共价寡聚的膜破裂性肽制作方法_罗斯·欧文·菲利普斯专利（寡聚,性肽,共价）-早鸽网

共价寡聚的膜破裂性肽制作方法

专利名称

共价寡聚的膜破裂性肽制作方法
发明者

罗斯·欧文·菲利普斯, 约翰·汉密尔顿·韦尔什, 朗达·达尔菲·侯塞因
公开日

2002年5月15日
申请日期

2000年4月25日
优先权日

1999年4月26日
申请人

科布尔药物有限公司
文档编号

A61K47/48GK1349543SQ0080681
关键字

寡聚性肽共价破裂
权利要求

1.一种经修饰的膜破裂性肽，其中所述膜破裂性肽被修饰成共价连接的多聚体2.权利要求1的经修饰的膜破裂性肽，其进一步被修饰成基本上连续的α螺旋3.权利要求1或2的经修饰的膜破裂性肽，其中所述膜破裂性肽为α螺旋状膜破裂性肽并且对细胞具有毒性4.上述权利要求中任一项的经修饰的膜破裂性肽，其中所述膜破裂性肽是蜂毒肽5.权利要求2-4中任一项的经修饰的膜破裂性肽，其中通过用不破坏α螺旋形成的氨基酸替换破坏α螺旋形成的氨基酸，所述膜破裂性肽被修饰成基本上连续的α螺旋6.权利要求5的经修饰的膜破裂性肽，其中蜂毒肽的14位的脯氨酸被丙氨酸或色氨酸替换7.权利要求2-4中任一项的经修饰的膜破裂性肽，其中通过除去中止α螺旋形成的氨基酸，所述膜破裂性肽被修饰成基本上连续的α螺旋8.上述权利要求中任一项的经修饰的膜破裂性肽，其被修饰成二聚体9.权利要求8的经修饰的膜破裂性肽，其中通过用经二硫键或经连接基团与另一经修饰的膜破裂性肽的氨基酸直接形成共价键的氨基酸替换膜破裂性肽的氨基酸，对所述膜破裂性肽进行了修饰10.权利要求8的经修饰的膜破裂性肽，其中通过增加能够经二硫键或经连接基团与另一经修饰的膜破裂性肽的氨基酸直接形成共价键的氨基酸，对所述膜破裂性肽进行了修饰11.权利要求1-7中任一项的经修饰的膜破裂性肽，其被修饰成三聚体12.权利要求1-7中任一项的经修饰的膜破裂性肽，其被修饰成四聚体13.权利要求11或12的经修饰的膜破裂性肽，其中通过用两个或多个直接或经连接基团与其他经修饰的膜破裂性肽的氨基酸形成二硫键的氨基酸替换两个或多个氨基酸，所述膜破裂性肽被修饰成三聚体或四聚体14.权利要求11或12的经修饰的膜破裂性肽，其中通过增加两个或多个经二硫键或经连接基团与其他膜破裂性肽的氨基酸直接形成共价键的氨基酸，所述膜破裂性肽被修饰成三聚体或四聚体15.经修饰的膜破裂性肽，其具有氨基酸序列CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ16.上述权利要求中任一项的经修饰的膜破裂性肽，其中含有脂质17.上述权利要求中任一项的经修饰的膜破裂性肽，其具有延伸的α螺旋18.上述权利要求中任一项的经修饰的膜破裂性肽，其具有增加到膜破裂性肽的C末端上的碱性氨基酸残基19.上述权利要求中任一项的经修饰的膜破裂性肽的功能同系物20.上述权利要求中任一项的经修饰的膜破裂性肽的应用，用于向细胞传递带负电荷的聚合物的传递复合物中21.权利要求20的应用，其中带负电荷的聚合物为核酸22.用于向细胞传递核酸的传递复合物，其含有带负电荷的聚合物和权利要求1-19中任一项的经修饰的膜破裂性肽23.权利要求22的传递复合物，其中带负电荷的聚合物为核酸24.一种传递复合物，含有核酸、核酸缩合肽和权利要求1-19中任一项经修饰的膜破裂性肽25.制备权利要求24的传递复合物的方法，包括1.核酸与核酸缩合肽缩合形成缩合的核酸复合物；和2.用权利要求1-19中任一项的经修饰的膜破裂性肽包被缩合的核酸复合物26.权利要求1-19中任一项的经修饰的膜破裂性肽，其用于治疗27.权利要求1-19中任一项的经修饰的膜破裂性肽的应用，用于制备治疗遗传疾病的组合物28.一种治疗遗传疾病的方法，该方法包括给需要此类治疗的患者施用有效量的传递复合物，该传递复合物含有治疗性核酸和权利要求1-19中任一项的经修饰的膜破裂性肽
技术领域

本发明涉及经修饰的膜破裂性肽本发明还涉及含有所述经修饰的膜破裂性肽的传递复合物和该传递复合物的应用在基因治疗的领域中需要可以用来有效转染细胞的简单非病毒基因传递剂阳离子型肽通过静电作用与DNA缩合并且已被用于制备简单和可复制的肽DNA制剂其制备和提纯方法业已被广泛报导阳离子型肽还被作为化学锚用于其他肽类或非肽类实体的引入，以协助经包装的基因从细胞外位置向预期靶细胞核的通过数组科研人员证实，当采用阳离子型肽作为体外传递剂时，只有在被认为通过提高基因进行转运从而脱离胞内囊泡的能力而起作用的外源性试剂的存在下转染才是最理想的，所述囊泡在细胞摄取过程中或摄取后包封基因外源性试剂的实例是氯喹或膜破裂性肽可以确信生物膜的去稳定化是这些试剂作用的核心任何对于传递复合物的通过来说成为屏障的膜的结构的破裂将增强其到达核的能力然而，有理由假设对于许多体内应用而言，除使制剂复杂化之外，外源性试剂如小有机分子氯喹的使用将受到小分子和大分子之间建立的不同的体内清除机制以及扩散速率的阻碍融合或膜破裂性肽如Wagner(Wagner等，PNAS，89，7934-8，1992)或Smith(国际专利申请WO97/35070)所述的那些可以锚合复合物形成之前的缩合结构，或锚合预形成的肽DNA复合物，但这也是复杂的制剂制备过程此外，此类肽在促进基因转移方面显示出比腺病毒低下的有效性(Gottschalk等，Gene Therapy，3,448-457，1996；Wagner等，PNAS，89，7934-8，1992)，因此研究工作仍在继续寻找更加有效的肽能够缩合DNA并破裂生物膜的肽将简化制剂，并且可以产生更有效的转染蜂毒肽是一种公认的膜破裂性肽；但是，虽然其成为一种研究最广泛的肽序列，但只有两个实例描述了其在基因传递中的应用首先，是以与蜂毒肽连接的二油酰基磷脂酰乙醇胺-N-[3-(2-吡啶基二硫基)丙酸盐](一种DOPE衍生物)的形式(Legendre等，Bioconjugate Chem.，8,57-63，1997)，其次公开在美国专利US-A-5,547,932中在Legendre等的描述中，脂质的偶联是一个昂贵和复杂的步骤，而且报导了DOPE体内应用所存在的问题在美国专利US-A-5,547,932中公开了与核酸结合剂连接的内体分解(endosomolytic)试剂的制剂所述制剂形成相对无效的转染制剂，其也可能对被转染细胞产生毒性事实上，蜂毒肽的毒性可以用来解释为什么它至今无法作为单独的肽成功地应用于非病毒制剂中本发明提供一种经修饰的膜破裂性肽，其中膜破裂性肽被修饰成共价连接的多聚体优选经修饰的膜破裂性肽进一步修饰成基本上连续的α螺旋现在发现，通过经修饰的膜破裂性肽使其形成多聚体并优选使其形成基本上连续的α螺旋，肽的毒性可以被降低，而且当用于向细胞传递核酸时，该肽产生增高了的转染水平不受任何理论的约束，建议膜破裂性肽必须采取单体的形式以便能够插入膜中，在其中聚集形成管孔管孔的形成肯定对细胞具有毒性，因为它增强了被动的离子通透性肽的多聚化阻止了单体的形成，由此防止管孔形成且降低细胞毒性多聚体由于非极性两亲性α螺旋占优势而仍然保留了一些膜破裂特性肽通过修饰可以获得基本上连续的α螺旋；由于基本上连续的α螺旋可以实现与细胞膜的相互作用，因此提高了肽的膜破裂特性肽的多聚化也具有优越性，使肽无法从任何结合的核酸上解离下来术语“膜破裂性肽”是指能够促进膜破裂并降低分子横贯膜所需要的能量的肽利用试验如红细胞溶解试验可以测定出一种肽是否是膜破裂性肽；然而，不同的膜破裂性肽具有不同的细胞特异性，其可以溶解不同于红细胞的细胞因此，在溶胞试验中应采用其他细胞种类来测定一种肽是否是膜破裂性肽膜破裂性肽优选是一种毒性膜破裂性肽进一步优选膜破裂性肽是通过将其自身以单体的形式向膜内插入来产生毒性更加优选膜破裂性肽是毒性α螺旋膜破裂性肽，例如蜂毒肽、杀菌肽A、杀菌肽P1、杀菌肽D、爪蟾抗菌肽2、铃蟾抗菌肽(bombolittin)类或pardaxin(Saberwal等，Biochimica et Biophysica Acta，1197，109-131，1994)优选膜破裂性肽构成一种两亲性α螺旋，该螺旋具有一个富集阳离子残基且能够缩合DNA的面，和一个能够与膜脂质相互作用的疏水面另外，优选膜破裂性肽含有α螺旋区域和位于肽的C末端的碱性区域，该碱性区域可以与核酸缩合优选膜破裂性肽不是人体杀菌/渗透性增强蛋白(BPI)(Gray等，J.Biol.Chem.，264，9505，1989和美国专利US-A-5,856,302)优选膜破裂性肽是蜂毒肽在此所用的术语“肽”是指具有10至150个氨基酸链长的氨基酸的聚合物该术语不是指或不包括肽的修饰，例如糖基化、乙酰化和磷酸化该定义包括含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸)的肽，具有取代键以及其他所属领域已知的修饰的肽，包括天然或合成的术语“修饰成多聚体”是指修饰膜破裂性肽使其共价连接一种或多种其他膜破裂性肽优选该多聚体是二聚体、三聚体或四聚体，更优选是二聚体和四聚体，首选二聚体形成多聚体的膜破裂性肽可以相同或不同膜破裂性肽可以沿肽的长度在任何位点连接在一起；然而，优选肽在各个肽的N末端和/或C末端连接在一起，最优选肽在各个肽的N末端连接在一起优选地，通过用能够经二硫键或连接基团与另一种经修饰的膜破裂性肽的氨基酸直接形成共价键的氨基酸替换膜破裂性肽的氨基酸，可以使膜破裂性肽修饰成二聚体另外，经二硫键或经连接基团直接形成共价键的氨基酸可以增加于膜破裂性肽中优选增加的或替换肽氨基酸的氨基酸为半胱氨酸，其可以与另一种肽的半胱氨酸残基形成二硫键形成二聚体的膜破裂性肽不一定相同；然而，优选形成二聚体的肽相同优选地，通过用两个或多个能够经二硫键或经连接基团与其他经修饰的膜破裂性肽的氨基酸直接形成共价键的氨基酸替换两个或多个氨基酸，可以使膜破裂性肽修饰成三聚体或四聚体另外，可以将两个或多个能够直接或经连接基团形成二硫键的氨基酸增加在膜破裂性肽中形成三聚体或四聚体的膜破裂性肽不一定相同；然而，优选形成三聚体或四聚体的肽相同膜破裂性肽可以经连接体如市售连接体相连在一起，所述连接体包括双马来酰亚胺或双乙烯基砜连接体术语“基本上连续的α螺旋”是指形成α螺旋并且不含有一个或多个破坏该α螺旋形成的氨基酸的膜破裂性肽的区域优选该基本上连续的α螺旋在长度上至少为10个氨基酸优选所述的基本上连续的α螺旋占该经修饰的膜破裂性肽长度的至少5％，更优选占该经修饰的膜破裂性肽长度的40％-90％，最优选占该经修饰的膜破裂性肽长度的约80％利用标准圆二色分析法可以很容易地测定出肽中α螺旋的存在可以破坏α螺旋形成的氨基酸包括脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸、苏氨酸和丝氨酸然而，所属领域技术人员理解，氨基酸破坏α螺旋的能力依赖于肽的整体序列和其他因素，例如肽折叠的溶液的pH优选的可以破坏α螺旋形成的氨基酸是脯氨酸优选膜破裂性肽通过用不破坏α螺旋形成的氨基酸来替换破坏α螺旋形成的氨基酸而修饰成基本上连续的α螺旋在一个优选实施方式中，本发明的经修饰的膜破裂性肽具有氨基酸序列CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ进一步优选经修饰的膜破裂性肽经在N末端半胱氨酸氨基酸之间的二硫键直接形成二聚体通过加入其他官能团，例如脂质、靶向基团(如使肽以特定细胞种类为靶向的抗体或抗体片段)、抗原肽、糖和中性亲水性聚合物(如PEG和PVP)，可以进一步修饰本发明的经修饰的膜破裂性肽适合增加在本发明的经修饰的膜破裂性肽中的官能团公开在国际专利申请WO 96/41606中，并且也公开了使此类基团连接在肽上的方法优选地，通过将氨基酸添加在肽的基本上连续的α螺旋区域，可以进一步修饰本发明的经修饰的膜破裂性肽，其中附加氨基酸延伸了基本上连续的α螺旋区域的长度优选该基本上连续的α螺旋区域延伸至该α螺旋区域在长度上至少为10个氨基酸，更优选至少20个氨基酸优选通过将碱性氨基酸增加在肽的C末端区域使本发明的经修饰的膜破裂性肽得到进一步修饰本发明的经修饰的膜破裂性肽的C末端区域是指从C末端氨基醮延伸至形成基本上连续的α螺旋区的区域碱性氨基酸为所属领域技术人员熟知，其中包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸优选通过增加1-50个碱性氨基酸、更优选5-15个碱性氨基酸来修饰C末端区域本发明还提供了本发明的经修饰的膜破裂性肽的功能同系物优选的本发明经修饰的膜破裂性肽的功能同系物是那些仍然保留其活性并对本发明的肽来说具有优选至少80％、更优选90％和首选95％的同源性的同系物这些优选的含有本发明肽的片段的功能同系物只在1-10个氨基酸上不同进一步优选这种氨基酸变化是保守性的保守性变化是指那些用侧链相关的氨基酸种类中的一个替换另一个氨基酸的变化譬如，有理由认为，亮氨酸用异亮氨酸或缬氨酸、天门冬氨酸用谷氨酸、苏氨酸用丝氨酸孤立替换，或用结构上相关的氨基酸进行氨基酸的相似保守性替换，将对肽的生物活性没有严重影响然而，有时希望通过改变氨基酸来改变肽的生物活性譬如，消除或提高肽的一种或多种功能的突变特别有用这种突变一般可以通过改变肽的任何保守序列来实现优选此类同系物具有与本发明的蛋白质或其片段至少80％、更优选90％和最优选95％的同源性此类改变了的蛋白质或其片段适宜在1-10个氨基酸上不同本发明还提供本发明的经修饰的膜破裂性肽在将核酸传递至细胞的传递复合物中的应用本发明的经修饰的膜破裂性肽可以用于将带负电荷的聚合物，优选核酸，传递至任何细胞种类优选的细胞种类包括原核细胞如大肠杆菌(E.coli)；和真核细胞，例如哺乳动物细胞，包括离体初级细胞，如HUVEC和DC细胞；哺乳动物细胞系，包括HeLa、HepG2、CHO和骨髓瘤细胞系；和低等真核细胞，如酵母优选利用本发明的经修饰的膜破裂性肽将核酸传递至哺乳动物细胞本发明还提供含有本发明的膜破裂性肽和核酸的传递复合物优选所述传递复合物由被传递核酸和本发明的经修饰的膜破裂性肽组成本发明的传递复合物可以是含有被传递核酸和本发明的经修饰的膜破裂性肽的任何传递复合物所属领域技术人员熟知多种向细胞传递核酸的传递复合物由病毒包膜蛋白质的氨基酸序列衍生的肽业已在与聚赖氨酸DNA复合物联合给药时用于基因转移(Plant等，1994，J.Biol.Chem.26912918-24)；Trubetskoy等，1992，Bioconiugate Chem.，3323-327；Mack等，1994，Am.J.Med.Sci.307138-143)提出，聚赖氨酸偶联物与阳离子型脂质的共缩合可以改进基因转移的效率WO 95/02698公开了病毒成分在尝试提高阳离子型脂质基因转移的效率中的应用在一个优选实施方式中，本发明的传递复合物含有经修饰的膜破裂性肽和包封在毫微-或微-颗粒如聚交酯乙交酯和脂质体等中的核酸在另一优选实施方式中，本发明的传递复合物含有核酸、核酸缩合肽和本发明的经修饰的膜破裂性肽核酸缩合肽可以是任何能够缩合核酸的肽，包括聚赖氨酸和组蛋白衍生的肽优选的核酸缩合肽公开在国际专利申请WO 96/41606和WO 98/35984中优选通过核酸缩合肽缩合核酸生成缩合的核酸复合物得到所述的传递复合物随后，该缩合的核酸复合物用本发明的经修饰的膜破裂性肽包被本发明提供一种本发明传递复合物的方法，包括1.使核酸与核酸缩合肽缩合形成缩合的核酸复合物；和2.该缩合的核酸复合物用本发明的经修饰的膜破裂性肽包被现在发现，转染过程中血清的存在可以提高转染的水平优选的血清是胎牛血清所属领域熟知其他可使用的适宜血清，其中包括正常人血清和正常小鼠血清本发明的经修饰的膜破裂性肽可以在体内、体外和离体处理中用于向细胞传递治疗性核酸核酸在不同疾病中的治疗用途为该领域技术人员所熟知传递给细胞的治疗性核酸可以是任何形式的DNA或RNA载体，包括质粒、直链核酸分子、核酶和脱氧核酶以及附加型载体业已在将质粒DNA注射到肌肉(Wolff J.A.等.，1990，Science，2471465-1468；Carson D.A.等，美国专利No.5,580,859)、甲状腺(Sykes等.，1994，Human Gene Ther.，5837-844)、黑色素瘤(Vile等，1993，Cancer Res.，53962-967)、皮肤(Hengge等，1995，Nature Genet.，10161-166)、肝脏(Hickman等，1994，Human Gene Therapy，51477-1483)中之后和与气道上皮接触之后(Meyer et al.，1995，Gene Therapy.2450-460)观察到异源基因的表达有效的治疗性核酸序列包括那些编码受体、酶、配体、调节因子和结构蛋白的核酸序列治疗性核酸序列还包括编码核蛋白、细胞质蛋白、线粒体蛋白、分泌性蛋白、细胞质膜相关性蛋白、血清蛋白、病毒抗原、细菌抗原、原生动物抗原和寄生虫抗原的序列适用于本发明的治疗性核酸序列还包括编码蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白和核酸(例如，RNA如核酶或反义核酸)的序列由核酸编码的蛋白或多肽包括激素、生长因子、神经递质、酶、凝血因子、载脂蛋白、受体、药物、癌基因、肿瘤抗原、肿瘤抑制剂、结构蛋白、病毒抗原、寄生虫抗原和细菌抗原这些化合物的具体实例包括胰岛素原、生长激素、肌营养不良蛋白、雄激素受体、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、上皮生长因子TGF-α、TGF-β、PDGF、血管生成因子(酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和血管生成素)、基质蛋白(IV型胶原、VII胶原、层粘连蛋白)、苯丙氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶、癌基因(ras，fos，myc，erb，src，sis，jun)、E6或E7转化序列、p53蛋白、Rb基因产物、细胞因子(例如IL-1，IL-6，IL-8)或其受体、病毒壳体蛋白，和来自病毒、细菌和寄生虫生物的可以用来诱导免疫反应的蛋白，以及在机体中具有有益重要性的蛋白可以掺入的化合物仅仅受到核酸序列对被掺入蛋白或多肽的适用性的限制所属领域技术人员应很容易理解，由于鉴定出了更多的蛋白和多肽，所以可以将它们整合在所选择的传递复合物中，利用本发明的经修饰的膜破裂性肽转染并且表达利用本发明的经修饰的膜破裂性肽传递的核酸包括那些编码患者可能缺乏的蛋白质的核酸，或临床上在高于正常的浓度下有效的核酸，以及那些被设计用来消除不需要蛋白的翻译的核酸用于消除有害蛋白的核酸是反义RNA和核酶，以及编码它们的DNA表达构建体锤头类的核酶是最小的已知核酶，其自身提供给体外合成和传递给细胞(Sullivan概述，1994，J.Invest.Dermatol.，10385S-98S；Usman等，1996，Curr.Opin.Struct.Biol.，6527-533)本发明还提供用于治疗的本发明的经修饰的膜破裂性肽或传递复合物本发明进一步提供本发明的经修饰的膜破裂性肽或传递复合物在制备遗传疾病治疗用药物中的应用遗传疾病被定义为可以在遗传水平上治疗的疾病，即通过给需要此类治疗的患者施用核酸进行治疗遗传疾病包括但不限于酶缺失(例如肝脏、消化系统、皮肤和神经系统的那些酶)、内分泌缺乏(例如缺少生长激素、生殖激素、血管活性激素和流体静力压激素)、外分泌缺乏(例如胰腺激素分泌的缺乏)、神经变性疾病(例如阿耳茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿氏舞蹈病、泰-萨二氏病等)、癌症、肌肉营养不良和白化病本发明还提供一种治疗遗传疾病的方法，该方法包括给需要此类治疗的患者施用有效量的含有治疗性核酸和本发明的经修饰的膜破裂性肽的传递复合物本发明现在以所附的实施例、参考下列附图进行举例说明

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法律状态

专利名称：共价寡聚的膜破裂性肽的制作方法图1表示CP36二聚体(CP36D)、CP36单体(CP36M)和蜂毒肽(CP1)的红细胞溶解活性。图2表示CP36和CP48的红细胞溶解活性。图3表示在DTT存在或不存在下和在10％胎牛血清的存在下，当用在不同电荷比例下复合的CP12、18、36、39、41、42、43、44、45和48转染时HepG2细胞的转染。图4表示在DTT存在或不存在下和在10％胎牛血清的存在下，当用在不同电荷比例下复合的CP12、18、36、39、41、42、43、44、45和48转染时HepG2细胞的蛋白水平。蛋白水平的降低是对细胞产生毒性作用的指征。图5表示在DTT存在或不存在下和在10％胎牛血清的存在或不存在下，用与CP36/1(第一批)、CP36/1.2(第二批)复合的pCMVβ对HepG2细胞的转染。命名Red是指还原形式，即在5mM DTT的存在下；NR是指非还原形式，即没有加入DTT。图6表示从比较HUVEC的萤光素酶表达的试验获得的数据，其中HUVEC用在四种电荷比例下的CP36复合DNA转染，CP36为不同批次的CP36肽。肽的批次是指不同的合成，它们被称作CP36/1、/3、/4、/5、/6。图7表示多个比较HUVEC的平均萤光素酶表达的试验的汇编(括号中表示试验的编号)，其中HUVEC用不同电荷比例或N∶P比例的CP36复合DNA和PEI复合DNA转染，所用PEI为22kDa的线性PEI(Exgen-500)。
图8表示比较来自HUVEC的表达GFP的细胞平均百分率的试验的编译(括号中表示试验的编号)，其中HUVEC用不同电荷比例或N∶P比例的CP36复合DNA和PEI复合DNA转染，所用PEI为22kDa的线性PEI(Exgen-500)。
图9表示利用不同的肽给予75μg DNA后萤光素酶在多种组织中的体内表达。
图10表示HUVEC的平均萤光素酶表达，其中HUVEC用被CP36二聚体包被的NBC28DNA颗粒转染。
各个合成是以0.05mmol的规模、利用Fmoc-PAL-PEG-PS树脂(P.E.Biosystems)进行。合成中采用由该仪器提供的延伸、缓慢活化和偶联循环。利用含20％哌啶的DMF溶液进行脱保护。下列氨基酸衍生物在适宜时用于肽中Fmoc-L-Ala-OH，Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-L-Ile-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Fmoc-L-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Nle-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Ser(tBu)-OH，Fmoc-L-Thr(tBu)-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Val-OH，Fmoc-L-Lys(Fmoc)-OH。利用TBTU和DIPEA实现氨基酸的活化。在合成最后步骤中，脱除Fmoc基，此后溶剂更换为二氯甲烷，在干燥氮气流下干燥树脂。取出含有树脂的柱子并且进一步在真空和室温下干燥2-3小时。
用三氟乙酸(TFA)/水/三异丙基甲硅烷(TIS)95∶2.5∶2.5从树脂上裂解下不含半胱氨酸残基的肽，用三氟乙酸(TFA)/水/三异丙基甲硅烷(TIS)/乙二硫醇(EDT)92.5∶2.5∶2.5∶2.5裂解下那些含有半胱氨酸残基的肽。将一个空的5ml注射器与各个柱子的一端相连，并且将一个含有裂解混合物的2.5ml注射器连接在柱子的另一端。将裂解混合物(1ml)注射到各个柱上，令它们静置30分钟，随后再注射1ml，30分钟后注射最后的0.5ml。静置30分钟后，取下空的2.5ml注射器，将剩余的裂解混合物抽入5ml注射器内。从5ml注射器上取下柱子，倒置并更换，此后将含有裂解混合物的新的2.5ml注射器连接在另一末端，重复裂解过程。将5ml注射器的内容物排出到含有乙醚(45ml)的50ml离心管中。令所得沉淀在室温下静置1-2小时，倾出上清液。剩余的乙醚在干燥氮气流下吹除，沉淀块进一步在真空下干燥2-3小时。方法2肽的连续流动合成在P.E.Biosystems Pioneer肽合成仪上运行1.7版的设备软件来合成肽。该仪器安装了一个与柱位2相连的单一MPS部件，其由运行1.3版软件的工作站控制。
各个合成是以0.2mmol的规模、利用Fmoc-PAL-PEG-PS树脂(P.E.Biosystems)进行。为了偶联除半胱氨酸之外的所有氨基酸，采用仪器所提供的延伸偶联循环。为了偶联半胱氨酸，采用一个特殊的延伸(1小时偶联时间)溶剂交换循环，使偶联在DMF/DCM1∶1中进行。采用含20％哌啶的DMF溶液进行脱保护。下列氨基酸衍生物在适宜时用于肽中Fmoc-L-A1a-OH，Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-L-His(Trt)-OH，Fmoc-L-Ile-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Fmoc-L-Lys(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Ser(tBu)-OH，Fmoc-L-Thr(tBu)-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Val-OH，Fmoc-L-Lys(Fmoc)-OH。利用TBTU和DIPEA在DMF中活化除半胱氨酸之外的氨基酸。利用存在于DMF中的TBTU和存在于DCM中的均三甲基吡啶活化半胱氨酸。在合成最后步骤中，脱除Fmoc基团，随后溶剂更换为二氯甲烷，并且在干燥氮气流下干燥树脂。把柱子中的树脂冲洗到过滤漏斗中，使其风干数分钟，转移到预称重烧瓶内，在真空下进一步干燥直至获得恒定重量。
室温下1.5小时用三氟乙酸(TFA)/水/三异丙基甲硅烷(TIS)95∶2.5∶2.5(20ml)从树脂上裂解下不含半胱氨酸残基的肽，室温下1.5小时用三氟乙酸(TFA)/水/三异丙基甲硅烷(TIS)/乙二硫醇(EDT)92.5∶2.5∶2.5∶2.5(20ml)裂解下那些含有半胱氨酸残基的肽。在各种情况中，随后滤出树脂，用纯的TFA(3×5ml)洗涤，合并的滤液和洗涤液蒸发至体积减小至约3ml。残余物转移到含有乙醚(45ml)的50ml离心管内。室温下令所得沉淀静置1-2小时，倾除上清液。。剩余的乙醚在干燥氮气流下吹除，沉淀块进一步在真空下干燥2-3小时。肽的纯化利用反相HPLC纯化肽。较高极性的肽在Shandon Hypersil SAS柱(120?，10μ，150×21.2mm)上利用水(0.1％TFA)乙腈(0.1％TFA)的梯度纯化，一般为20分钟内水中10-65％乙腈的梯度，流速为24ml/分钟，或在Phenomenex Jupiter C4柱(120?，5μ，250×10mm)上利用水(0.1％TFA)乙腈(0.1％TFA)的梯度纯化，一般在30分钟内水中30-100％乙腈的梯度，流速为6ml/分钟。
根据飞行质谱的基质辅助激光解吸附/电离时间(matrix assistedlazer desorption/ionisation time of flight mass spectrometry)(MALDI-TOFMS)和HPLC的测定，将含有感兴趣肽的级份合并且冷冻干燥。肽多聚体形成为了完成经二硫键或半胱氨酸键二聚合或低聚合，将纯的肽溶于新制的20mM碳酸氢铵中，室温下放置16小时。通过分析凝胶过滤色谱、利用Pharmacia Superdex Peptide HR 10/30柱、用存在于含0.1％TFA的水中的20％乙腈洗脱、以0.8-1.0ml/分钟的流速证实了二聚合。通过监测洗脱液在214nm的吸光度证实了二聚合肽的洗脱时间减小。
为了合成双乙烯基砜连接的偶联物(CP48)，将2.0mg Biolink 6(Molecular Biosciences，Colerodo)溶于100μl乙腈，用25mM HEPES，pH7.2使体积达到1.0ml。随后将200μl的该溶液加入15mg溶于800μl缓冲液中的CP36单体(5.2μmol)。该反应通过MALDI和RP-HPLC监测，并且在24℃下1小时后判断反应完全。用Phenomenex Jupiter C4半制备柱在30分钟内在含0.1％TFA的水中乙腈由30增高至100％的梯度纯化可以分离出终产物。终产物的质谱由MALDI-TOF MS证实。红细胞溶解试验向9.0ml血液中加入1.0ml 110mM柠檬酸盐(pH5)阻止凝固。血液在2000rpm下旋转5分钟。抽出血浆上清液，并且通过连续混合、离心和抽吸用HBS洗涤沉淀团至少6次。抽吸澄清的上清液，沉淀团用适当的缓冲液洗涤2次或HBS(pH 7.4)或15mM乙酸钠pH5，150mMNaCl。将适当的缓冲液加入血液沉淀团中使总体积为6ml，从该储备制剂中取1ml，用缓冲液稀释15倍，得到最终的工作溶液。在96孔平板中一式三份，通过把75ml存在于适当缓冲液中的血液溶液加入100ml存在于相应缓冲液内的肽溶液中并混合，可以测试连续稀释的肽。血液和肽在37℃下温育1小时。在这个阶段中，向不含有肽的血液溶液内加入1％Triton X-100用作100％溶解的对照。细胞在2500rpm下离心5分钟，取80ml上清液用于在450nm下分光光度分析。复合物的制备以40μg/ml存在于HBS(HEPES缓冲盐水)(pH7.4)中的质粒DNA迅速与等体积的存在于HBS中的适当浓度的转染剂混合，令其在室温下温育1小时。对于肽利用最终预期电荷比例，或对于PEI(Exgen-500，Euromedex，France)利用氮(产自PEI)磷酸(产自DNA)的最终预期比例，可以测定出转染剂的浓度，按照Felgner等(1997)(合成基因传递体系的命名法，Gene Therapy，(1997)8511-512)的定义计算电荷比例。HepG2转染试验1.β-Gal转染方案在转染前一天将HepG2以5×104个细胞/孔铺板在96孔板中的DMEM+10％FCS(含有抗生素)内，并且在37℃下培育。次日，细胞用100μl/孔PBS洗涤。把含有10％FCS和抗生素的90μl HEPES缓冲RPMI加入细胞，随后加入10μl转染复合物，其按照上述方法制备并含有质粒pCMVβ受体质粒(编码β-半乳糖苷酶的质粒)。复合物在5mM DTT存在或不存在下配制用于还原所有肽的二硫键。利用有关对照，证实制剂中本身存在的DTT对于转染没有观测得到的影响。用各种复合物一式三份转染细胞。该细胞在1100rpm下离心，随后在潮湿条件下于非通气培育箱中37℃下培育5小时。5小时后，除去转染培养基，细胞用100μl/孔PBS洗涤，随后在DMEM/10％FCS(含有抗生素)培养基中、于CO2通气培育箱中培育19-20小时。最后，细胞用PBS洗涤2次，用30ml 0.1％Triton、250mM Tris，pH8溶解，并且在β-gal试验之前冷冻在-20℃下。2.β-Gal试验冷冻的溶解细胞在室温下解冻，从各孔中取10μl用于蛋白试验。剩余的细胞溶解物通过Galacton-Sstarβ-gal试验(TROPIX)分析β-gal报告体，并且利用运行SPC模式的96孔TopCount闪烁计数器测量发光。利用DC蛋白分析试剂盒(BioRad)测定溶解物中总的蛋白含量。利用在得自相同96孔平板上未转染细胞的细胞溶解物中绘制的β-gal标准曲线，转染数表达为pgβ-gal/ng总蛋白。HUVEC转染试验荧光素酶转染试验在转染前一天将初级HUVEC(Promocell，Germany)以1×104个细胞/孔铺板在0.1％明胶包被的96孔平板中含有补充物的内皮生长培养基中(EGMS)(Promocell，Germany)，并且在37℃下于CO2通气培育箱内培育。次日，细胞用PBS洗涤。向细胞中加入90μl/孔含10％FCS和抗生素的培养基M199(Sigma)，随后加入10μl/孔转染复合物，其用pCMVLuc报告质粒(编码萤火虫荧光素酶的质粒)制成。对于各个复合物，细胞一式三份转染。该细胞在1100rpm下离心5分钟，随后在37℃下在CO2-通气培育箱内培育1小时。1小时后，除去转染培养基，细胞用100μl/孔PBS洗涤，随后在100μl/孔EGMS中于37℃下在CO2通气培育箱内培育20-24小时。荧光素酶试验20-24小时后，采用LucScreen试验(TROPIX)、利用运行SPC模式的96孔TopCount闪烁计数器(Packard)测量的发光可以测定荧光素酶的表达。GFP转染方案在转染前一天初级HUVEC以1.5×105个细胞/孔接种在6孔平板中的2ml EGMS中。次日，细胞用2ml/孔PBS洗涤2次，加入1ml/孔转染溶液，其组成为100μl用pCMVEGFP报告质粒(编码绿色荧光蛋白的质粒)制成的转染复合物并且与900μl含10％FCS和抗生素的M199混合。对于各种复合物，细胞一式二份转染。该细胞在37℃下在CO2通气培育箱中培育2小时，此后将培养基重新更换为2ml/孔的EGMS。细胞在37℃下在CO2通气培育箱中进一步培育24小时。GFP试验24小时后，细胞用2ml/孔PBS洗涤，胰蛋白酶消化，用M199培养基+10％FCS重新悬浮。通过FACS分析测定转染细胞的百分比。利用肽的pCMVLuc的体内传递以500μg/ml存在于HBS中的pCMVLuc与等体积(通常为500μl)的适当浓度的肽或聚赖氨酸(127聚体)(Sigma)混合达到预期的电荷比例。该电荷比例由等Felgner等(Hum.Gene Ther.，8(5)，511-2，1997)定义。将3-4秒内将肽或聚赖氨酸加入DNA并且在涡旋搅拌器上以800rpm混合。复合物在室温下培育1小时。将300μl的复合物注射到CD-1小鼠的尾静脉。20小时后，处死小鼠，各取出80-200mg的器官，简单弄干以除去过量液体，在液氮中冷冻并且保存在-80℃下。称量冷冻的组织，在溶解缓冲液(10mM磷酸钠，含有1mM EDTA、1％TritonX-100、15％甘油、8mM MgCl2、0.5mM PMSF、1mM DTT)中解冻，用微型珠搅拌器-8(Stratech Ltd)和1mm玻璃珠匀浆0.3-2分钟。取出匀浆，用溶解缓冲液洗涤玻璃珠，将洗涤液与匀浆合并。通过在13000rpm下离心5分钟除去微粒，取80μl在Berthold LB593发光计中用0.1mM荧光素、0.44mM ATP测定荧光素酶的活性，并且采集时间为4秒。结果表示为RLU，以mg各组织的重量计。
下列肽制备为单体，或可能的话利用上述方法制备为二聚体或其他多聚体CP1 GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-CONH2CP2 CIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-CONH2CP18GIGAVLKVLTTGLAALJSWIKRKRQQ-CONH2CP36CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ-CONH2CP37GIGAVLEVLTTGLAALISWLERERQQC-CONH2CP39Nle-IGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ-CONH2CP41CIGAVLKVLTTGLAALISWLKRKRQQ-CONH2CP42CIGAVLKVLTTGLAALLSWLKRKRQQ-CONH2CP43CIGACLKCLTTGLWALISWLKRKRQQ-CONH2CP44CIGAVLKVLTTGLAWLISWLKRKRQQ-CONH2CP45CIGAVLKVLTWGLAALISWLKRKRQQ-CONH2 CP-46 NH2-LLQSLLSLLQSLLSLLLQWLKRKRQQ-CONH2CP-47 NH2-CLLQSLLSLLQSLLSLLLQWLKRKRQQ-CONH2CP-49 NH2-CIGAVLKVLTTGLAALISWTKRKRQQC-CONH2CP-50 NH2-GIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQC-CONH2CP-51 NH2-CIGAVLEVLTTGLAALISWLERERQQ-CONH2CP-52 NH2-CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQK-CONH2｜NH2-CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ-CONH2CP-53 NH2-GIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQKC-CONH2｜NH2-GIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ-CONH2CP-54 NH2-CIGAVLKVLTTGLAALISWLAALISWIKRKRQQ-CONH2CP-55 NH2-CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ-CONH2SSNH2-GIGAVLEVLTTGLAALISWLERERQQC-CONH2CP56 NH2-CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ-CONH2｜SS｜NH2-CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQK-CONH2｜NH2-CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ-CONH2｜SS｜NH2-CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ-CONH2CP-57 NH2-GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRCRQQ-CONH2CP-58 NH2-CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ-CONH2SSNH2-GIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQC-CONH2CP-59 NN2-GIGAVLEVLTTGLAALISWLERERQQC-CONH2/SS/NH2-CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQK-CONH2｜NH2-CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ-CONH2SSNH2-GIGAVLEVLTTGLAALISWLERERQQC-CONH2CP-60 NH2-GIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ-CONH2｜NH2-GIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQKC-CONH2｜SS｜NH2-GIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQKC-CONH2｜NH2-GIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ-CONH2
CP1是蜂毒肽，蜜蜂毒液的主要毒性成分。
CP2是CP1(G1至C)。这种肽被设计为形成CP1的由N末端半胱氨酸连接的二聚体。
CP18是CP1(P14至A)。这种肽被修饰成基本上连续的螺旋。
CP36为CP1(G1至C；P14至A)。修饰这种肽生成二聚体并且具有基本上连续的螺旋。
CP39为CP36(C1至正亮氨酸)。引入该修饰可以提高N末端的疏水性。
肽CP41至CP45被设计为用于研究保守氨基酸变化对CP36活性的影响。
CP37为CP18(I20至L)且所有赖氨酸用谷氨酸替换。
CP41为CP36(I20至L)。
CP42为CP36(I17至L；I20至L)。
CP43为CP36(A14至W；I20至L)。
CP44为CP36(A15至W；I20至L)。
CP45为CP36(T11至W；I20至L)。
CP46是含有保守氨基酸变化并且基于DeGrado等，(1981)，J.Am.Chem.Soc.，103,679-681所述序列的蜂毒肽的功能同系物。
CP47为具有适合二聚体形成的附加N末端半胱氨酸的CP46。
CP49为具有适合多聚体形成的附加C末端半胱氨酸的CP36。
CP50为具有适合多聚体形成的附加C末端半胱氨酸的CP18。
CP51是全部赖氨酸残基被谷氨酸替换的CP41。
CP52是通过附加C末端赖氨酸的双胺修饰而形成的CP36的二聚体。
CP53为具有附加C末端赖氨酸且半胱氨酸残基与CP36相连的CP36的二聚体。
CP54为具有内插在20位的LAALISW以增加α螺旋长度的CP36。
CP55为CP36和CP51的杂二聚体。
CP56是由CP52和2个CP36肽组成的四聚体。
CP57是CP1(K23至C)。
CP58是CP36和CP50的杂二聚体。
CP59是由与两个C37肽相连的CP52的二聚体组成四聚体。
CP60是由CP53的二聚体组成的四聚体。
CP61是由CP36和CP51组成的二聚体，其中二硫键在N末端的半胱氨酸之间形成。
已经观察到，按照在琼脂糖凝胶上质粒生长减缓的测定，虽然蜂毒肽(CP1)能够有效地结合DNA，但蜂毒肽DNA复合物很少或不用于HepG2细胞的转染，蜂毒肽对细胞产生毒性。细胞与此类复合物一起培育后，每个孔中的总蛋白减少，同时蜂毒肽对DNA(图4)的比例增高。这提示了蜂毒素形成多种扰乱生物膜的结构的能力可以引起毒性作用。有关蜂毒肽的机理的文献提出，虽然这种肽在溶液中在高浓度和/或高离子强度下以四聚体存在，但它必须能够解离为单体形式，从而能够插入膜中，在膜中其可以聚集成为成孔四聚体。相信蜂毒肽的成孔四聚体可以促进被动离子渗透性，并且被认为对细胞有毒性。据称蜂毒肽的二聚合或四聚合应产生一种细胞毒性低的结构。二聚合或四聚合有效地防止成孔四聚体形成的启动。蜂毒肽二聚体或四聚体将具有膜破裂特性，因为非极性两亲性螺旋占优势。可以确定，通过用能够使螺旋延长的残基替换蜂毒肽14位的使螺旋结构扭结的Pro残基，可以优化蜂毒肽的两亲性螺旋与膜表面之间的相互作用。
如上所述，构建二聚体，并且通过红细胞溶解试验测定它们的膜破裂特性。令人惊奇地，虽然二聚体的溶解活性在pH7和5时高于蜂毒肽(参见图1和2)，二聚体对哺乳动物细胞系的毒性较低(参见图4)。所以认为，孔的形成有毒性，而其他膜破裂/去稳定化结构是无毒性的。
具有上述螺旋延伸的蜂毒肽的二聚合得到能够结合DNA的构建体；所得DNA复合物对于HepG2细胞的损害明显较小，如通过蛋白含量判断法测定(参见图4)的，并且在外源性试剂的不存在下可以有效用于多种细胞种类的有效转染(参见图3和5)。还发现，转染过程中胎牛血清的存在使转染水平增高(参见图5)。
图9表示本发明的肽CP36和CP61可以有效提高DNA对多种体内组织的转染。用CP36二聚体包被的传递复合物该传递复合物制备如下1.在电荷比例±4和25μg的DNA浓度下制备NBC28DNA复合物在10mM HEPES pH7.4中制备92.6μg/ml的NBC28溶液和50μg/ml的pCMVluc DNA溶液。将肽溶液以1∶1(v/v)比例加入DNA溶液中，RT下放置1小时。NBC28是具有氨基酸序列TKKKKKKKKKKKKKKKKKKYCG的核酸缩合肽。
2.复合物的包被将包被肽加入复合物中，随后加入约10mM HEPES缓冲液，使体积达到预期终体积的97％。将所得复合物涡旋10秒，随后保存在4℃下过夜。
3.盐的掺加次日清晨(约18小时后)，向复合物中加入5M盐(3％终体积得到150mM盐)，随后涡旋10秒，RT下继续放置1小时。
4.复合物的重构在1.5ml微量离心管(Eppendorf)中使复合物在13000rpm下在MSEMicrocentaur离心机内旋转30分钟。取出上清液(75％)，加入等体积的新制HBS，并缓慢涡旋，用Gilson吸管上下抽吸30秒。
5.复合物的超声转染之前，复合物在1.5ml微量离心管中在超声浴内超声30秒。
随后按照上述方法将复合物转染到HUVEC细胞内。
图10表示用CP36二聚体包被的复合物得到HUVEC细胞的良好转染，尤其是，该转染水平高于CP36或NBC28单独使用时获得的转染水平。

本发明涉及经修饰的膜破裂性肽。本发明还涉及含有所述经修饰的膜破裂性肽的传递复合物和该传递复合物的应用。所述经修饰的膜破裂性肽被修饰成共价连接的多聚体。

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