专利名称：一种用于牙垢标本的牙龈卟啉菌培养基的制作方法牙周炎是口腔中的常见病和多发病，属于细菌感染性疾病。流行病学研究表明，牙銀口卜啉菌(Porphyromonas gingivalis, P. gingivalis)与牙周炎的发生、发展显著相关,是牙周炎的优势致病菌。牙周炎发病后期引起的牙龈萎缩、牙槽骨丧失一般难以再生，因此，牙周炎的早期诊断、P. gingivalis的早期检出至关重要。目前的P. gingivalis检验手段主要是銀下菌斑采样进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR),该种方法需要对样本进行DNA提取和PCR引物设计，且需要配备PCR相关仪器设备，成本昂贵，操作 复杂。微生物培养是一种用人工方法使微生物生长繁殖的技术，而选择性培养基是用来促进或抑制一定类型的生物体(如细胞或细菌等)而设计的培养基，利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。人类口腔中寄居着500多种细菌，其中定植在龈下的就有300多种，正是由于这种复杂的样本环境，使得牙垢标本P. gingivalis的培养分离率低，口腔主流菌群中的链球菌、表皮葡萄球菌、奈瑟氏菌、乳杆菌、螺旋体、假丝酵母在目前的培养基中比牙龈卟啉菌生长更快，很快覆盖了培养基，牙龈卟啉菌无法生长
本发明的技术任务是针对以上现有技术的不足，提供一种能够用于牙垢标本的，对牙龈卟啉菌分离率高的培养基。本发明解决其技术问题的技术方案是一种用于牙垢标本的牙龈卟啉菌培养基，其特征在，配制IOOOml培养基的配方中含有麦芽浸粉15 30g ;鸡蛋蛋白液15(T200ml ;浓度为5 mg/ml的氯化血红素溶液2. 5 ml ;浓度为10mg/ml的维生素Kl乙醇溶液O. 5ml ;枸橼酸镁O. I O. 4g ;琼脂15 20g ;共杀素15 20mg ;泰利霉素8 12mg ;利奈唑胺5 IOmg ;天门冬素3. 6 g ;四水柠檬酸钙O. 0Γ0. 2g ;蒸馏水加至1000ml。优化方案中，每1000ml培养基还含有大蒜榨出汁0. 05、· 5g。优化方案中，每1000ml培养基还含有L-半胱氨酸0. θΓθ. lg。优化方案中，每1000ml培养基还含有浓度200g/L的黄精水煮液20(T300ml。最优化方案中，每1000ml培养基还含有大蒜榨出汁0. 05、. 5g ;L_半胱氨酸0.θΓθ. Ig ;浓度 200g/L 的黄精水煮液 20(T300ml。一种用于牙垢标本的牙龈卟啉菌培养基的制备方法，其特征在于包括以下步骤 (1)取黄精加水煮沸I小时，过滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得黄精水煮液； (2)取去皮新鲜大蒜洗净后，粉碎机榨汁并过滤，得大蒜榨出汁；(3)取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化血红素溶液；维生素Kl乙醇溶液；枸橼酸镁；琼脂；共杀素；泰利霉素；利奈唑胺；天门冬素；四水柠檬酸钙；L_半胱氨酸及大蒜榨出汁溶于步骤I所得黄精水煮液中，混匀过滤后，蒸馏水定容，850C间歇灭菌2次，每次45 min,灭菌后分装。其中所述的麦芽浸粉提供碳氮源和能量；枸橼酸镁和四水柠檬酸钙为缓冲剂，并可以抑制杂菌生长；氯化血红素和维生素Kl为营养剂；琼脂是培养基的凝固剂；共杀素可以抑制革兰氏阳性菌蛋白质的合成，对于广泛耐药的革兰氏阳性菌也有效；泰利霉素对于奈瑟氏菌、乳杆菌、假丝酵母具有一定的抑菌作用；利奈唑胺对耐药性金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、酿脓链球菌、溶血性链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌和肠球菌属等均具有良好活性；天门冬素、L-半胱氨酸属氨基酸类，为营养剂；鸡蛋蛋白液含有各种多肽、脂肪、生长因子、激素等，这些物质对促进牙龈卟啉菌的繁殖和生长都是很重要的因素，此外鸡蛋蛋白液还具有维持培养基PH值恒定的作用。大蒜榨出汁所含的蒜酶、过氧化酶、磷酸酯酶及水解酶等，有氧化和水解作用，可以致使牙垢标本中的核梭杆菌、脆弱类杆菌胞壁消失或变薄，核糖体聚集成团块，最终导致细菌变形及破裂，达到抑制核梭杆菌、脆弱类杆菌的作用。黄精为百合科植物黄精、多花黄精和滇黄精的根茎，含有蔗糖、葡萄糖、叶酸、多种氨基酸等成分，可以提供能量代谢、细胞发育、新陈代谢因子，且水煮液对堇色毛癣菌、红色表皮 癣菌、石膏样毛癣菌、考夫曼-沃尔夫氏表皮癣菌、螺旋体、疱疹病毒均有抑制作用。本发明与现有技术相比较，具有检出可靠、牙龈卟啉菌分离率高的特点。作详细说明。实施例1，配制IOOOml培养基的配方中含有麦芽浸粉15g ;鸡蛋蛋白液150ml ;浓度为5 mg/ml的氯化血红素溶液2. 5ml ;浓度为10mg/ml的维生素Kl乙醇溶液O. 5ml ;枸橼酸镁O. Ig ;琼脂15g ;共杀素15mg ;泰利霉素8mg ;利奈唑胺IOmg ;天门冬素3. 6 g ;四水朽1fefef丐O. 2g ;蒸懼水加至1000ml。制备方法取麦牙浸粉；鸡蛋蛋白液；氣化血红素溶液；维生素Kl乙醇溶液；枸橼酸镁；琼脂；共杀素；泰利霉素；利奈唑胺；天门冬素；四水柠檬酸钙溶于蒸馏水中，混匀，蒸馏水定容至1000ml，85°C间歇灭菌2次，每次45 min，灭菌后分装。实施例2，配制IOOOml培养基的配方中含有麦芽浸粉30g ;鸡蛋蛋白液200ml ;浓度为5 mg/ml的氯化血红素溶液2. 5ml ;浓度为10mg/ml的维生素Kl乙醇溶液O. 5ml ;枸橼酸镁O. 4g ;琼脂20g ;共杀素20mg ;泰利霉素12mg ;利奈唑胺5mg ;天门冬素3. 6 g ;四水柠檬酸钙O. Olg ;蒸馏水加至1000ml。制备方法取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化血红素溶液；维生素Kl乙醇溶液；枸橼酸镁；琼脂；共杀素；泰利霉素；利奈唑胺；天门冬素；四水柠檬酸钙溶于蒸馏水中，混匀，蒸馏水定容至1000ml，85°C间歇灭菌2次，每次45 min，灭菌后分装。实施例3，配制IOOOml培养基的配方中含有麦芽浸粉15g ;鸡蛋蛋白液150ml ;浓度为5 mg/ml的氯化血红素溶液2. 5ml ;浓度为10mg/ml的维生素Kl乙醇溶液O. 5ml ;枸橼酸镁O. Ig ;琼脂15g ;共杀素15mg ;泰利霉素8mg ;利奈唑胺IOmg ;天门冬素3. 6 g ;四水朽1檬酸钙O. 2g ;大蒜榨出汁O. 05g, L-半胱氨酸O. Ig ;蒸馏水加至IOOOml。制备方法取去皮新鲜大蒜洗净后，粉碎机榨汁并过滤，得大蒜榨出汁；取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化血红素溶液；维生素Kl乙醇溶液；枸橼酸镁；琼脂；共杀素；泰利霉素；利奈唑胺；天门冬素；四水柠檬酸钙；L-半胱氨酸；大蒜榨出汁溶于蒸馏水中，混匀，蒸馏水定容至1000ml，85°C间歇灭菌2次，每次45 min,灭菌后分装。实施例4，配制IOOOml培养基的配方中含有麦芽浸粉30g ;鸡蛋蛋白液200ml ;浓度为5 mg/ml的氯化血红素溶液2. 5ml ;浓度为10mg/ml的维生素Kl乙醇溶液O. 5ml ;枸橼酸镁O. 4g ;琼脂20g ;共杀素20mg ;泰利霉素12mg ;利奈唑胺5mg ;天门冬素3. 6 g ;四水朽1檬酸I丐O. Olg,大蒜榨出汁O. 5g, L-半胱氨酸O. Olg ;蒸懼水加至1000ml。制备方法取去皮新鲜大蒜洗净后，粉碎机榨汁并过滤，得大蒜榨出汁；取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化血红素溶液；维生素Kl乙醇溶液；枸橼酸镁；琼脂；共杀素；泰利霉素；利奈唑胺；天门冬素；四水柠檬酸钙；L-半胱氨酸；大蒜榨出汁溶于蒸馏水中，混匀，蒸馏水定容至1000ml，85°C间歇灭菌2次，每次45 min，灭菌后分装。实施例5，配制IOOOml培养基的配方中含有麦芽浸粉25g ;鸡蛋蛋白液170ml ;浓度为5 mg/ml的氯化血红素溶液2. 5 ml ;浓度为10mg/ml的维生素Kl乙醇溶液O. 5ml ;枸橼酸镁O. 3g ;琼脂18g ;共杀素18mg ;泰利霉素IOmg ;利奈唑胺8mg ;天门冬素3. 6 g ;四水柠檬酸钙O. Ig,大蒜榨出汁O. 3g，L-半胱氨酸O. 05g ;蒸馏水加至IOOOml。制备方法取去皮新鲜大蒜洗净后，粉碎机榨汁并过滤，得大蒜榨出汁；取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化血红素溶液；维生素Kl乙醇溶液；枸橼酸镁；琼脂；共杀素；泰利霉素；利奈唑胺；天门冬素；四水柠檬酸钙；L-半胱氨酸；大蒜榨出汁溶于蒸馏水中，混匀，蒸馏水定容至1000ml，85°C间歇灭菌2次，每次45 min，灭菌后分装。实施例6，配制IOOOml培养基的配方中含有麦芽浸粉15g ;鸡蛋蛋白液150ml ;浓度为5 mg/ml的氯化血红素溶液2. 5 ml ;浓度为10mg/ml的维生素Kl乙醇溶液O. 5ml ;枸橼酸镁O. Ig ;琼脂15g ;共杀素15mg ;泰利霉素8mg ;利奈唑胺IOmg ;天门冬素3. 6 g ;四水柠檬酸钙O. 2g，大蒜榨出汁O. 05g，L-半胱氨酸O. lg，浓度200g/L的黄精水煮液200ml ;蒸馏水加至1000ml。制备方法
(1)取黄精加水煮沸I小时，过滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得黄精水煮液；
(2)取去皮新鲜大蒜洗净后，粉碎机榨汁并过滤，得大蒜榨出汁；
(3)取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化血红素溶液；维生素Kl乙醇溶液；枸橼酸镁；琼脂；共杀素；泰利霉素；利奈唑胺；天门冬素；四水柠檬酸钙；L-半胱氨酸及大蒜榨出汁溶于步骤I所得黄精水煮液中，混匀过滤后，蒸馏水定容，850C间歇灭菌2次，每次45 min,灭菌后分装。实施例7，配制IOOOml培养基的配方中含有麦芽浸粉30g ;鸡蛋蛋白液200ml ;浓度为5 mg/ml的氯化血红素溶液2. 5 ml ;浓度为10mg/ml的维生素Kl乙醇溶液O. 5ml ;枸橼酸镁O. 4g ;琼脂20g ;共杀素20mg ;泰利霉素12mg ;利奈唑胺5mg ;天门冬素3. 6 g ;四水柠檬酸钙O. Olg，大蒜榨出汁O. 5g，L-半胱氨酸O. Olg，浓度200g/L的黄精水煮液300ml ；蒸懼水加至1000ml。制备方法
(1)取黄精加水煮沸I小时，过滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得黄精水煮液；
(2)取去皮新鲜大蒜洗净后，粉碎机榨汁并过滤，得大蒜榨出汁；
(3)取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化血红素溶液；维生素Kl乙醇溶液；枸橼酸镁；琼脂； 共杀素；泰利霉素；利奈唑胺；天门冬素；四水柠檬酸钙；L_半胱氨酸及大蒜榨出汁溶于步骤I所得黄精水煮液中，混匀过滤后，蒸馏水定容，850C间歇灭菌2次，每次45 min,灭菌后分装。实施例8，配制IOOOml培养基的配方中含有麦芽浸粉25g ;鸡蛋蛋白液170ml ;浓度为5 mg/ml的氯化血红素溶液2. 5 ml ;浓度为10mg/ml的维生素Kl乙醇溶液O. 5ml ;枸橼酸镁O. 3g ;琼脂18g ;共杀素18mg ;泰利霉素IOmg ;利奈唑胺8mg ;天门冬素3. 6 g ;四水柠檬酸钙O. lg，大蒜榨出汁O. 3g，L-半胱氨酸O. 05g，浓度200g/L的黄精水煮液250ml ;蒸馏水加至1000ml。制备方法
(1)取黄精加水煮沸I小时，过滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得黄精水煮液；
(2)取去皮新鲜大蒜洗净后，粉碎机榨汁并过滤，得大蒜榨出汁；
(3)取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化血红素溶液；维生素Kl乙醇溶液；枸橼酸镁；琼脂；共杀素；泰利霉素；利奈唑胺；天门冬素；四水柠檬酸钙；L-半胱氨酸及大蒜榨出汁溶于步 骤I所得黄精水煮液中，混匀过滤后，蒸馏水定容，85°C间歇灭菌2次，每次45 min，灭菌后分装。所述的黄精水煮液浓度为200g/L，指的是每升黄精水煮液中含有生药200g。本发明所得牙龈卟啉菌培养基用于牙垢标本具有检出可靠、牙龈卟啉菌分离率高的特点，为临床资料充分证明，有关资料如下。I对象与方法
I. I培养基制备共设4组，分别为实施例8方案组、实施例5方案组、实施例2方案组和对照组，对照组为巧克力琼脂培养基。I. 2龈下菌斑采集培养方法隔湿唾液，龈上刮治器去除龈上牙石，碘酊消毒后，用无菌Gracey刮治器采集2颗下颌中切牙唇侧近中至远中的龈下菌斑。将采集的菌斑悬浮于Iml生理盐水，用接种环分区划线接种，厌氧环境下37°C培养24h，挑取细小菌落进行菌属鉴定。I. 3统计学分析用SPSS 13. O进行统计分析，P〈 O. 05表示有显著性意义。2结果在84份经由PCR确定牙龈卟啉菌阳性的牙垢标本，细菌培养分离并鉴定为牙龈卟啉菌的，实施例8方案组为79例，实施例5方案组为78例，实施例2方案组为74例，对照组巧克力琼脂培养基为24例，经统计学处理，本发明各实施例组与对照组比较具有明显差异(P〈0. 001)。结果表明，本发明实施例牙龈卟啉菌分离率明显高现有的培养基。


本发明公开了一种用于牙垢标本的牙龈卟啉菌培养基及其制备方法。其特征在于，配制1000ml培养基的配方中含有麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化血红素溶液；维生素K1乙醇溶液；枸橼酸镁；琼脂；共杀素；泰利霉素；利奈唑胺；天门冬素；蒸馏水加至1000ml。最佳优化配方制备方法为取麦芽浸粉、鸡蛋蛋白液、氯化血红素、琼脂、枸橼酸镁、四水柠檬酸钙、共杀素、大蒜榨出汁、L-半胱氨酸溶于黄精水煮液中，混匀，定容，灭菌后分装。本发明与现有技术相比较，具有检出可靠、牙龈卟啉菌分离率高的特点。