本发明提供了用于检测禽流感病毒通用亚型的液相芯片方法，通过对禽流感病毒M基因组序列的比对和分析，找出保守区域，设计了禽流感病毒通用亚型的特异性引物和探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3所示。用上述引物对禽流感病毒RNA进行RT-PCR扩增，同时将探针与微球偶联；RT-PCR扩增产物和偶联到微球上的探针进行杂交，通过检测荧光值，建立了检测禽流感病毒通用亚型的液相芯片方法。本发明的检测方法具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点。