专利名称：一种检测十四种常见致病菌的复合基因芯片及方法—种检测十四种常见致病菌的复合基因芯片及方法背景技木生物毒素(biotoxin)亦称天然毒素(natural toxin),是指生物来源不可自主复制的有毒化学物质，包括动物毒素、植物毒素和微生物毒素等。其中微生物毒素主要由产毒微生物生长过程中分泌以及死亡后体内的物质释放而产生的，可以分为细菌毒素(bacterial toxin)和真菌毒素(mycotoxin)。常见的细菌毒素有金黄色葡萄球菌毒素、产肠毒素大肠杆菌肠毒素、志贺样毒素、志贺菌毒素、霍乱毒素、溶血毒素等。常见真菌毒素有黄曲霉毒素、伏马菌素等。对于上述诸多微生物毒素快速、准确的检测是有效预防中毒事件发生的前提和关键。但目前由于天然食物生产的全球化、新食品生产エ艺的应用、人们饮食 习惯的改变等各种因素在一定程度上増加了产毒微生物感染的途径，造成各种产毒微生物引起大規模中毒事件屡屡发生，以产毒微生物为根源的中毒占食物中毒事件之首位，其毒性之高仍是化学合成毒物都难以达到的。因此发展产毒微生物的快速检测、鉴定方法一直为国际上研究的热点。目前国内外对细菌毒素和真菌毒素的直接检测存在一定的难度。主要的方法有①生物法有很大局限性，只能测出其毒性大小，无法确知其组成；所测得的毒性和小鼠的品系、状态、体重等有夫，不确定因素很多很复杂；毒性测定结果重复性差；测试所需时间长，需专门人员，费用高。②基于免疫技术的免疫层析法、酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫印迹等。随着单克隆抗体和多克隆抗体制备技术的发展，免疫学检测地敏感性及特异性均有提高，但仍存在一定的问题。免疫学检测不可避免地可能发生交叉反应，使用的化学试剂也可能掩盖毒素的存在，实验受试剂纯度的影响很大，引起假阳性或假阴性。此外，与仪器测定相比免疫方法的检测灵敏度不高，只能作为快速筛选，常常需要检测限较低的仪器作结果确证。③基于仪器測定的薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、气质联用(GC-MS)、液质联用(HPLC-MS)、免疫亲和柱-荧光检测(IAC-FLD)。仪器测定有灵敏度高、检测限低、自动化程度高的优点。然而此方法所需仪器昂贵，人员技术要求高，标准品毒性大，ー些毒素标准品难以获得。另外，现时的仪器和技术尚未能实现同步检测多种毒素及其衍生物。④基于核酸和基因探针技术的PCR反应(Polymerase Chain Reaction,)和实时荧光PCR法(Real-Time PCR)等。基因芯片(gene chip)又称DNA芯片，是20世纪90年代发展起来的ー项专门用于核酸检测的前沿生物技术，是在分子杂交技术和微晶技术(microfabrication technology)的基础上发展起来的生物高技术,具有传统的检测方法不可比拟的优点微型化、高通量、并行处理、快速分析、高准确性、高灵敏度、定量分析等。能够对污染食品的产毒细菌、真菌的毒力基因实现快速的在线检测，及时反映食品中存在的潜在毒素污染问题。基因芯片技术是将待测样品DNA或RNA通过PCR扩增、RT-PCR扩增、体外转录等技术渗入探针分子后，与位于芯片上的探针分子杂交。通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，检测杂交信号強度。计算机软件进行数据的比较和综合分析后，即获得样品中大量基因序列特征或基因表达特征信息。由于微生物毒素种类众多，且存在许多结构相似的衍生化合物，因此现有方法分别在特异性、灵敏度、适用范围、检测成本等方面有较大局限性。基因芯片具备高通量的优点，通过反向杂交技术，可同时高通量、并行分析处理多基因、多序列，从而对多种产毒微生物进行同步检测鉴定。
用于检测金黄色葡萄球菌的靶基因FemA的探针金黄色葡萄球菌I探针，其序列为GCT CAC TAT TTG CTT GGC TTT G,金黄色葡萄球菌2探针，其序列为TTT GAC TCT CAT TCAAAT GTT G ；用于检测沙门氏菌的靶基因invA的探针沙门氏菌探针，其序列为AAT AAG ACC GGC CTT CTA GG;用于检测空肠弯曲菌的靶基因VSl的探针空肠弯曲菌I探针，其序列为TGAAAG TGA TAG CGC TAGACA G,空肠弯曲菌2探针，其序列为AAC TAT TAG GCT CTT GGA GGC T ；用于检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的靶基因ail的探针小肠结肠炎耶尔森氏菌I探针，其序列为AGC AAT TGC CAG TTA TCC AT，小肠结肠炎耶尔森氏菌2探针，其序列为TGG AGC AAC ATT GAT GAA CA ；用于检测副溶血性弧菌的靶基因tlh的探针副溶血性弧菌I探针，其序列为ATC TGC ACAAGC ACT AAG CG,副溶血性弧菌2探针，其序列为GAT GGC ACG CAA CAT TCC AC ；用于检测霍乱弧菌的靶基因ompW的探针霍乱弧菌I探针，其序列为GTG TAC TAATTG TCC GCA CC,霍乱弧菌2探针，其序列为TAC CAC TAC TTG GAA GCA AG ；用于检测肠出血性大肠埃希氏菌0157:H7的靶基因rfbE的探针0157:H7 探针，其序列为 GTGAAC TGAACG GCA CCA TC ；用于检测腊样芽孢杆菌的靶基因16s rRNA-b的探针腊样芽孢杆探针，其序列为TGC TAC GCA TTG GCA CTG GCA CCT ；用于检测产气荚膜梭菌的靶基因CP α的探针产气荚膜梭菌探针，其序列为TAC TAG TTG TAT TAG GCT CC;用于检测志贺氏菌的靶基因ipaH的探针志贺氏菌I探针，其序列为CAT TTC TGC CGA CGC AGT CA,志贺氏菌2探针，其序列为CAC ATC TTG CAA TCT GCA GA ；用于检测单核增生李斯特氏菌的靶基因prfA的探针单核增生李斯特氏菌探针，其序列为GAT TAC TAA GCA CCATGG CT ；用于检测肉毒梭菌的靶基因16s rRNA-c的探针肉毒梭菌探针，其序列为TATACC TAGACAATC TCATT ；用于检测黄曲霉、寄生曲霉的靶基因Nor的探针黄曲霉/寄生曲霉Norl探针，其序列为ATC ATA CTG TCT GCAAGC TG,黄曲霉/寄生曲霉Nor2探针，其序列为GGT TTC TGC CCAATA CAG GA ；用于检测黄曲霉、寄生曲霉的靶基因omt的探针黄曲霉/寄生曲霉omtl探针，其序列为GAG AAC CCA TCC AAG GCA TG, 黄曲霉/寄生曲霉omt2探针，其序列为CCT TAC TTC CTC GCAAAG AA。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种检测十四种常见致病菌的方法，能检测14种常见致病菌，检测通量高、特异性强、灵敏度好、快速有效。上述技术问题通过以下技术方案解决一种检测十四种常见致病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤I)提取被检测物质的模版DNA ；2)使用生物标记素标记引物；3)使用上述被标记的引物对所述模版DNA进行聚合酶链反应扩增；4)将所得扩增产物与权利要求I所述的复合基因芯片进行杂交；5)检测复合基因芯片的杂交信号。进ー步的方案步骤2)中所述的引物为下列引物中ー种与金黄色葡萄球菌的靶基因FemA对应的引物，其序列为FemA-F aaa aaa gca cat aac aag eg, FemA-R gat aaa gaa gaa acc age ag ；与沙门氏菌的靶基因invA对应的引物，其序列为ιηνΑ-F gtg aaa tta tcg cca cgt tcg ggc aa, ιηνΑ-R tca tcg cac cgt caaagg aacc 与空肠弯曲菌的靶基因VSl对应的引物，其序列为V^l-F gat atg tat gat ttt ate ttg cgaa tga aat ttt aga atg ggg ；与小肠结肠炎耶尔森氏菌的靶基因ail对应的引物，其序列为ail-F tta atg tgtacg ctg gga gtg，ail-R gga gta ttc ata tga age gtc ；与副溶血性弧菌的靶基因tlh对应的引物，其序列为tlh-F aaa gcg gat tat gca gaa gca ctg, tlh-R gct act ttc tag cat tttctc tgc;与霍乱弧菌的靶基因ompW对应的引物，其序列为ompW-F cac caa gaa ggt gac ttt att gtg, ompW-R gaa ctt ata acc acc cgcg ;与肠出血性大肠埃希氏菌0157:H7的靶基因rfbE对应的引物，其序列为rfbE-F att gcg ctg aag cct ttg ;rfbE_R cga gta cat tgg cat cgt g ；与腊样芽孢杆菌的靶基因16s rRNA-b对应的引物，其序列为Ibs-F cgc tgg egg cag gcc taa cac atgc，16s_R :cgc ggc tgc tgg cac ggagtt age c ；与产气荚膜梭菌的靶基因CPa对应的引物，其序列为CP a -F aga tat gaa tgg caa aga gga aac，CP a-R :gct ate aac ggc agt aacatt ag ；与志贺氏菌的靶基因ipaH对应的引物，其序列为ipaH-F gtt cct tga ccg cct ttc cga tac cgt c ；ipaH-R gcc ggt cag ccaccc tct gag agt ac ；与单核增生李斯特氏菌的靶基因prfA对应的引物，其序列为prfA-F gat aca gaa aca tcg gtt ggc，prfA-R :gtg taa tct tga tgc cat cag ；与肉毒梭菌的靶基因16s rRNA-c对应的引物，其序列为Ibs-F cgc tgg egg cag gcc taa cac atg c ； Ids-R cgc ggc tgc tgg cac ggagtt age c ；与黄曲霉和寄生曲霉的革巴基因Nor对应的引物，其序列为Nor-F acc get acg ccg gca ctc tcg gca c ；Nor-R gtt ggc cgc cag ctt cgacac tcc g ；与黄曲霉和寄生曲霉的革巴基因omt对应的引物，其序列为omt-F ggc ccg gtt cct tgg ctc cta age ;omt_R cgc ccc agt gag acc cttcct Cgo进ー步的方案步骤2)中的聚合酶链反应的反应体系为
本发明涉及基因芯片及方法，本发明针对十四种常见致病菌的特异性鉴别靶基因设计相应的引物和探针，构建复合基因芯片；使用生物素标记引物，再将引物以PCR方法来扩增被检测物质的靶基因片段，扩增产物与复合基因芯片上的探针杂交，通过引物和探针双重特异性检测，复合物在复合基因表面沉积，使特定的分子杂交转变成可视信号，从而检测不同产毒微生物。本发明能检测14种常见致病菌，检测通量高、特异性强、灵敏度好、快速有效。