专利名称：一种人巨细胞病毒核酸检测的高灵敏度方法人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)是疱疫病毒科β属DNA病毒，正常人群中自然感染普遍。在美国，3 10岁儿童每年血清HCMV抗体阳转率为3% 6.2%;在英国，青年人HCMV抗体阳性率为10% 15%，中上阶层成年人中达40% 60%，下层人群中达80%;发展中国 家，3岁以下儿童抗体阳性率达80%，成年人群中几乎达100%。据调查我国育龄妇女70 90%曾发生过HCMV感染，4.3 19.59%孕妇妊娠期间发生过HCMV感染，HCMV宫内传播率约为17 80%。HCMV感染呈全球分布，人是HCMV的唯一宿主。HCMV的传播发生于人之间的直接接触和体液传播，多数HCMV感染是在围生期和婴儿期，或在成年期通过性接触。HCMV检测是围产医学和优生学中的重大研究课题。孕妇感染HCMV后，多无明显临床表现，但病毒可经胎盘传播给胎儿，由于胎儿对HCMV具有很高的易感性，易造成先天性感染。母亲初次感染后，胎儿先天性感染发生率约为25% 75%。有关前瞻性研究发现宫内被HCMV感染的胎儿中约有1/3出现巨细胞包涵体病(Cytomegalovirus inclusiondisease, CID)即约5%在早期出现流产和死胎等症状，约25_35%存活婴儿可发生体重低下、肝脾肿大、黄疸、失明、脑畸形、血小板减少性紫癜、先天性智力低下及神经性耳聋等症状。成人HCMV感染发病与免疫功能有密切关系，如器官移植者常因免疫抑制使潜伏的病毒活化而发病，艾滋病患者的HCMV感染发病率高。免疫缺陷患者及免疫抑制治疗，肝、肾、心脏等器官移植，肿瘤及骨髓移植等可产生广泛的HCMV复发性感染，骨髓移植患者三分之一以上可兼发有症状的HCMV感染并导致间质性肺炎，后者病死率高达40%。因此HCMV感染是目前导致骨髓移植失败的重要原因之一。为了能早期、快速而准确的检测HCMV感染，以便及时给予治疗以降低疾病的严重性和死亡率，故建立快速灵敏且特异的检测技术至关重要。在已有的检测方法中病毒培养分离为最准确的方法，但耗时长，结果受标本保存时间影响较大，在临床应用中困难；电镜快速、准确，一般适合实验室研究；免疫学方法在HCMV研究和诊断中有广泛使用，但检出的灵敏度有待提高；而核酸诊断敏感性及特异性均佳，是应用发展的方向。
本发明专利的目的是提供一种HCMV病原体核酸的高灵敏度检测方法，此方法克服了常规方法的上述问题，应用此方法检测HCMV病原体的敏感度和特异度较高，检测HCMV病原体感染的真实性较好。在达到上述目的中，根据本发明提供了一种筛检人巨细胞病毒的方法，即套式PCR。此方法是提取病原DNA模板，使用病原特异性外侧上下游引物进行第一轮PCR扩增，以第一轮的扩增产物为模板，使用病原特异性内侧上下游引物进行第二轮PCR扩增。所用到的仪器有PCR扩增仪，超速低温离心机，移液器，电泳仪，水浴箱。主要试剂有Taq聚合酶，上下游引物。2本发明详细描述步骤I血清病毒DNA的提取方法试剂以及配制I)蛋白酶K称取20mg蛋白酶K，用消毒蒸馏水溶解并定容至1ml，作为贮存液于_20°C存放。2)电泳用10XTBE缓冲液贮存液称取Tris54g，硼酸TL 5g，加入蒸馏水约400ml，搅拌溶解，再加入0.5MEDATA(PH=8.0) 20ml，定容至 500ml。电泳或制备琼脂糖凝胶时需先用蒸馏水将10 X TBE稀释10倍成I X TBE缓冲液。3)琼脂糖凝胶的配置I).配制适量的电泳及制胶用的缓冲液0.5XTBE。2).根椐制胶量及凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉，加入适当的锥形瓶中，然后在微波炉中加热熔化琼脂糖。溶液冷却几分钟后加入溴乙锭溶液(终浓度0.5mg/ml)，并充分混匀。3).将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在3 5_之间。4).在室温下使胶凝固(大约30分钟 I小时)，然后放置于电泳槽中进行电泳。步骤2血清病毒DNA的分离提取步骤(I)在室温下血液离心，将上层血清移至EP管中，再吸取IOOul血清加入另一 EP管。(2)加入PEG6000和NaCL至终浓度分别为10%和lmol/L，充分混匀，室温放置lh。(3)以 12000r/min 离心 30min,弃上清液。(4)用 200 μ L 裂解液(裂解液:终浓度为 20mmol/Ltris-HCL，pH8.0, IOmmol/LEDTA，pH8.0，lmg/mlSDS，0.8mg/mL 蛋白酶 K)作 I: I 混合 65°C水浴 4h，99°C加热 15min。(5)加1/3体积5MNaCL，混匀4°C静置I小时。(6)以12000r/min离心IOmin,将上清液移至另一 EP管中。(7)加入等体积的饱和酹,充分混勻，以12000r/min离心IOmin,将上清液移至另一 EP管中。(8)加入等体积的氯仿:异戍醇(24: I),充分混勻，以12000r/min离心IOmin,抽提2-3次，直至有机相与无机相无白色成淀为止。(9)取上清加入1/10体积的3mol/L，pH5.2的乙酸钠，弹匀后加入2.5倍体积的冰冷的无水乙醇，振匀，_20°C放置过夜。(10)第二日以12000r/min离心IOmin,小心弃上清。(11)用70%的乙醇洗漆两次，以12000r/min离心5min,弃上清,所得沉淀室温干燥 lOmin。(12)用TE缓冲液溶解DNA，使其A260/280的比值界于1.65-1.80之间，将DNA的终浓度定量为150-200ng/l.! L，_20°C保存待用。(13)测定所提DNA的纯度和含量。步骤3巢式PCR实验方法(I)检测人巨细胞病毒核酸时其第一轮PCR反应体系是:10X扩增缓冲液5ul，dNTPmix (IOmmol) lul,上游和下游引物(10pmol/ul)各 1.5ul,病毒模板DNAlul, Taq DNA聚合酶(5U/ul) 0.5ul, MgC12 (25mmol) 3ul,灭菌双蒸水补足 36.5ul。检测人巨细胞病毒核酸时第一轮PCR反应条件是:预变性91°C 5min，循环91°C 30S、56°C lmin、72°C Imin 共 35 个循环，延伸 72°C IOmin0(2)第一轮PCR反应引物:上游引物P1: TGAGGATAAGCGGGAGATGT下游引物P2:ACTGAGGCAAGTTCTGCAGT(3)检测人巨细胞病毒核酸时其第二轮PCR反应体系是:10X扩增缓冲液5ul，dNTPmix (IOmmol) Iul，上游和下游引物(10pmol/ul)各1.5ul，第一轮PCR扩增病毒核酸产物模板 DNA 5ul, Taq DNA 聚合酶(5U/ul) 0.5ul, MgC12 (25mmol) 3ul,灭菌双蒸水补足32.5ul。检测人巨细胞病毒核酸时第二轮PCR反应条件是:预变性93 °C 5min，循环91°C 30S、56°C lmin、72°C Imin 共 30 个循环，延伸 72°C IOmin0(4)第二轮PCR反应引物: 上游引物P3:AGCTGCATGATGTGAGCAAG下游引物P4: GAAGGCTGAGTTCTTGGTA(5) PCR产物电泳检测:通常应用I 2%的琼脂糖凝胶，EB溴乙锭染色紫外仪下观察扩增特异性条带，判断产物的灵敏度和特异性。本发明相比现有技术具有以下优点:1、荧光定量PCR与套式PCR对HCMV感染检测的比较表IHCMV荧光定量PCR检测结果与n_PCR结果分布本发明涉及一种巨细胞病毒核酸的检测试验方法，此方法是提取病原DNA模板，使用病原特异性外侧上下游引物进行第一轮PCR扩增，以第一轮的扩增产物为模板，使用病原特异性内侧上下游引物进行第二轮PCR扩增。套式PCR方法检测HCMV病毒感染的灵敏度、特异度以及真实性优于ELISA方法和荧光定量PCR，为临床实践提供一种高灵敏度的方法。