猪链球菌疫苗组合物及其制备方法和应用的制作方法 [0002] 猪链球菌是一种重要的猪病原体，可导致许多病理疾病诸如关节炎、心内膜炎、脑 膜炎、肺炎和败血病。其还是对于接触污染的猪或它们的副产物的人的重要的动物传染病 病原体，导致脑膜炎和心内膜炎。目前已知基于荚膜抗原的三十三种血清型（1-31型、33和 1/2型），但还不完全了解涉及猪链球菌的发病机理和致病力的机制，所以仍未有有效的疫 苗来防控猪链球菌的感染。 [0003] 现有的灭活全菌疫苗和活的无毒疫苗，因需要重复多次免疫并且不能抵御异型菌 株的攻击，其保护功效是十分有限的。由于猪链球菌荚膜在致病力中具有重要作用，因此进 行了基于荚膜物质开发疫苗的尝试，然而，这种疫苗因为荚膜多糖的免疫原性较差未取得 令人满意的效果。有人尝试使用溶血素（suilysin)，或溶菌酶释放蛋白（MRP)和细胞外蛋 白质因子（EF)开发亚单位疫苗，然而，在一些地理区域中有显著数量的致病力强的菌株并 不表达这些蛋白质，造成其免疫保护的局限性。本发明首次通过将38KDA蛋白与SaoA蛋白 组合使用，针对不同血清型猪链球菌感染有着较好的保护作用，而且只需要免疫一次，避免 多次重复免疫带来的应激反应。通过免疫效力比较试验，意外发现，两种蛋白组合使用，协 同刺激机体免疫反应，有效降低了免疫剂量，大大降低免疫成本。
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种预防和/或治疗猪链球菌感染的 疫苗组合物，包含两种猪链球菌免疫保护性抗原和佐剂。 [0005] 本发明提供的预防和/或治疗猪链球菌感染的疫苗组合物包含的两种猪链球菌 免疫抗原为38KDA蛋白和SaoA蛋白。
[0006] 优选地，本发明提供的预防和/或治疗猪链球菌感染的疫苗组合物包含的猪链球 菌免疫抗原38KDA蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0 :3所示。
[0007] 优选地，本发明提供的治疗和/或预防猪链球菌感染的疫苗组合物包含的猪链球 菌免疫抗原SaoA蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0 :4所示。
[0008] 本发明提供的预防和/或治疗猪链球菌感染的疫苗组合物包含的猪链球菌免疫 抗原38KDA蛋白、SaoA蛋白还可以是与其功能衍生物基本相同的氣基酸序列的多肤。
[0009] 本发明的另一个目的在于提供包含猪链球菌免疫抗原38KDA蛋白、SaoA蛋白或其 功能衍生物基本相同的氨基酸序列的多肽在用于预防和/或治疗动物中猪链球菌相关疾 病或感染的组合物和/或方法中的应用。
[0010] 本发明可以应用的猪链球菌相关疾病的非穷举性列表包括，如关节炎、心内膜炎、 脑膜炎、肺炎和败血症。
[0011] 术语"动物"指对链球菌菌株如猪链球菌感染敏感的任何动物。具体地，这样的动 物可以是，但不限于，小鼠、猪、山羊、马和人。更具体地，所述动物由猪组成。
[0012] 术语"预防"指通过其与链球菌菌株相关的感染或疾病的症状被阻断或延迟；术语 "治疗"指通过与链球菌菌株相关的感染或疾病的症状被缓和或完全消除的过程。
[0013] 术语"功能衍生物"指具有与完整蛋白/肽序列的生物活性基本类似的功能生物 活性的蛋白/肽序列。换言之，其优选地指当将所述功能衍生物施用于动物时，基本上保留 了激发免疫应答，如针对猪链球菌菌株攻击的保护性反应的能力的多肽或其片段。
[0014] 术语"片段"指这样的多核苷酸序列，其是人工构建（例如通过化学合成）或通过 将天然产物裂解成多个小片段（使用限制性内切酶，或机械剪切）构建的本发明核酸的分 离的部分，或通过PCR、DNA聚合酶或本领域公知的任何其他聚合技术合成的核酸的部分， 或通过本领域技术人员公知的重组核酸技术在宿主细胞中表达的核酸部分。
[0015] 术语"保护性反应"意为在动物中预防猪链球菌相关疾病或由猪链球菌导致的感 染的发作或减轻存在的这样的疾病的严重性。
[0016] 本发明涉及的猪链球菌多肽，其有利地激发动物中的保护性反应。具体地，本发明 实施方式的多肽包含与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。
[0017] 如本文一般理解和使用，"功能性片段"指编码与完整核酸序列的生物活性基本相 似的功能生物活性的核酸序列。换言之，在本发明的上下文中，其优选地指基本上保留了编 码这样的多肽/蛋白质能力的核酸或其片段，所述多肽/蛋白质当施用于动物时，激发针对 猪链球菌菌株攻击的免疫应答，和更优选地保护性反应。
[0018] 当指氨基酸序列时，"基本上相同"可以理解为本发明的多肽优选地具有这样的氨 基酸序列，其与SEQ ID NO :3-4中所示的序列的部分或全部具有至少70%同源性，或甚至 优选地80%同源性，或甚至更优选地90%同源性，或最优选地95%同源性。
[0019] 在本文中术语"同源性"还包括与参比序列相同或类似，同时提供任何氨基酸的简 单替换/修饰。可以用BLAST-P (基本局部排比检索工具），本领域技术人员公知的程序进 行该方面的同源性检索。对于相应的核酸序列，同源性涉及在本领域中已知的BLASTX和 BLASTN 程序。
[0020] 术语"佐剂"指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知 的佐剂包括，但不限于：油佐剂，水乳状液（例如：完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂），水溶 性佐剂，Quil A佐剂，氢氧化铝佐剂，葡聚糖，硫酸葡聚糖，藻酸钠。
[0021] 本发明实施例中使用了水溶性佐剂中的一种gel佐剂，本发明所用术语"水溶性 佐剂"又称"水基佐剂"或"水佐剂"，是一种聚合物水溶性分散体，用于提高水溶性疫苗的功 效和安全性，可以由高分子量聚丙烯酸类合成聚合物组成。
[0022] 优选地，所述疫苗组合物中gel佐剂含量为10%?40% (V/V)。
[0023] 在一个实施方式中，本发明提供一种治疗和/或预防猪链球菌感染的疫苗组合 物，由猪链球菌免疫抗原38KDA蛋白、SaoA蛋白和gel佐剂组成。
[0024] 本发明的另一个目的是提供一种治疗和/或预防动物中猪链球菌相关疾病或感 染的疫苗组合物的制备方法，包括：
[0025] (1)制备38KDA蛋白和SaoA蛋白抗原；
[0026] (2)按比例混合抗原，加入佐剂，乳化。
[0027] 抗原的制备可以通过本领域技术人员已知的多种方法进行，包括基因工程手段， 例如通过包含本发明多核苷酸的克隆或表达载体。术语"载体"涉及被设计用于转导/转 染一种或多种细胞类型的多核苷酸构建体。载体可以是，例如"克隆载体"，其被设计用于分 离、增殖和复制插入的核苷酸；"表达载体"，其被设计用于在宿主细胞中表达核苷酸序列； 或"病毒载体"，其被设计用于生产重组病毒或病毒样颗粒；或"穿梭载体"，其包含不只一种 类型的载体的性质。适合制备本发明猪链球菌抗原的公众可获得的载体包括质粒、腺病毒、 杆状病毒、酵母杆状病毒、植物病毒、腺伴随病毒、反转录病毒、单纯疱疹病毒、α病毒、慢病 毒等，还可以获得构建这样的载体的方法。本发明猪链球菌抗原的制备还包括通过人工合 成的方式来实现。
[0028] 本发明的另一个目的是提供一种疫苗组合物在制备治疗和/或预防动物中猪链 球菌相关疾病或感染的药物的应用。
[0029] 本发明疫苗组合物可以进一步包含猪链球菌全菌抗原。
[0030] 优选地，所述的猪链球菌全菌抗原为猪链球菌2型全菌抗原。
[0031] 更优选地，所述的猪链球菌2型全菌抗原为猪链球菌2型SC株全菌抗原。
[0032] 还可以将其他的试剂加入到本发明的组合物。例如，本发明的组合物还可以包含 试剂，如：药物，免疫刺激剂（如：α -干扰素 、β -干扰素 、Υ -干扰素、粒细胞巨噬细胞集落 刺激因子（GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF)和白介素2(IL2))，抗氧化剂，表面活 性剂，着色剂，挥发性油，缓冲剂，分散剂，推进剂和防腐剂。为了制备这样的组合物，可以使 用本领域公知的方法。
[0033] 本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在 组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分 和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年 龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
[0034] 优选地，对于动物猪而言，本发明疫苗组合物38KDA蛋白抗原含量为10-100 μ g/ ml ;SaoA蛋白抗原有效量为50-300μ g/ml。
[0035] 更优选地，所述疫苗组合物38KDA蛋白抗原含量为50 μ g/ml ;SaoA蛋白抗原有效 量为 150 μ g/ml。
[0036] 本发明具有以下突出的优点：
[0037] (1)本发明疫苗组合物可通过基因工程手段或人工合成手段对疫苗组合物的组分 进行大量合成表达，不仅耗时短，还可便于大规模生产；
[0038] (2)本发明猪链球菌疫苗组合物中多免疫原性抗原的组合可诱导产生协同的免疫 效果；
[0039] (3)本发明疫苗组合物可有效保护猪只抵抗不同血清型猪链球菌的感染，提供了 一种完善预防和/或治疗猪链球菌感染的途径，对于净化猪链球菌有着积极的现实意义。




[0040] 图1 :本发明疫苗组合物免疫小鼠后的抗体水平。
[0041] 图2 :本发明疫苗组合物同单一组分抗原免疫仔猪后抗体水平比较。


[0042] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0043] 本发明实施例中所用PBS缓冲液如无特别说明，均采用pH7. 4的PBS，配制方法： NaC18. 0g，KC10. 2g，ΚΗ2Ρ040· 24g，Na2HP04 · 12Η203· 628g，溶于 800ml 蒸馏水中，用盐酸调 pH 值为7. 4,蒸馏水定容至1000ml，121°C高压灭菌20min，室温保存。
[0044] 实施例1
[0045] 猪链球菌免疫原性抗原的制备
[0046] 猪链球菌免疫原性抗原可以通过本领域技术人员已知的多种方法进行制备，例如 通过包含本发明多核苷酸的克隆或表达载体。。适合制备本发明猪链球菌多肽抗原的公众 可获得的载体包括质粒、腺病毒、杆状病毒、酵母杆状病毒、植物病毒、腺伴随病毒、反转录 病毒、单纯疱疹病毒、α病毒、慢病毒等，还可以获得构建这样的载体的方法。本发明猪链 球菌多肽抗原的制备还包括人工合成的多肽抗原。本发明实施例采用大肠杆菌表达系统来 制备38KDA蛋白和SaoA蛋白。
[0047] 1.材料
[0048] 本发明采用的pMDlS-Τ载体（购自宝生物工程（大连）有限公司），大肠杆菌 DH5a感受态购自宝生物工程（大连）有限公司。
[0049] 本发明所用菌株为猪链球菌2型CVCC606菌株购自中国北京中国兽医药品监察 所，属于一个商业菌株。
[0050] 大肠杆菌培养基：LB液体培养液及固体培养基（每升含酵母提取物5g，胰蛋白胨 10g，NaC110g，用 10mol/LNa0H 调 pH 至 7. 5，121°C 高压灭菌 20min，4°C保存备用。在每 100 毫升LB液体培养基中加入1. 5g琼脂即为固体LB培养基，121°C高压灭菌20min，4°C保存备 用）。
[0051] 引物设计与合成：
[0052] 根据SEQ ID NO. 1所示的38KDA基因序列，设计上游引引物 CGGGATCCCGATGGATATTAGACAGGTTAGA 与下游引物 GCTGCAGCTTAGTTCTTAAAGCTATGA 扩增 38KDA基因。引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0053] 根据SEQ ID N0. 2所示的SaoA基因序列，设计上游引物 AAAGGATCCGCAACCTGATGGGGGAC 与下游引物 GGGCTGCAGTCATTACATTGCTTCCTTA 扩增 SaoA 基 因。引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0054] 2.抗原蛋白制备
[0055] 将猪链球菌2型菌种CVCC606株（购自中国北京，中国兽医药品监察所）接种于 含有10%灭活新生牛血清的TSA固体培养基（购自Sigma公司）上，挑取单个菌落接种于 TSB液体培养基（购自Sigma公司）中，置于摇床中（150r/min)，37°C震荡培养过夜。
[0056] 遵照TIANGEN细菌基因组提取试剂盒（购自武汉大风生物技术有限公司）说明书 提供的操作方法提取基因组DNA。
[0057] PCR反应体系见表1。
[0058] 表1PCR反应体系
[0059]