一种流感病毒通用疫苗及其制备方法【技术领域】。[0002]流行性感冒病毒(Infuenza virus, IV)简称流感病毒，属正粘病毒科。其临床特征是高热、呼吸困难以及其他各系统程度不同的临床症状。该病的流行特点是发病急骤、传播迅速、感染谱广、流行范围大，可引起多种动物出现大批死亡。[0003]由流感病毒引起的流行性感冒广泛分布于世界各地，而且历史已久，关于本病的报道不仅包含鸡群还包含猪群，近年来，随着各地养殖业的迅速发展，畜禽的流通大幅增加，流感病毒的感染日趋严重，给养殖业带来了重大的经济损失，成为危害畜牧业发展的重大疫病之一。本病发病急骤，疫苗免疫接种是预防本病的有效措施。[0004]本发明的目的是制备出一种安全、有效的流感病毒通用疫苗。
[0005]本发明的目的是利用流感HlNl病毒株作为生产疫苗的毒株，通过鸡胚培养的方法进行病毒增殖，并利用基因工程的方法进行目的基因的扩增，将其与PCAGGS真核表达载体进行连接、转化及克隆，制备一种流感病毒通用疫苗，从而达到减少畜禽在注射疫苗后的不良反应又能增强其对该病毒的应答反应。[0006]为达到上述目的，本发明所采用的具体技术方案如下:[0007]一方面，本发明提供一种流感病毒通用基因疫苗，其特征在于:由克隆有流感HlNl病毒株的HA2基因的pCAGGS真核表达载体构成。[0008]另一方面，本发明提供上述流感病毒通用基因疫苗的制备方法，具体步骤如下:
[0009]I)流感HlNl病毒株的HA2基因的获取；
[0010]2)流感病毒重组质粒的制备；
[0011]3)将重组质粒进行浓度调整，分装至不同EP管中，获得疫苗成品。
[0012]优选地，所述的流感HlNl病毒株的HA2基因的获取步骤包括:将A/PuertoRico/8/1934 (HlNl)病毒株倍比稀释，并将稀释产物接种9_11日龄的SPF鸡胚，进行病毒的大量扩增，48h后收取鸡胚尿囊液，利用引物进行HA2基因的大量扩增，并对其进行产物回收。
[0013]优选地，引物序列为:
[0014]正向引物:5’ -ATCGATGGTCTATTTGGAGCCAT-3 ’
[0015]反向引物:5，-AGATCTGATGCATATTCTGCACT-3’
[0016]优选地，流感病毒重组质粒的制备步骤包括:对获取的HA2基因及pCAGGS真核表达载体进行Cla I /Bgl II双酶切，对产物进行回收及连接转化，并作大量扩增，从克隆产物中提取重组质粒。
[0017]进一步优选地，所述的转化及大量扩增是将目的基因与表达载体连接，并将连接产物转入DH5a大肠杆菌中，利用常见的含有氨苄青霉素的LB溶液过夜培养即可。
[0018]再一方面，本发明提供流感HlNl病毒株的HA2基因和pCAGGS真核表达载体在制备流感病毒通用基因疫苗中的用途。
[0019]本发明的流感病毒通用疫苗的用途，主要用于控制流感病毒病。



图1为免疫天数与HA特异性抗体滴度关系的图。

[0020]1.A/Puerto Rico/8/1934 (HlNl)病毒株 HA2 基因扩增。
[0021](1)取9-11日龄的SPF鸡胚，于尿囊腔中接种0.2mL/胚的病毒液，37°C孵育，收集24-48h自然死亡或未死亡鸡胚尿囊液。血凝试验(HA)测定病毒的滴度，将有血凝滴度的尿囊液保存于_80°C备用。
[0022](2)根据Genbank上收录的HA2基因核酸序列(SEQ ID:N0.1)设计引物并引入限制性内切酶酶切位点，利用分子生物学方法对病毒中的HA2基因进行大量扩增。
[0023]其中，引物序列为:
[0024]正向引物:5’ -ATCGATGGTCTATTTGGAGCCAT-3 ’
[0025]反向引物:5’ -AGATCTGATGCATATTCTGCACT-3，
[0026](3)对HA2基因进行回收，并利用限制性内切酶Cla I /BglII进行双酶切使HA2暴露出粘性末端。
[0027]2.粘性末端真核表达载体的制备
[0028]取由哈尔滨兽医研究所赠与的pCAGGS真核表达载体质粒，利用限制性内切酶Cla I /BglII进行双酶切使载体暴露出粘性末端，以方便其余目的基因进行连接。
[0029]3.成品的制备
[0030]将暴露出粘性末端的HA2和pCAGGS进行连接转化，并大量扩增，利用质粒提取试剂盒大量提取重组质粒。
[0031]将重组质粒进行浓度调整，分装至不同EP管中，获得疫苗成品，密封保存于-20°C中。
[0032]针对HA基因和HAl基因，以类似的方法分别构建pCAGGS_HA和pCAGGS_HAl质粒，在后续试验中作为对照。
[0033]4.流感病毒通用疫苗的检验方法
[0034](I)性状白色、透明均一的溶液
[0035](2)无菌检验按《中国兽药典》规定的方法进行检验,应无菌生长。
[0036]5.甲醛和汞类防腐剂残留量测定按《中国兽药典》附录进行测定，应符合兽用生物制品通则的规定。
[0037]6.流感病毒通用疫苗安全性试验
[0038](I)酶联免疫吸附试验取6-8周龄BALB/c小鼠25只，双侧胫前肌注射，每只50 μ g疫苗成品，于免疫后10、20、30、40、50、60天分别进行小鼠眼眶取血，分离血清,按间接ELISA抗体检测试验步骤进行检测，于450nm测定各孔的OD值，记录试验结果，评价血清中特异性抗体滴度。[0039]用A/Puerto Rico/8/1934(HlNl)流感病毒的HA抗原包被ELISA板，从特异性ELISA抗体检测结果分析，免疫后的10天各免疫组没有明显的抗体产生。从免疫后的第20天起，各免疫组的抗体产生较明显，对照PCAGGS组没有抗体产生，在第40天免疫组的抗体含量明显高于对照组(P〈0.01)，第60天免疫组的抗体水平达到了最高值。以上结果表明:pCAGGS-HA,pCAGGS-HAl和pCAGGS_HA2三种重组质粒所形成的DNA疫苗能够显著刺激小鼠产生抗HA特异性抗体，但各免疫组之间差异不显著。结果见图1。
[0040](2)血凝抑制试验取6-8周龄BALB/c小鼠25只，双侧胫前肌注射，每只50 μ g疫苗成品，于免疫后10、20、30、40、50、60天分别进行小鼠眼眶取血，分离血清测HI抗体效价，
观察并记录试验结果。
[0041]在免疫后的第60天，所研制疫苗成品免疫的小鼠产生了针对A/PuertoRico/8/1934 (HlNl)流感病毒和 A/chicken/Hebei/4/2008 (H9N2)病毒的 HI 抗体。从表中明显可以看到三个免疫组之间的HI抗体效价是差异不显著。而其他组的结果表明不具有血凝抑制活性。以上结果说明，疫苗成品能够诱导产生HI抗体，结果见表1。
[0042]表1免疫后第60天小鼠血清的HI抗体检测
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