专利名称：与免疫增强剂相连的寡聚流感免疫原性组合物的制作方法属于Orthomyxoviridae科的甲型流感病毒能在人、鸟类或驯养的食用动物中导致流感。可基于其表面糖蛋白，血细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)，将所述病毒分为不 同亚型。在16种已知的HA和九种NA中，有三种HA亚型(H1、H2和H3)和两种NA亚型(NI和N2)最常在人中被发现。HlNl和H3N2是导致人季节性流行性感冒(flu)和流感全球流行的主要亚型。2009年的流感流行是猪源的甲型流感病毒HlNl导致的。其引起了对高度致病性的禽流感(HPAI)H5N1病毒流行潜势的日益増加的关注。因此，为预防流感的未来爆发，迫切需要开发针对不同的甲型流感病毒毒株的有效且安全的疫苗。
本文公开了用于预防流感病毒感染的免疫原性组合物。公开的免疫原性组合物是三聚体蛋白，其包含1)免疫原，例如流感血细胞凝集素序列；2)三聚化或稳定化序列；和3)免疫增强剂序列。这三种序列是连续的，并且作为单个蛋白在哺乳动物表达系统中表达，或者，免疫原和免疫原和免疫增强剂以化学方式相连并被稳定。在一种实施方式中，本文公开了用于诱导针对流感病毒的免疫应答的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含下述多肽，所述多肽包含免疫原和免疫增强剂。在另ー实施方式中，所述多肽还包含稳定化序列。在其它ー些实施方式中，免疫原是流感病毒的血细胞凝集素序列、流感病毒的神经氨酸酶序列或流感病毒的膜蛋白序列。在另ー实施方式中，免疫原是所述血细胞凝集素序列的片段，其选自HA1、HA2和RBD构成的组。在另ー实施方式中，免疫增强剂选自人IgG、C3d、Onchocerca volvulus ASP-1、clera 韋素和胞壁酸妝构成的组。在另ー实施方式中，稳定化序列是折叠子(foldon)或GCN4。在还ー实施方式中，多肽是融合蛋白。在另ー实施方式中，多肽是在哺乳动物表达系统中产生的。在另ー实施方式中，多肽选自HAl-hFc、HA-hFc、HAl+3-259-hFc、HAl-Fd-hFc、HA-Fd-hFc、HA2-Fd_hFc、HA-RBD-Fd-hFc 和 HAl+3-259-Fd_hFc 构成的组。在另ー实施方式中，免疫原与所述稳定化序列相连，并且其中，所述稳定化序列与免疫增强剂相连于单条多肽中。在还ー实施方式中，免疫原和免疫增强剂通过2，2_联吡啶-5-羧酸(BPY)被化学稳定。在又ー实施方式中，免疫原性组合物还包含佐剂。本文还公开了诱导针对流感病毒的保护性免疫应答的方法，所述方法包括将权利要求I的免疫原性组合物施用给需要其的宿主，并且其中，所述免疫原性组合物在宿主中诱导针对感染性试剂攻击的保护性免疫应答。在另ー实施方式中，免疫原性组合物还包含佐剂。图I示出了甲型流感H5N1病毒的血细胞凝集素(HA)蛋白[A/Anhui/1/2005 (H5N1)]的结构，还示出了含有HAl片段(氨基酸[aa]+3-322)的重组HAl-hFc和HAl-Fd-hFc蛋白、以及与人IgG Fe (hFc)融合的、包括H5N1病毒HA的aa+3-259的HAl片段的重组HA-3-259-Fd-hFc蛋白(有或没有Fd序列)的构建。图2示出了对表达的HAl-hFc和HAl-FchhFc蛋白的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(图2a)和Western杂交印迹(图2b)分析。图3示出了对表达的HAl-hFc和HAl-Fd-hFc蛋白的快速蛋白液相色谱(FPLC)分祈。蛋白的分子量示于每个峰上，还示出了对应于经计算的标准蛋白的结构。图4 示出了 用重组 HAI-hFc、HA-Fd-hFc 和 HA-3-259-Fd_hFc 蛋白对 BALB/c 小鼠免疫的示意图，对诱导的抗体和中和活性的检测，用活H5N1病毒对经疫苗接种小鼠的攻击，用于交叉保护评估。图5示出了在第O天(免疫前)和用重组HAl-hFc和HAl-Fd-hFc蛋白的第一次、第二次和第三次強化之后10天收集的小鼠血清(I 3000稀释)的结合反应活性。图 6 示出了 IgG 抗体(Ab)与 HAl-hFc、HAl-Fd-hFc 和 HA-3-259-Fd_hFc 融合蛋白结合的能力，这是在用HAI-hFc、HAl-Fd-hFc和HA-3-259-Fd-hFc蛋白进行最后一次免疫接种后10天收集的小鼠血清中检测的。图7示出了最后一次免疫接种后10天收集的小鼠血清的平均抗HAl-hFc、抗HA-Fd-hFc 和抗 HA-3-259-Fd_hFc IgG Ab 效价。图8示出了 IgG Ab与没有Fd和Fe的HAl蛋白结合的能力，这是在用HAl-hFc、HAl-Fd-hFc和HA-3-259-Fd-hFc蛋白进行最后一次免疫接种后10天收集的经系列稀释的小鼠血清中检测的。图9 示出了 IgG Ab 与 A/VietNam/1194/2004(VN/1194)_ 失活 H5N1 病毒结合的能力，这是在用HAl-hFc和HAl-Fd-hFc进行最后一次免疫接种后10天收集的经系列稀释的小鼠血清中检测的。图10示出了 IgGl亚型Ab与HAl蛋白结合的能力，这是在用HAl-hFc和HAl-Fd-hFc进行最后一次免疫接种后10天收集的经系列稀释的小鼠血清中检测的。图11示出了 IgG2a亚型Ab与HAl蛋白结合的能力，这是在用HAl-hFc和HAl-Fd-hFc进行最后一次免疫接种后10天收集的经系列稀释的小鼠血清中检测的。图12示出了对经HAl-hFc和经HAl-FchhFc免疫接种的小鼠中IgGl和IgG2a Ab应答的比较。图13示出了经HAl-hFc每次强化免疫接种后的小鼠血清针对表达XJ-HA、QH_HA、 AH-HA和HK-HA的H5N1假病毒的中和Ab效价(NT5tl)，这是通过假病毒中和检验测量的。图14示出了经HAl-Fd-hFc每次强化免疫接种后的小鼠血清针对表达XJ-HA、QH-HA,AH-HA和HK-HA的H5N1假病毒的中和Ab效价(NT5tl)，这是通过假病毒中和检验测量的。 图15示出了经HAl-hFc和HAl-Fd-hFc每次强化免疫接种后的小鼠血清针对表达同源AH-HA的H5N1假病毒的中和Ab效价(NT5tl)，这是通过假病毒中和检验测量的。图16示出了针对H5N1假病毒的异源(HK-HA、1194-HA、QH-HA和XJ-HA)和同源(AH-HA)毒株的HA的中和Ab效价(NT5tl)，这是在用HAl-hFc和HAl-Fd-hFc进行最后一次免疫接种之后10天在小鼠血清中检测的。图17示出了针对H5N1假病毒的异源(HK-HA、1194-HA)和同源(AH-HA)毒株的HA的中和Ab效价(NT5tl)，这是在用HA-3-259-Fd-hFc蛋白进行最后一次免疫接种之后10天在小鼠血清中检测的。图18 示出了针对H5N1 活病毒的异源毒株A/Hong Kong/156/97 (HK/156)、VN/1194和 A/Shenzhen/406H/06 (SZ/406H)的中和 Ab 效价(NT5tl)，这是在用 HAI-hFc 和 HAl-FchhFc进行最后一次免疫接种之后10天在小鼠血清中检测的。图19示出了针对H5N1活病毒的异源毒株(HK/156，VN/1194和SZ/406H)的血细胞凝集素抑制(HI)抗体效价，这是在用HAl-hFc和HAl-Fd-hFc进行最后一次免疫接种之后10天在小鼠血清中检测的。图20示出了经HAl-hFc和经HAl-FchhFc免疫接种的小鼠针对致死性H5N1病毒攻击的交叉保护，这是通过被H5N1活病毒的HK/156毒株(分支0(clade O))攻击的小鼠的存活率(％)指示的。图21示出了经HAl-hFc和经HAl-FchhFc免疫接种的小鼠针对致死性H5N1病毒攻击的交叉保护，这是通过被H5N1活病毒的VN/1194毒株(分支I)攻击的小鼠的存活率(% )指示的。图22示出了经HAl-hFc和经HAl-FchhFc免疫接种的小鼠针对致死性H5N1病毒攻击的交叉保护，这是通过被H5N1活病毒的SZ/406H毒株(分支2. 3. 4)攻击的小鼠的存活率(％ )指示的。图23示出了对经H5N1病毒攻击的小鼠肺组织中病毒RNA的定量,这是通过定量逆转录PCR(QRT-PCR)来进行的。在经HAl-hFc和HAl-Fd-hFc蛋白免疫接种的小鼠的肺组织中，测定了 H5N1病毒的HK/156、VN/1194和SZ/406H毒株的病毒效价。图24示出了用H5N1病毒的异源毒株进行致死性攻击后、对经HAl-hFc和经HAl-Fd-hFc免疫接种的小鼠肺组织中的组织病理性改变的评估。来自注射了 PBS的小鼠的肺组织和未受感染的小鼠的肺组织分别被用作为阴性和正常对照。肺组织的所有切片用苏木精和曙红(H&E)染色，并在光学显微镜(放大倍率IOOx)下观察。示出了经H5N1毒株HK/156 (a), VN/1194(b)和SZ/406H(c)攻击的、经免疫接种的小鼠的组织病理学损伤的各幅图像。术语定义为帮助对下文的详述、实施例和所附权利要求的理解，參照下述定义可能是有用的。这些定义本身并非限制性的，其仅为读者便利而提供。基因“基因”在本文中使用时表示遗传构建体的下述至少一部分，其具有该遗传构建体所需的、或可修饰该遗传构建体的表达的启动子和/或其它调控序列。
宿主在本文中使用时“宿主”表示本发明的免疫原性组合物的接受体。示例性的宿主是哺乳动物，其包括但不限于灵长类、啮齿类、母牛、马、狗、猫、绵羊、山羊、猪和大象。在本发明的一种实施方式中，宿主是人。就本公开文本的目的而言，宿主与“被免疫接种者”同义。
免疫原在本文中使用吋，术语“免疫原”表示在宿主中引发免疫应答的任何底物。本公开文本的免疫原包括但不限于流感病毒的血细胞凝集素。免疫原性组合物在本文中使用吋,“免疫原性组合物”表示表达的蛋白或重组载体，其有或没有佐剂，其体内表达和/或分泌免疫原，并且其中，所述免疫原在宿主中引发免疫应答。本文公开的免疫原性组合物可以是或者可以不是免疫保护性的或治疗性的。当免疫原性组合可预防、减轻、缓和或消除患者的疾病时，那么免疫原性组合物可任选地被称为疫苗。但是，术语免疫原性组合物并非意欲被限制为疫苗。发明详述为预防流感未来的爆发(尤其是高度致病性禽流感(HPAI)H5N1病毒的不同毒株的流行潜势)，迫切需要开发针对不同的甲型流感病毒的有效且安全的疫苗。本公开文本描述了基于甲型流感病毒的表面血细胞凝集素(HA)蛋白来开发亚単元流感疫苗。该候选疫苗使用了哺乳动物细胞表达的、编码HA的HAl片段的重组蛋白。其在经免疫接种的动物中诱导強烈的免疫应答、有效的中和抗体和广泛的交叉保护免疫力。引发的中和抗体被证实对假型的(pseudotyped)甲型流感病毒分离株的至少五种毒株(代表分支O、1、2. 2和2. 3)有效，井能针对活H5N1流感病毒的至少三种毒株(覆盖分支O、I和2. 3. 4)进行中和和交叉保护。在本文公开的ー种实施方式中，提供了亚单元流感疫苗(免疫原性组合物)，其包含流感病毒的血细胞凝集素(HA)、稳定化序列和免疫增强剂。在另ー实施方式中，免疫原性组合物被表达于哺乳动物表达系统中。能提供异亚型(heterosubtypic)免疫力的通用流感疫苗对公共健康来说将是极大的进歩。本文公开了候选流感疫苗，其中使用哺乳动物293T细胞表达的融合蛋白，该蛋白编码甲型流感H5N1病毒[A/Anhui/1/2005 (H5N1)]的HAl片段(分别为残基+3-322，SEQ ID NO. 2和残基+3-259，SEQ ID NO. 30)。表达的重组蛋白与折叠子(Fd)序列(SEQ IDNo. 6)和人IgGl的Fe片段(SEQ ID NO. 7) (hFc)融合，其意图于维持天然HA蛋白的三聚体结构以及增加稳定性和免疫原性。折叠子是来自T4噬菌体纤维蛋白(fibritin)的三聚化或寡聚化模体(motif)。HA是同源三聚体嵌膜糖蛋白。其形状像圆柱体，长大约13. 5纳米。构成HA的三个相同单体被构建为中央α螺旋；三个球形头含有唾液酸结合位点。HA单体作为前体被合成，前体再被糖基化，并被切割成两个较小的多肽ΗΑ1和ΗΑ2亚单元。每个HA単体由通过ΗΑ2锚定在膜中的长螺旋链构成，并且顶部有大的HAl球体。在一种实施方式中，免疫增强剂是免疫球蛋白Fe片段。免疫球蛋白分子由通过ニ硫键保持在一起的两条轻(L)链和两条重(H)链构成，使得这些链形成Y型。Y的底部(重链的羧基端)在对免疫细胞活性的调节中具有作用。该区域被称为Fe (片段，可結晶)区域，由两条重链组成，取决于抗体的类型，该两条重链贡献两个或三个恒定结构域。通过与特定的蛋白结合，Fe区域确保每个抗体都产生针对给定抗原的合适免疫应答。Fe区域还与多种细胞受体(例如Fe受体)和其它免疫分子(例如补体蛋白)结合。由此其介导不同的生理效果，包括调理化(opsonization)，细胞裂解和肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的脱粒。本文公开的免疫原性组合物在测试动物中对有效免疫应答的诱导中具有高效力。它们能引发高度有效的中和抗体，所述抗体在基于细胞培养物的假病毒中和检验中，不仅能中和表达HA蛋白的H5N1病毒的同源A/Anhui/1/2005 (AH,分支2. 3)毒株，还能中和异源 A/Hong Kong/156/97 (HK,分支 O)、A/VietNam/1194/2004 (1194,分支 I)、A/Xinjiang/1/2006 (XJ，分支 2. 2)和 A/Qinghai/59/05 (QH,分支 2. 2)毒株。此夕卜，本文公开的免疫原性组合物能针对H5N1活病毒的至少三种不同毒株进行高度中和和完全交叉保护，所述毒株包括分支O :A/Hong Kong/156/97 (HK/156)，分支I AlVietNam/1194/2004 (VN/1194)和分支 2. 3. 4 A/Shenzhen/406H/06 (SZ/406H)。上述特征显示，表达的融合蛋白具有被开发为用于预防未来的流感暴发的通用流感疫苗的高度潜力。此前设计的基于流感HA的疫苗不能在宿主中诱导高度有效和广泛的中和应答，这最可能是因为这些疫苗不能正确维持稳定和可溶的三聚体构象，或者它们缺乏高效的免疫原性来诱导高水平的中和抗体。而本发明描述的免疫原性组合物解决了这些问题，这是 通过下述方式解决的1)向HAl添加Fd，三聚化模体，令HAl正确维持稳定和可溶的三聚体构象；以及2) IgG的Fe片段与HAl-Fd的融合，其导致HAl-三聚体的免疫原性增强以诱导高水平的中和抗体，以及产生针对广谱流感病毒的交叉保护。此外，Fe片段具有通过其ニ硫键形成非共价ニ聚体的趋势，这可令融合蛋白形成ニ聚体、六聚体或其它寡聚体形式，产生更具免疫原性的分子。诱导针对特定病毒的不同毒株的抗体的能力将能解决对所有流行性感冒疫苗生产商来说是显著阻碍的ー种毒株-一种疫苗的问题。此外，描述的配方不利用鸡蛋来培育病毒——这是重大优点，不仅显著降低生产时间和成本，还令孕妇和对鸡蛋的蛋白过敏的人也能接受疫苗。表I可用于设计与免疫增强剂相连的寡聚流感疫苗的组分


本发明公开了用于预防流感病毒感染的免疫原性组合物，其中，所述免疫原性组合物包含流感病毒的免疫原例如血细胞凝集素，以及免疫增强剂例如人IgG的Fc片段，和任选地稳定化序列。所述免疫原与稳定化序列相连，所述稳定化序列进而与免疫增强剂相连。