专利名称：疫苗的制作方法肺炎链球菌属革兰氏阳性菌，它可导致非常高地发病率甚至死亡(尤其对幼龄和高龄人)，并可引起诸如肺炎、菌血症和脑膜炎等侵袭性疾病以及与集群相关的疾病，如急性中耳炎。在美国，年龄大于60岁的人患有肺炎球菌性肺炎的比例估计为十万分之3-8。其中有20％会引发菌血症，其他则表现为脑膜炎，其死亡率接近30％，甚至用抗生素治疗也是如此。肺炎球菌包裹着化学交联的多糖荚膜，这可赋予其血清型特异性。目前已知的肺炎球菌血清型有90种，肺炎球菌的荚膜是其毒力的主要决定因素，因为这些细菌的荚膜不但可保护其内表面免受补体作用，而且荚膜本身的免疫原性很弱。多糖是非T细胞依赖性抗原，不能被加工或呈递到MHC分子上以与T细胞相互作用。但它们可通过替代机制来刺激免疫系统，该机制涉及与B细胞表面受体的交联。一些实验表明，对侵袭性肺炎球菌疾病的防护作用与荚膜特异性抗体强烈相关，并且这种防护作用具有血清型特异性。基于多糖抗原的疫苗已为该领域所熟知。已被准许用于人类的有四种，包括伤寒沙门菌的Vi多糖、来自流感嗜血菌的PRP多糖、含有血清型A、C、W135和Y的四价脑膜炎球菌疫苗，以及含有相当于血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33的多糖的23价肺炎球菌疫苗(至少占肺炎球菌血分离物的90％)。后三种疫苗可用来防护致呼吸道感染的细菌，此类感染能够在婴儿中导致严重的发病率和死亡，但这些疫苗未被准许用于年龄小于2岁的儿童，原因是它们在该年龄组中不具有足够的免疫原性〔Peltolaet al.(1984)，N.Engl.J.Med.3101561-1566〕。肺炎链球菌是婴儿和幼龄儿童的侵袭性细菌疾病与中耳炎的最常见病因。同样，高龄人对肺炎球菌疫苗的反应很弱〔Roghmann et al.，(1987)，J.Gerontol.42265-270〕，使得该群体的细菌性肺炎发病率上升〔Verghese and Berk，(1983)Medicine(Baltimore)62271-285〕。用来克服婴儿中的这种免疫原性缺陷的策略包括，将这种多糖与免疫原性大蛋白相连接，该蛋白能够协助旁T细胞，并可诱导出针对其结合的多糖抗原的免疫记忆。通过评定，目前认为肺炎球菌糖蛋白结合物疫苗在不同年龄组中均安全有效，并且具有免疫原性。A)肺炎球菌多糖疫苗23价非结合肺炎球菌疫苗的临床效果在0％-81％之间变化很大(Fedson et al.(1994)Arch Intern Med.1542531-2535)。其效果似乎与被免疫的风险人群有关，如高龄人、何杰金氏病、脾脏切除、镰状细胞病和无丙种球蛋白血症(Fine et al.(1994)Arch InternMed.1542666-2677)，并且与疾病的临床表现有关。这种23价疫苗并未显示出可防护肺炎球菌性肺炎(在诸如高龄人等某些高危人群中)以及中耳炎病。因此，我们需要改进的肺炎球菌疫苗组合物，特别是在预防或改善高龄人及幼龄儿童的肺炎球菌性疾病(尤其是肺炎)方面更有效的疫苗组合物。
本发明将提供这种改进疫苗。B)选定的肺炎球菌多糖结合物+3D-MPL组合物
一般认为商品化非结合肺炎球菌疫苗的防护效率与接种时诱导出的抗体浓度有或多或少的关系；实际上，这23种多糖只是在每种多糖组分的免疫原性方面获得了认证(Ed.Williams et al.New YorkAcademy of Sciences 1995 pp.241-249)。因此，进一步加强对肺炎球菌多糖的抗体反应可提高婴儿与高龄人利用保护性水平的抗体对首次注射的多糖或多糖结合物产生应答的比例，并且可减少诱导对肺炎链球菌感染的保护性免疫所必需的剂量和注射次数。
研究人员从20世纪初就开始对大量能够添加到抗原中以提高其在疫苗组合物中的免疫原性的复合物进行试验〔综述见M.F.Powell&M.J.Newman，Plenum Press，NY，“疫苗设计——亚基及佐剂方法”(1995)第7章“疫苗佐剂与赋形剂一览表”〕。其中有许多非常有效，但是会引起明显的局部或全身性副作用，从而阻碍其应用于人类疫苗组合物。1926年首次描述的铝型佐剂(如明矾、氢氧化铝或磷酸铝)仍然是经美国准许而用于人类疫苗的唯一免疫佐剂。
铝型佐剂属于载体类佐剂，可通过其攻击的“贮积效应”来发挥作用。抗原吸附在其表面，当注射该组合物时，佐剂和抗原不会立即分散在血流中——而是保留在注射的局部环境中，从而可获得更明显的免疫应答。这些载体类佐剂还具有其它优势，即适于使易分解抗原，如某些多糖抗原，保持稳定。
3D-MPL属于非载体类佐剂。其全称为3-O-脱酰基单磷酰脂A(或3脱-O-酰基单磷酰脂A或3-O-脱酰基-4’单磷酰脂A)，表示为3D-MPL，以说明其还原端葡糖胺的第3位为脱-O-酰基形式。其制备方法可参考GB2220211A。从化学上分析，它是3-脱酰基单磷酰脂A与4、5或6种酰化链的混合物。它最早制备于20世纪90年代初期，当时的方法是将脂A的4’-单磷酰衍生物(MPL)进行3-O-脱酰化，这种方法可产生一种毒性更弱但免疫刺激活性不变的分子。
目前已将3D-MPL本身作为一种独立佐剂，或是优选地与一种积累型载体佐剂结合使用，如氢氧化铝、磷酸铝或水包油型乳剂。这些组合物中包含的抗原和3D-MPL呈相同的颗粒结构，从而可更有效地呈递抗原信号和免疫刺激信号。研究表明，3D-MPL可进一步增强被明矶吸附的抗原的免疫原性〔Thoelen et al.Vaccine(1998)16708-14；EP689454-B1〕。此类组合还被该领域作为优选方法用于易吸附抗原(如细菌多糖结合物)，这些抗原被吸附到明矾上后有助于使其保持稳定。最常用的是沉淀的铝型佐剂，因为它们是目前被许可的人类疫苗中使用的唯一佐剂。因此，同时含有3D-MPL和铝型佐剂的疫苗因其易于研制且能够快速引入市场而备受该领域喜爱。
MPL(非3-脱酰化)已被用作几种一价多糖-结合物疫苗抗原的佐剂，并由此来对其进行评定。将MPL与生理盐水同时注射可加强血清抗体对四种一价多糖结合物的应答肺炎球菌PS 6B-破伤风类毒素、肺炎球菌PS 12-白喉毒素以及与绿脓假单胞菌外毒素A结合的金黄色葡萄球菌5型和金黄色葡萄球菌8型〔Schneerson et al.J.Immunology(1991)1472136-2140〕。增强的应答被认为具有抗原特异性。处于水包油型乳剂(载体型佐剂)中的MPL因其和抗原以相同的颗粒结构存在而始终强于生理盐水中MPL的作用，并且被认为是递送其它多糖结合物疫苗的优选佐剂系统。
Devi等人〔Infect.Immun.(1991)593700-7〕评定了处于生理盐水中的MPL(非3-脱酰化)在鼠对新生隐球菌荚膜多糖TT结合物的抗体应答方面的辅助效果。当同时使用MPL和该结合物时，对PS的IgM-和IgG-特异性应答都只有轻微的提高；但是在结合物给药2天后将MPL给药时，MPL的作用要大得多。需要将MPL相对于抗原进行延迟给药的免疫方案的实用性值得怀疑，尤其是对婴儿。MPL对多糖和多糖-蛋白结合物的辅助效果似乎依赖于组合物。此外，将MPL加到适当缓释递送系统中(如使用载体佐剂)可获得更持久的辅助效应，并且可避免时间调配以及延迟给药的问题。
总之，以目前的技术发展水平而言，当用MPL或3D-MPL为佐剂时，最好是将其与一种载体佐剂(如铝型佐剂)协同使用，以便最大程度地实现其免疫刺激效应。
本发明人惊奇地发现，对某些肺炎球菌多糖结合物而言，其疫苗组合物在抗原与3D-MPL单独配制时的免疫原性要明显高于抗原与3D-MPL和载体佐剂(如一种铝型佐剂)协同配制时的免疫原性。观测到的这种改进不依赖于所用3D-MPL的浓度，也与将特定结合物以单价组合物形式使用或是将其结合使用以形成多价组合物无关。C)细菌多糖-蛋白D结合物
如上所述，基于多糖抗原的疫苗已为该领域所熟知。上述被许可的多糖疫苗具有不同的实际临床效果。据估计，Vi多糖疫苗在预防由培养确认的伤寒方面的效力为55％-77％(Plotkin and Cam.(1995)Arch Intern Med 1552293-99)。脑膜炎球菌C多糖疫苗在流行情况下则显示出79％的效力(De Wals P，et al.(1996)Bull WorldHealth Organ.74407-411)。23价肺炎球菌疫苗的临床效果在0％-81％之间具有很大的差异(Fedson et al.(1994)Arch Intern Med.1542531-2535)。如上所述，一般认为肺炎球菌疫苗的防护效率与接种时诱导出的抗体浓度有或多或少的关系。
用多糖进行接种的方法存在一个问题，即多糖本身为弱免疫原。用来克服这种免疫原性缺陷的策略包括，将多糖与能够协助旁T细胞的高免疫原性大蛋白载体相连接。
目前用来产生多糖免疫原的这些常用高免疫原性载体包括，例如，白喉毒素(DT或CRM197突变体)、破伤风类毒素(TT)、钥孔血兰素(KLH)以及结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)。常用载体的问题
这些常用载体各自都具有许多问题，其中包括产生GMP结合物方面的，也包括这些结合物的免疫学特性方面的。
尽管这些载体被经常使用，并且也成功诱导出抗多糖的抗体应答，但是它们具有一些缺点。举例来说，当预先存在针对该载体，此处为破伤风毒素，的抗体时，抗原特异性免疫应答会被抑制(表位抑制)(Di John et al；(1989)Lancet，21415-8)。而作为惯例，这些疫苗都用于人类的接种，所以在整个群体中，对DT和TT均预先存在免疫力的人占有非常高的比例。例如，在英国有95％的儿童接受DTP疫苗，其中就含有DT和TT。其它作者还描述了动物模型中对肽类疫苗的表位抑制问题(Sad et al，Immunology，1991；74223-227；Schutze et al，J.Immunol.1354，1985；2319-2322)。
此外，对需要定期促升的疫苗而言，使用诸如TT和DT等高免疫原性载体可能会在注射数次后即抑制多糖抗原的应答。多次接种还会伴有不良反应，如迟发型超反应(DTH)。
KLH作为强免疫原已作为IgE肽的载体用于人类的临床试验。但也观测到一些副反应(DTH样反应或IgE致敏)和针对抗体的抗体应答。
因此，在选择载体蛋白用于以多糖为基础的疫苗时，需要在使用可适用于所有患者的载体(广泛MHC识别)的必要性、诱导高水平的抗多糖抗体应答和低水平的抗载体抗体应答之间寻求一种平衡。
因此，以前用于以多糖为基础的疫苗的载体有很多缺点。用在组合疫苗中则尤其明显，此时若将同一种载体用于不同的多糖抗原，则表位抑制问题会特别严重。为了尽量克服这种影响，WO98/51339是在组合疫苗中使用了多种载体。
本发明提供一种新载体，用于制备不具有上述缺点的多糖/基于多糖的免疫原性结合物。
本发明提供一种来源于流感嗜血菌的蛋白D(EP 059461B1)或其片段，作为基于多糖的免疫原性组合物，其中包括疫苗，的载体。该载体特别利于在组合疫苗中使用。发明概述A)肺炎链球菌多糖疫苗
本发明提供一种疫苗组合物，该组合物至少含有一种肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)多糖抗原(优选的为结合的多糖抗原)和一种肺炎链球菌蛋白抗原或其免疫学功能等价物，并选择性地含有一种Th1佐剂(诱导Th1免疫应答的佐剂)。优选的是肺炎球菌蛋白和Th1佐剂均包括。本发明的该组合物特别适用于高龄人的肺炎治疗。
肺炎球菌多糖疫苗(结合的或未结合的)可能无法保护高龄人群不得肺炎，该群体患此疾病的几率非常高。抵抗肺炎球菌的主要防御机制是调理素吞噬作用(通过产生抗肺炎球菌多糖抗体而引发的由体液性B细胞/嗜中性粒细胞介导的事件，最后将细菌吞噬)，但高龄人体内涉及调理素机制的某些部分出现障碍，即PMN(多形核细胞)产生过氧化物、其它类型活性氧的产生、PMN动员、PMN凋亡、PMN的变形性。高龄人体内的抗体应答也会出现障碍。
正常水平的抗荚膜多糖抗体不能有效地完全清除细菌，这与公认的法则正相反，其原因是肺炎球菌能够侵入宿主细胞以躲避免疫系统这一分支途径。
本发明人惊奇地发现，除体液免疫系统这一分支途径(如B细胞介导的免疫)之外再同时刺激细胞介导的免疫系统这一分支途径(如T细胞介导的免疫)可获得一种增效作用(或协同作用)，这种作用能够促进宿主清除肺炎球菌。这一发现有助于预防一般人的肺炎球菌性感染，而对高龄人的肺炎预防而言却至关重要，因为基于多糖的疫苗对他们不具有疗效。
本发明人发现，若将肺炎球菌多糖(优选的为结合的肺炎球菌多糖)与一种肺炎球菌蛋白(优选的为肺炎球菌表面表达的或由其分泌或释放的一种能够在II类和MHC I类环境中加工并呈递到被感染哺乳动物细胞表面的蛋白)一同给药，则两种免疫系统可由此产生协同作用。本发明人还发现，尽管肺炎球菌蛋白本身可触发细胞介导的免疫，但疫苗制剂中Th1诱导佐剂的存在可协助这种免疫系统，并且能够令人惊奇地进一步加强这两种免疫系统之间的协同作用。B)选定的肺炎球菌多糖结合物+3D-MPL组合物
因此，本发明还提供一种抗原组合物，该组合物含有一种或多种肺炎球菌多糖结合物，并且添加有3D-MPL佐剂而基本不含铝型佐剂，其中至少有一种肺炎球菌多糖结合物是在含有3D-MPL的组合物中的免疫原性明显高于在同时含有3D-MPL和铝型佐剂的组合物中的免疫原性。
本发明提供的优选实施方案是含有以下一种或多种肺炎球菌荚膜多糖的结合物的抗原组合物血清型4、6B、18C、19F和23F。这些组合物中的每种多糖都是在只含有3D-MPL的组合物中的免疫原性明显高于在同时含有3D-MPL和一种铝型佐剂的组合物中的免疫原性。
因此，本发明的一项实施方案提供一种抗原组合物，该组合物含有与一种免疫原性蛋白以及3D-MPL佐剂结合的血清型4、6B、18C、19F或23F肺炎链球菌荚膜多糖，其中该组合物基本不含铝型佐剂。
本发明的另一实施方案提供一种基本不含铝型佐剂的组合型抗原组合物，该组合物含有3D-MPL佐剂以及选自血清型4、血清型6B、血清型18C、血清型19F和血清型23F的两种或多种肺炎球菌多糖结合物。C)细菌多糖-蛋白D结合物
因此，本发明提供一种多糖结合物抗原，该抗原含有一种与来自流感嗜血菌(H.influenzae)的蛋白D或其蛋白D片段结合的来源于一种致病菌的多糖抗原。此外，本发明还提供多价疫苗组合物，其中有一种或多种多糖抗原与蛋白D结合。发明详述A)肺炎球菌多糖疫苗
本发明提供一种改进疫苗，特别用来预防或改善高龄人(和/或婴儿与幼儿)的肺炎球菌性感染。
在本发明中，年龄等于或大于55岁的患者被认为是高龄人，典型的则大于60岁，更一般的则大于65岁。
因此，本发明的一项实施方案提供一种适用于高龄人(和/或婴儿与幼儿)的疫苗组合物，该组合物含有至少一种肺炎链球菌多糖抗原和至少一种肺炎链球菌蛋白抗原。
本发明的另一优选的实施方案提供一种疫苗(适用于高龄人的肺炎预防)，该疫苗含有至少一种肺炎链球菌多糖抗原和至少一种肺炎链球菌蛋白抗原以及一种Th1佐剂。
可以认为该疫苗也适用于其它高危人群，如婴儿或幼儿，的肺炎球菌性感染(如中耳炎)的治疗。
本发明的第三实施方案提供一种疫苗组合物，该组合物含有一种肺炎球菌多糖抗原和一种Th1佐剂。本发明的肺炎链球菌多糖抗原
本发明的肺炎链球菌疫苗通常都含有多糖抗原(优选的为结合的多糖抗原)，其中的多糖抗原至少来源于四种血清型的肺炎球菌。优选而言，这四种血清型包括6B、14、19F和23F。更优选的是该组合物中至少含有7种血清型，如来源于血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F。更加优选的是该组合物中至少含有11种血清型，例如一项实施方案中的组合物含有来源于血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的荚膜多糖(优选的为结合的多糖)。尽管本发明也考虑采用，例如，23价的方案(如血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)，但本发明的一项优选实施方案含有的是至少13种多糖抗原(优选的为结合的多糖抗原)。
对高龄人接种(如用来预防肺炎)而言，在上述11价抗原组合物中另加上血清型8和12F(最优选的是再加上15和22)以形成15价疫苗的方案更具优势，而加上6A和19A以形成13价疫苗的方案更利于婴儿或幼儿使用(此时更关注的是中耳炎)。
在预防/改善高龄人群(+55岁)的肺炎和婴儿(18个月以前)与幼儿(通常为18个月-5岁)的中耳炎时，本发明的优选实施方案是将文中所述的多价肺炎链球菌多糖与一种肺炎链球菌蛋白或其免疫学功能等价物相结合。本发明的肺炎球菌蛋白
对本发明而言，“免疫学功能等价物”的定义是一种蛋白的肽，该蛋白至少含有一种来源于本发明所述蛋白的保护性表位。这些表位的特性是暴露在表面，高度保守，并且能够在宿主内引发杀菌性抗体应答或能够避免毒性作用。优选而言，该功能等价物至少具有15个来源于本发明所述蛋白的连续氨基酸，优选的则至少为30个或更多。最优选的是使用该蛋白的片段、诸如跨膜区缺失变异体(即使用蛋白的细胞外区域)等缺失体、融合体、经化学或遗传方法去毒的衍生物等，前提是它们能够引起与天然蛋白基本相同的免疫应答。
本发明的优选蛋白是那些暴露在肺炎球菌外表面(至少在肺炎球菌生活周期的部分时间里能够被宿主的免疫系统识别)的肺炎球菌蛋白，或由肺炎球菌分泌或释放的蛋白。最优选的蛋白则是肺炎链球菌的毒素、粘附素、双组分信号转导蛋白或脂蛋白，或其免疫学功能等价物。
可包含在所述组合疫苗中的特别优选的蛋白包括，但不局限于肺炎球菌溶血素(pneumolysin)(优选的是通过化学处理或突变进行去毒)〔Mitchell et al.Nucleic Acids Res.1990 Jul 11；18(13)4010“来源于1型和2型肺炎链球菌的肺炎球菌溶血素基因及蛋白的比较”，Mitchell et al.Biochim Biophys Acta 1989 Jan23；1007(1)67-72“大肠杆菌中的肺炎球菌溶血素基因表达快速纯化及生物学特性”，WO96/05859(A.Cyanamid)，WO90/06951(Paton et al)，WO99/03884(NAVA)〕；PspA及其跨膜区缺失突变体(US 5804193-Briles et al.)；PspC及其跨膜区缺失突变体(WO97/09994-Briles et al.)；PsaA及其跨膜区缺失突变体(Berry&Paton，Infect Immun 1996 Dec；64(12)5255-62“PsaA，对肺炎链球菌的毒力至关重要的一种37kD假定粘附素，的序列异质性”)；肺炎球菌胆碱结合蛋白及其跨膜区缺失突变体；CbpA及其跨膜区缺失突变体(WO97/41151；WO99/51266)；甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(Infect.Immun.1996 643544)；HSP70(WO96/40928)；PcpA(Sanchez-Beato et al.FEMS Microbiol Lett 1998，164207-14)；M样蛋白，SB专利申请号EP0837130；以及粘附素18627，SB专利申请号EP0834568。
优选而言，本发明使用的蛋白选自肺炎球菌溶血素、PsaA、PspA、PspC、CbpA或这些蛋白中的两种或多种的组合。本发明还包括这些蛋白(如上文所定)的免疫学功能等价物。
组合物内的该蛋白可协助诱导抗肺炎球菌疾病的T细胞介导的应答——这是防护肺炎所特别需要的——这种应答与体液免疫系统相配合可抑制肺炎球菌的侵袭，并且可刺激调理素吞噬作用。
包含有这种蛋白抗原的另一优势在于可向调理素吞噬过程递送更多的抗原，并且可抑制细菌粘附素(若使用粘附素)或使毒素中和(若使用毒素)。
本发明在一项实施方案中提供一种肺炎链球菌疫苗，该肺炎链球菌疫苗含有一种肺炎球菌多糖结合物疫苗，该肺炎球菌多糖结合物疫苗含有来源于至少4种血清型的多糖抗原，优选的为至少7种，更优选的为至少11种，并含有至少一种肺炎链球菌蛋白，而优选的为两种。优选而言，其中有一种蛋白为肺炎球菌溶血素或PsaA或PspA或CbpA(最优选的为去毒的肺炎球菌溶血素)。优选的组合为至少含有肺炎球菌溶血素或其衍生物，以及PspA。
如上文所述，用多糖进行接种的方法存在一个问题，即多糖本身为弱免疫原。为了克服这一点，可将多糖与能够协助旁T细胞(bystander T-cell help)的蛋白载体相连接。因此，优选的是将本发明使用的多糖与这样一种蛋白载体相连接。目前常用来产生多糖免疫原的此类载体包括，例如，白喉类和破伤风类毒素(分别为DT、DTCRM197和TT)、钥孔血兰素(KLH)、来自脑膜炎奈瑟菌的OMPC以及结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)
但这些常用载体各自都存在许多问题(见上文“常用载体的问题”一节)。
本发明在一项优选实施方案中提供一种新载体，用于制备不具有这些缺点的基于多糖的免疫原构建体。用于以肺炎球菌多糖为基础的免疫原组合物(或疫苗)的优选载体为流感嗜血菌蛋白D或其片段(EP594610-B)。适于使用的片段包括含有辅助T细胞表位的片段。特别地，蛋白D的片段优选地应含有该蛋白N端1/3的部分。
用于肺炎球菌多糖的另一优选载体为肺炎球菌蛋白本身(如上文“本发明的肺炎球菌蛋白”一节所定)。
本发明的疫苗优选地应被佐剂化。适当的佐剂包括一种铝盐，如氢氧化铝胶体(明矾)或磷酸铝，但也可以是一种钙盐、铁盐或锌盐，或是酰化酪氨酸，或酰化糖的不溶悬浮物、多糖的阳离子或阴离子衍生物、或聚磷腈。
优选而言，所选佐剂应该是TH1型应答的一种优选诱导剂，以协助细胞介导的免疫应答。本发明的TH1佐剂
高水平的Th1型细胞因子利于诱导出对给定抗原的细胞介导的免疫应答，而高水平的Th2型细胞因子利于诱导出对抗原的体液免疫应答。
重要的是应记住，Th1型与Th2型免疫应答的差异并不是绝对的。实际上我们把个体所维持的免疫应答描述成Th1占优势或Th2占优势。但通常可依据Mosmann和Coffman对鼠CD4+ve T细胞克隆的描述来方便地对细胞因子家族进行研究(Mosmann，T.R.and Coffman，R.L.(1989)TH1与TH2细胞不同的淋巴因子分泌方式导致不同的功能特性。Annual Review of Immunology，7，p145-173)。通常Th1型应答与T淋巴细胞产生的INF-γ和IL-2有关。常与诱导Th1型免疫应答直接相关的其它细胞因子，如IL-12，则不由T细胞产生。相比之下，Th2型应答与IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌有关。可促进Th1占优势的应答的适当佐剂包括单磷酰脂A或其衍生物，特别是3-脱-O-酰基单磷酰脂A，以及单磷酰脂A，优选的是3-脱-O-酰基单磷酰脂A(3D-MPL)与一种铝盐的组合物。
一种改进系统涉及单磷酰脂A与一种皂甙衍生物的组合，特别是WO94/00153中公开的QS21与3D-MPL的组合，或是按WO96/33739的公开方法用胆固醇将QS21淬灭从而反应原性较弱的一种组合物。
WO95/17210描述了一种特别有效的佐剂配方，该配方涉及将QS21、3D-MPL和生育酚加到一种水包油型乳剂中，该配方是优选的配方。
优选而言，疫苗中可另含有一种皂甙，更优选的则为QS21。该配方还可包含一种水包油型乳剂和生育酚(WO95/17210)。
本发明还提供一种方法，用于产生一种疫苗制剂，该方法包括将本发明的一种蛋白与一种药学容许的赋形剂，如3D-MPL，相混合。
含有寡核苷酸的非甲基化CpG(WO96/02555)也是适用于本发明的优选TH1应答诱导剂。
本发明的特别优选组合物含有一种或多种结合的肺炎球菌多糖、一种或多种肺炎球菌蛋白和一种Th 1佐剂。使用该Th1佐剂有助于通过肺炎球菌蛋白(如上文所述)来诱导细胞介导的应答，并有助于两种免疫系统之间的协同，从而可获得一种特别有效的疫苗，来对抗一般人的肺炎球菌性疾病，更重要的是可对抗高龄人的肺炎球菌性肺炎。
另一方面，本发明提供如文中所述的一种免疫原或疫苗，用来在医学中使用。
再一方面，本发明提供一种含有肺炎球菌多糖结合物和Th1佐剂(优选的为3D-MPL)的组合物，该组合物可在无应答群体中引发血清转化或诱导出抗多糖抗原的体液抗体应答。
已知有10-30％的人对多糖免疫法不产生应答(对疫苗中50％以上的血清型不产生应答)(Konradsen et al.，Scand.J.Immun 40251(1994)；Rodriguez et al.，JID，1731347(1996))。使用结合物疫苗也是如此(Musher et al.Clin.Inf.Dis.271487(1998))。对高危人群(婴儿、幼儿和高龄人)则特别严重。
本发明人惊奇地发现，将结合的肺炎球菌多糖(易于在特定群体中产生低应答)与一种Th1佐剂(见上文“本发明的Th1佐剂”)结合使用可克服这种无应答性。优选的是使用3D-MPL，最优选的是使用不含铝型佐剂的3D-MPL(这样可获得更好的应答)。因此，本发明提供这些组合物，并进一步提供一种方法，用于治疗对肺炎球菌多糖不产生应答的个体，方法是将这些组合物给药，同时还提供Th1佐剂在含有结合的肺炎球菌多糖抗原的药物生产中的应用，以及在针对(或防护)多糖抗原无应答性个体的肺炎球菌性疾病的治疗中的应用。
本发明在一项实施方案中提供一种方法，用来预防或改善高龄人的肺炎，该方法包括将安全并且有效剂量的文中所述疫苗向所述高龄患者给药，该疫苗含有一种肺炎链球菌多糖抗原，并含有一种Th1佐剂或一种肺炎球菌蛋白(优选的是两者都包含)。
本发明在另一项实施方案中提供一种方法，用来预防或改善婴儿或幼儿的中耳炎，该方法包括将安全并且有效剂量的一种疫苗向所述婴儿或幼儿给药，该疫苗含有一种肺炎链球菌多糖抗原，并含有一种肺炎链球菌蛋白抗原或一种Th1佐剂(优选的是两者都包含)。
在本发明的上述方法中，优选的是以多糖蛋白结合物形式提供所述多糖抗原。本发明的疫苗制剂
本发明的疫苗制剂可用来保护或治疗易感染哺乳动物，方法是将所述疫苗经全身或粘膜途径给药。这些给药方法包括肌内注射、腹腔内注射、皮内注射或静脉内注射；或经粘膜向口腔/消化道、呼吸道、泌尿生殖道给药。用于治疗肺炎或中耳炎的优选方法是将疫苗进行鼻内给药(因为可更有效地预防肺炎球菌经鼻咽运输，从而在其最早阶段使感染减弱)。
每剂疫苗中的结合抗原量可选择在典型疫苗中能够引发免疫保护性应答但不造成明显副作用的量。其数值将根据所用特定免疫原及其呈递方法的不同而有所不同。一般认为每剂应含有0.1-100μg多糖，优选的为0.1-50μg，更优选的为0.1-10μg，最优选的为1-5μg。
疫苗中的蛋白抗原含量通常为1-100μg，优选的为5-50μg，最优选的通常为5-25μg。
特定疫苗的最佳组分含量可通过标准研究方法来加以确定，该方法涉及对主体的适当免疫应答进行观测。在初次接种后，主体可接受一次或数次间隔时间适当的促升免疫。
在《疫苗设计》中对疫苗的制备方法进行了综合论述(“亚基及佐剂方法”(eds Powell M.F.&Newman M.J.)(1995)Plenum PressNew York)。Fullerton的美国专利4,235,877则描述了封装在脂质体中的方法。B)选定的肺炎球菌多糖结合物+3D-MPL组合物
对本发明而言，术语“本发明的肺炎球菌多糖结合物”是指那些在只含有3D-MPL的组合物中的免疫原性高于在同时含有3D-MPL和一种铝型佐剂的组合物中的免疫原性的肺炎链球菌荚膜多糖结合物(如血清型4的结合物、血清型6B的结合物、血清型18C的结合物、血清型19F的结合物或血清型23F的结合物)。
对本发明而言，术语“基本不含铝型佐剂”是指组合物中不含有足以使本发明的肺炎球菌多糖结合物在免疫原性方面低于只含有3D-MPL而不加铝型佐剂的相同组合物的铝型佐剂(如氢氧化铝，特别是磷酸铝)。优选的抗原组合物所包含的佐剂应基本上为3D-MPL。优选而言，每剂量中添加的铝型佐剂的量应少于50μg，更优选的是少于30μg，更加优选的是少于10μg，而最优选的是本发明的抗原组合物中不添加任何铝型佐剂。
对本发明而言，应按实施例2所述来确定是否肺炎球菌多糖结合物在只含有3D-MPL的组合物中的免疫原性明显高于在同时含有3D-MPL和一种铝型佐剂的组合物中的免疫原性。作为只含有3D-MPL的组合物的免疫原性是否明显更高的指征，只含有3D-MPL的组合物与同时含有3D-MPL和一种铝型佐剂的组合物的GMC IgG浓度比应大于2，优选的为大于5，更优选的为大于7，更加优选的为大于9，而最优选的是大于14。
在与多糖接种方法有关的问题中，有一个问题是多糖本身为弱免疫原。用来克服这种免疫原性缺陷的策略包括，将多糖与能够协助旁T细胞的大蛋白载体相连接(结合)。优选的是将本发明的肺炎球菌多糖与一种可协助旁T细胞的蛋白载体相连接。可使用的此类载体包括，例如，白喉毒素、白喉毒素突变体及破伤风类毒素(分别为DT、CRM197和TT)、钥孔血兰素(KLH)、结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)以及脑膜炎奈瑟菌的OMPC。
最优选的是将流感嗜血菌的蛋白D(EP0594610-B)或其片段(见C小节)作为该免疫原性蛋白载体用于本发明的肺炎球菌多糖。
在一项实施方案中，本发明的抗原组合物含有与一种免疫原性蛋白相结合的肺炎球菌多糖血清型(PS)4，并且用3D-MPL佐剂配制，其中该组合物基本不含铝型佐剂。其它实施方案中的抗原组合物则分别含有与一种免疫原性蛋白相结合的PS 6B、18C、19F或23F，并且用3D-MPL佐剂配制，其中该组合物基本不含铝型佐剂。
本发明在另一项实施方案中提供一种组合型抗原组合物，该组合物含有两种或多种肺炎球菌多糖结合物，并且用3D-MPL佐剂配制，这些结合物选自PS 4、PS 6B、PS 18C、PS 19F和PS 23F，其中该组合物基本不含铝型佐剂。
加入其它肺炎球菌多糖结合物不会明显影响本发明所述肺炎球菌多糖结合物的免疫原性(实施例3)。因此，作为优选方式，本发明提供一种组合型抗原组合物，该组合物同时含有一种或多种本发明的肺炎球菌多糖结合物和一种或多种其它肺炎球菌多糖结合物，其中该组合物用3D-MPL佐剂配制，并且基本不含铝型佐剂。
本发明在另一优选实施方案中提供组合型抗原组合物，这些组合物至少含有PS 4、6B、18C、19F或23F肺炎球菌多糖结合物中的一种，优选的则含有其中的2种、3种、4种或所有5种，此外还含有任意组合的其它肺炎球菌多糖结合物，这些组合物均用3D-MPL佐剂配制，但基本不含铝型佐剂。
本发明的组合型肺炎链球菌抗原组合物通常都含有多糖结合物抗原，其中的多糖至少来源于4种、7种、11种、13种、15种或23种血清型(见上文“本发明的肺炎链球菌多糖抗原”，其优选的血清型组合方式取决于要治疗的疾病)。
优选地，可将本发明的抗原组合物作为疫苗组合物用于肺炎球菌性感染的预防(或治疗)，特别是用于高龄人以及婴儿和幼儿。
本发明的其它实施方案包括提供上述抗原组合物用于医学领域；一种方法，用来诱导对肺炎链球菌荚膜多糖结合物的免疫应答，该方法包括将安全并且有效剂量的上述抗原组合物之一向患者给药的步骤；以及上述抗原组合物之一在用于预防(或治疗)肺炎球菌性疾病的药物生产中的应用。
在预防/改善高龄人群(+55岁)的肺炎和婴儿(18个月以前)与幼儿(通常为18个月-5岁)的中耳炎时，本发明的另一优选实施方案是将按文中所述方法制备的多价肺炎链球菌多糖结合物与一种肺炎链球菌蛋白或其免疫学功能等价物相结合。优选的蛋白/蛋白组合可参考上文“本发明的肺炎球菌蛋白”一节。
若不立即使用，优选的是将上文所述抗原组合物(和疫苗)冻干，并可在使用前以稀释剂将其即时重构。更优选的是在3D-MPL存在的情况下将其冻干，并用盐溶液即时重构。
将组合物冻干可使其更加稳定(例如可避免多糖抗原分解)。令人惊奇的是，该方法还可以使抗体对肺炎球菌多糖的效价更高。对PS6B结合物而言，这种现象特别明显。因此，本发明的另一形式是一种冻干的抗原组合物，该组合物含有PS 6B结合物，并用3D-MPL佐剂配制且基本不含铝型佐剂。
疫苗的制备可参考上文“本发明的疫苗制剂”一节。C)细菌多糖-蛋白D结合物
倾向于使用组合疫苗的优势有，减少对赋形剂的不适、便于安排进度，以及确保严格管理的完成；但也会伴随有疫苗效率降低的危险(见上文有关过度使用载体蛋白导致表位抑制的论述)。因此，有益的是应该制定能够满足某个群体的需要并且其组分间不表现出免疫原性干扰的疫苗组合方式。这些优势可通过本发明的免疫原性组合物(或疫苗)来实现，它们特别有利于将组合型疫苗向婴儿、幼儿或高龄人等高危人群给药。
本发明提供一种流感嗜血菌蛋白D或其片段，以作为载体用于以多糖为基础的免疫原性组合物，其中包括疫苗。适于使用的片段包括含有辅助T细胞表位的片段。特别地，蛋白D的片段优选地应含有该蛋白N端1/3的部分。
蛋白D是来源于流感嗜血菌的一种IgD结合蛋白(EP 0594610B1)，它是一种潜在的免疫原。
本发明考虑的与蛋白D结合的多糖包括，但不局限于，抗伤寒沙门菌的Vi多糖抗原、脑膜炎球菌多糖(包括A型、C型、W135型和Y型，以及B类脑膜炎球菌多糖和修饰多糖)、来自金黄色葡萄球菌的多糖、来自无乳链球菌的多糖、来自肺炎链球菌的多糖、来自诸如结核分支杆菌等分支杆菌的多糖(如甘露糖磷酸肌醇海藻糖、分支菌酸、带甘露糖帽的阿拉伯甘露聚糖、其荚膜以及阿拉伯半乳聚糖)、来自新生隐球菌的多糖、未分类流感嗜血菌的脂多糖、来自流感嗜血菌b的荚膜多糖、粘膜炎莫拉菌的脂多糖、宋内志贺菌的脂多糖、克氏锥虫的脂肽磷酸聚糖(LPPG)、与癌症相关的神经节苷脂GD3、GD2、与肿瘤相关的粘蛋白，特别是T-F抗原和唾液酸T-F抗原，以及结构上与T-F抗原有关的HIV相关多糖。
多糖与载体蛋白的连接可采用任何已知的方法(如Likhite的美国专利4,372,945以及Armor等人的美国专利4,474,757的方法)。优选的是采用CDAP结合法(WO95/08348)。
在CDAP方法中，优选的是使用氰化剂1-氰基-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(CDAP)来合成多糖-蛋白结合物。这种氰化剂可在相对温和的条件下发挥作用，从而可避免碱敏感性多糖的水解。该合成方法可用于与载体蛋白的直接结合。
将多糖增溶于水或盐溶液。将CDAP溶于乙腈，并立即加到多糖溶液中。CDAP能够与多糖的羟基反应，从而形成一种氰基酯。在该活化步骤之后加入载体蛋白。赖氨酸的氨基能够与活化的多糖反应，从而形成一种异脲共价连接。
在该结合反应之后，再加入大大过量的甘氨酸以淬灭剩余的活化官能团。然后将产物进行凝胶渗透层析以去除未反应的载体蛋白及残留试剂。因此，本发明提供一种方法，用来产生多糖蛋白D结合物，该方法包括将多糖活化并将多糖与蛋白D连接的步骤。
本发明在一项优选实施方案中提供一种免疫原性组合物(或疫苗)制剂，用来预防肺炎链球菌感染。
肺炎球菌向肺、脑脊液和血液扩散的机制还不是很清楚。细菌生长向正常肺泡的延伸可被其相对干燥的环境以及肺泡巨噬细胞的吞噬活性所抑制。这些相互协调的防御若出现任何组织上或生理上的变化，都会导致肺对感染的易感性增加。肺炎链球菌的细胞壁在肺泡炎性反应的产生过程中具有重要作用(Gillespie et al.(1997)I&I653936)。
本发明的肺炎链球菌疫苗一般都含有蛋白D多糖结合物，其中的多糖至少来源于4种、7种、11种、13种、15种或23种血清型。优选的血清型组合可参考上文“本发明的肺炎链球菌多糖抗原”，这些组合方式取决于要治疗的疾病。
本发明在另一实施方案中提供一种脑膜炎奈瑟菌疫苗；特别是来源于血清型A、B、C、W-135和Y的疫苗。脑膜炎奈瑟菌是细菌性脑膜炎的最重要病因之一。这些细菌的糖类荚膜可作为其毒力的决定因素，并且可充当保护性抗体的作用对象。但众所周知的是，糖类在幼龄儿童体内是一种弱免疫原。本发明提供一种特别适用于这些多糖的蛋白载体，蛋白D，它可提供能够激活T细胞应答的T细胞表位，从而有助于多糖抗原特异性B细胞的增殖和成熟，并有助于诱导免疫记忆。
本发明在一项可选实施方案中提供一种流感嗜血菌b荚膜多糖(PRP)-蛋白D结合物。
本发明还考虑了能够防护一系列不同病原体的组合型疫苗。令人惊奇的是，蛋白D载体可以作为结合有多种多糖抗原的组合型疫苗的有效载体。如上所述，若各种多糖都使用相同的载体，则可能引发表位抑制。WO98/51339提供了一些组合物，试图将这种干扰减至最小，方法是将组合物中一定比例的多糖结合在DT上，其余的则结合在TT上。
本发明人惊奇地发现，蛋白D特别适于在组合型疫苗中将此类表位抑制效应减至最小。将组合物中的一种或多种多糖结合在蛋白D上是有益的，优选的则是将此类组合型疫苗中的所有抗原均结合在蛋白D上。
优选的组合物包括可防护脑膜炎奈瑟菌C和Y(优选的则还有A)感染的一种疫苗，其中来源于血清型Y和C(最优选的则还有A)之一种或多种的多糖抗原均连接于蛋白D。
基于流感嗜血菌多糖的疫苗(优选的是与TT、DT或CRM197结合的PRP，或最优选的是与蛋白D结合的PRP)可用上述组合型疫苗来配制。
目前，有许多小儿用疫苗是以组合型疫苗形式提供的，这样可减少儿童必须接受的注射次数。因此，当作为小儿用疫苗时，可用本发明的疫苗来配制其它抗原。举例来说，可使用众所周知的含有白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)以及百日咳组分〔通常为去毒的百日咳类毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)以及可选的pertactin(PRN)和/或凝集素1+2〕的“三价”组合疫苗，如含有DT、TT、PT、FHA和PRN抗原的商品化疫苗INFANRIX-DTPaTM(SmithKlineBeechamBiologicals)，或全细胞百日咳组分，如SmithKlineBeechamBiologicals s.a.的商品化TritanrixTM，来配制本发明的疫苗，或是同时独立给药。组合的疫苗还可含有其它抗原，如乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、脊髓灰质炎病毒抗原(如灭活的三价脊髓灰质炎病毒——IPV)、粘膜炎莫拉菌外膜蛋白、未分类流感嗜血菌蛋白、脑膜炎奈瑟菌B外膜蛋白。
可包含在组合型疫苗(特别是用来预防中耳炎的)中的粘膜炎莫拉菌蛋白抗原的实例有OMP106〔WO97/41731(Antex)&WO96/34960(PMC)〕；OMP21；LbpA&LbpB〔WO98/55606(PMC)〕；TbpA&TbpB〔WO97/13785&WO97/32980(PMC)〕；CopB〔Helminen ME.et al.(1993)Infect.Immun.612003-2010〕；UspA1/2〔WO93/03761(University of Texas)〕；和OmpCD。可包含在组合型疫苗(特别是用来预防中耳炎的)中的未分类流感嗜血菌抗原的实例有丝束蛋白〔(US 5766608-Ohio State Research Foundation)〕及含有来自丝束蛋白肽的融合体〔如LB1(f)肽融合体；US 5843464(OSU)或WO99/64067〕；OMP26〔WO97/01638(Cortecs)〕；P6〔EP 281673(State University of New York)〕；TbpA和TbpB；Hia；Hmw1，2；Hap；以及D15。
本发明考虑的优选小儿用疫苗有a)脑膜炎奈瑟菌C多糖结合物和流感嗜血菌b多糖结合物，以及 可选的脑膜炎奈瑟菌A和/或Y多糖结合物，条件是至少有一种多 糖抗原，优选的是所有多糖抗原，与蛋白D相结合。b)含有DT、TT、百日咳组分(优选的含有PT、FHA和PRN)、乙 型肝炎表面抗原以及IPV(灭活的三价脊髓灰质炎病毒疫苗)的疫 苗a)。c)与蛋白D结合的肺炎链球菌多糖抗原。d)含有来源于粘膜炎莫拉菌和/或未分类流感嗜血菌的一种或多 种抗原的疫苗c)。
加入蛋白D作为载体对以上所有组合型疫苗均有利。很明显，组合型疫苗中包含的载体种类越多(例如为了克服表位抑制)，最终疫苗就越昂贵并且越复杂。因此，将组合型疫苗的所有或大多数多糖抗原结合在蛋白D上可带来相当大的利益。
在预防高龄人群(+55岁)的肺炎和婴儿或幼儿的中耳炎时，本发明的优选实施方案是将文中所述的多价肺炎链球菌多糖-蛋白D抗原与一种肺炎链球菌蛋白或其免疫学功能等价物相结合。关于这种组合物可包含的优选蛋白/蛋白组合物，可参考上文“本发明的肺炎球菌蛋白”一节。
因此，本发明提供一种免疫原性组合物，该组合物含有一种肺炎链球菌多糖-蛋白D结合物以及一种肺炎链球菌蛋白抗原。
优选的是在本发明的疫苗制剂中将本发明的多糖-蛋白D结合物抗原佐剂化。适当的佐剂包括铝盐，如氢氧化铝胶体(明矾)或磷酸铝，但也可以是钙盐、铁盐或锌盐，或是酰化酪氨酸的不溶悬浮物，或酰化糖、多糖的阳离子或阴离子衍生物，或聚磷腈。
对用于高龄人的疫苗而言，优选的是所选佐剂可作为TH1型应答的优选诱导剂。
关于特定的Th1佐剂可参考上文“本发明的Th1佐剂”。
另一方面，本发明提供如文中所述的一种免疫原或疫苗，用来在医学中使用。
关于结合物疫苗的制备/给药方法，可参考上文“本发明的疫苗制剂”。
在抗中耳炎的疫苗中使用蛋白D也同样有利，因为蛋白D本身是一种免疫原，可产生B细胞介导的抗未分类流感嗜血菌(ntHi)防护作用。ntHi可侵入宿主细胞，并躲避由蛋白抗原诱导的B细胞介导的效应。本发明人惊奇地发现，有一种方法可提高蛋白D作为抗原(无论是单独使用还是作为多糖的载体)用于中耳炎疫苗的有效性。方法是将蛋白D佐剂化，使其能够在受试者体内诱导一种强Th1应答，这样就可以优化针对蛋白D的细胞介导的免疫系统。令人惊奇的是，使用含有蛋白D和一种Th1佐剂(优选的为3D-MPL)的冻干组合物即可实现这一点，该组合物可在给药前即时重构。因此，本发明还提供此类组合物、一种制备此类组合物的方法(方法是将含有蛋白D和一种Th1佐剂的混合物冻干)以及该组合物在中耳炎种类中的应用。
从更广泛的意义上来看，本发明人认为，在Th1佐剂(见“本发明的Th1佐剂”)，优选的为3D-MPL，存在的情况下将免疫原冻干通常都会提高对该免疫原的Th1免疫应答。因此，本发明适用于任何需要针对其产生强Th1免疫应答的免疫原。这些免疫原包括细菌性、病毒性和肿瘤性蛋白抗原，也包括这些蛋白本身及其肽。实施例
这些实施例可对本发明进行说明，但并不限制本发明。实施例1肺炎链球菌荚膜多糖
候选的11价疫苗含有血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F荚膜多糖，其制备基本如EP 72513所述。利用CDAP化学物(WO95/08348)将每种多糖活化和派生，并与蛋白载体相结合。除血清型3(减小尺寸以降低其粘度)之外，所有多糖都以其天然形式结合。蛋白载体
所选蛋白载体为来源于未分类流感嗜血菌但在大肠杆菌中表达的重组蛋白D。蛋白D的表达流感嗜血菌用于蛋白D表达的基因构建原材料蛋白D编码DNA
蛋白D在所有血清型以及未分类的流感嗜血菌中都高度保守。含有整个蛋白D基因编码DNA序列的载体pHIC348由A.Forsgren博士，Department of Medical Microbiology，University of Lund，Malm? General Hospital，Malm?，Sweden提供。蛋白D的DNA序列由Janson et al.(1991)Infect.Immun.59119-125发表。表达载体pMG1
表达载体pMG1派生于pBR322(Gross et al.，1985)，其中引入了衍生于噬菌体λ的调控因子，该调控因子用于调控插入的外源基因的转录和翻译(Shatzman et al.，1983)。此外，氨苄青霉素抗性基因被替换成了卡那霉素抗性基因。大肠杆菌菌株AR58
用预先在SA500派生菌(galE∷TN10，LambdaKil cI857 ΔH1)中生长的P1噬菌体原种转导N99即获得大肠杆菌菌株AR58。N99和SA500属于大肠杆菌K12菌株，由National Institute of Health的Martin Rosenberg博士的实验室提供。表达载体pMG1
产生蛋白D时，将编码该蛋白的DNA克隆到表达载体pMG1中。该质粒使用λ噬菌体DNA的信号来推动外源插入基因的转录和翻译。该载体含有启动子PL、操纵子OL和2种可用位点(NutL和NutR)，从而当N蛋白存在时可缓解转录极性效应(Gross et al.，1985)。将含有PL启动子的载体引入一种大肠杆菌溶原性宿主，以保持质粒DNA的稳定。溶原性宿主菌株含有整合到基因组中的复制缺陷型λ噬菌体DNA(Shatzman et al.，1983)。染色体中的λ噬菌体DNA可指导cI阻抑物蛋白的合成，该蛋白能够与载体的OL阻抑物结合，从而避免插入基因通过RNA聚合酶与PL启动子结合而转录。表达菌株AR58的cI基因含有一种温度敏感性突变，因而可通过温度变化来调控PL指导的转录，即提高培养温度可使阻抑物失活，从而开始合成外源蛋白。该表达系统可实现外源蛋白，特别是对细胞有毒性的外源蛋白，的受控合成(Shimataka&Rosenberg)。大肠杆菌菌株AR58
用来产生蛋白D载体的AR58溶原性大肠杆菌菌株派生于标准的NIH大肠杆菌K12菌株N99(F-su-galK2，lacZ-thr-)。它含有缺陷型溶原性λ噬菌体(galE∷TN10，LambdaKil-cI857ΔH1)。Kil表型可防止宿主停止合成大分子。cI857突变可使cI阻抑物具有一种对温度敏感的损伤。ΔH1缺失可去除λ噬菌体的右侧操纵子以及宿主的bio、uvr3和chlA基因位点。用预先在SA500派生菌(galE∷TN10，LambdaKil-cI857ΔH1)中生长的P1噬菌体原种转导N99即获得大肠杆菌菌株AR58。由于galE基因附近存在编码四环素抗性的TN10转座子，因而可利用四环素对缺陷型溶菌原向N99的转导情况进行筛选。载体pMGMDPPrD的构建
pMGMDPPrD的构建使用的是含有流感病毒S1非结构蛋白编码基因的pMG1载体(pMGNSI)。利用在5’和3’端分别含有NcoI与XbaI限制位点的PCR引物经PCR由pHI C348载体(Janson et al.1991)扩增出蛋白D基因。然后将NcoI/XbaI片段引入到pMGNSI的NcoI与XbaI之间，这样就创建了一种在PD蛋白前含有NS1蛋白N端81个氨基酸的融合蛋白。该载体记为pMGNS1PrD。
在上述构建体的基础上产生用于蛋白D表达的最终构建体。从pMGNS1PrD中去除BamHI/BamHI片段。该DNA水解反应可去除NS1编码区而只保留其N端的前3个残基。将载体重新连接，即产生了一种可编码具有以下N端氨基酸序列的融合蛋白的基因-----MDP SSHSSNMANT-----NS1 蛋白D
蛋白D不含有导肽或通常连接有脂链的N端半胱氨酸。因此，该蛋白不会被分泌到周质中，也不会被脂化，而是以可溶形式保留在细胞质中。
通过37℃热休克将最终构建体pMG-MDPPrD引入到AR58宿主菌中。在卡那霉素存在的情况下筛选含有质粒的细菌。用选定的核酸内切酶消化分离的质粒DNA，因此来证明蛋白D编码DNA插入序列的存在。重组的大肠杆菌菌株称为ECD4。
在λPL启动子/OL操纵子的调控下表达蛋白D。宿主菌AR58的基因组中含有温度敏感性cI基因，它在低温下可通过与OL结合来阻碍由λPL起始的表达。一旦温度提高，OL即释放cI，从而使蛋白D能够表达。当发酵结束后，可将细胞浓缩并冷冻。
如下所述由收集的细胞抽提并纯化蛋白D。将冷冻的细胞培养物沉淀融解，并重悬于细胞裂解液(柠檬酸缓冲液pH6.0)，使最终OD650＝60。使该悬浮液两次流经P＝1000bar的高压匀浆仪。通过离心澄清细胞培养物匀浆，并过滤去除细胞碎片。第一次纯化步骤是将过滤的溶菌产物上样于阳离子交换层析柱(SP Sepharose Fast Flow)。PD可通过离子交换与凝胶基质结合，并可通过增加洗脱缓冲液的离子强度而将其洗脱。
第二次纯化步骤可使杂质保留在阴离子交换基质上(Q SepharoseFast Flow)。PD不与该凝胶结合，从而可收集在流出物中。
两次柱层析步骤均利用OD来监测分部收集物。将阴离子交换层析柱的流出物超滤浓缩，其中含有纯化的蛋白D。
最后，使含有蛋白D的超滤滞留物流经0.2μm滤膜。化学反应活化及偶联化学反应
每种多糖有特定的活化及偶联条件。这些条件列于表1。将天然多糖(PS3除外)溶于2M NaCl或水以用于注射。评定所有血清型的最佳多糖浓度。
将溶于乙腈的100mg/ml CDAP储液加到多糖溶液中(CDAP/PS比率为0.75mg/mg PS)。1.5分钟后加入0.2M三乙胺以获得特定的活化pH值。在该pH及25℃条件下将多糖活化2分钟。将蛋白D(数量取决于最初的PS/PD比率)加到活化的多糖中，并使偶联反应在特定pH下持续1小时。然后在25℃下用甘氨酸将反应淬灭30分钟，再4℃过夜。
通过凝胶过滤将结合物纯化，过滤使用的是0.2M NaCl平衡的Sephacryl 500HR凝胶过滤柱。
测定洗脱组分的糖类及蛋白含量。将结合物合并，再用0.22μm除菌膜过滤除菌。测定该结合物制剂的PS/蛋白比率。性质鉴定
鉴定各结合物的性质，其结果符合表2所述的详细说明。多糖含量(μg/ml)的测定采用间苯二酚测定法，蛋白含量(μg/ml)的测定采用Lowry测定法。由浓度的比值确定最终的PS/PD比率(w/w)。残留DMAP含量(ng/μg PS)
用CDAP活化多糖可将氰基引入多糖，并且释放出DMAP(4-二甲氨基-吡啶)。利用SB开发的特定测试法确定残留的DMAP含量。游离多糖含量(％)
将4℃保存或37℃储存7天的结合物与α-PD抗体保温，再用硫酸铵饱和，然后离心，最后测量上清液中的游离多糖含量。
利用α-PS/α-PS ELISA方法测定上清液中游离多糖的含量。另外还利用α-PD/α-PS ELISA方法测量结合物空白对照。降低游离多糖的量可获得改进的结合物疫苗。抗原性
利用夹心式ELISA方法分析上述结合物的抗原性，其中捕获抗体和检测抗体分别为α-PS和α-PD。游离蛋白含量(％)
通过用SDS处理样品的方法测定“游离的”残留蛋白D的水平。在100℃及存在0.1％SDS的条件下将结合物加热10分钟，然后上样于SEC-HPLC凝胶过滤柱(TSK 3000-PWXL)。由于蛋白D为二聚体，所以用SDS将该结构解离的方法可能会使“游离”蛋白D的水平被过高估计。分子大小(Kav)
在SEC-HPLC凝胶过滤柱(TSK 5000-PWXL)上测定分子大小。稳定性
在HPLC-SEC凝胶过滤柱(TSK 6000-PWXL)上测量4℃保存或37℃储存7天的结合物的稳定性。
表2给出11价疫苗的特性。
可将蛋白结合物吸附在磷酸铝上，然后合并，成为最终的疫苗。结论
由此即产生了免疫原性结合物，后来发现，该结合物可作为一种颇有前途的疫苗的成分。针对每种11价疫苗都找到了获得高品质的最终肺炎球菌多糖结合物的优化CDAP条件。因此，由上述改进(优化)的CDAP方法获得的这些肺炎球菌多糖结合物(与所用载体蛋白无关，但优选的为蛋白D)可作为本发明的另一方面。实施例2-改进的佐剂对11价肺炎球菌PS-PD结合物疫苗在未成年大鼠中的免疫原性影响的研究
用11价肺炎球菌PS-PD结合物疫苗免疫未成年大鼠，剂量为每种多糖(按实施例1的方法制备)0.1μg，并且使用以下佐剂配方无佐剂、AlPO4、3D-MPL、吸附在AlPO4上的3D-MPL。
在11种抗原中，只含有3D-MPL的剂型比其它剂型在统计学上更具免疫原性(最高的GMC IgG)的有5种。使用高浓度和低浓度3D-MPL时均是如此。
调理素吞噬作用也支持该GMC结果。材料与方法免疫方案
将不同母鼠随机繁殖的7天龄未成年OFA大鼠进行首次免疫。并在14和28天后再进行2次免疫。第56天(III级免疫后第28天)时取血。所有疫苗均为皮下注射，每组疫苗免疫10只大鼠。
用含有结合在蛋白D上的下列血清型多糖的11价肺炎球菌结合物疫苗免疫大鼠1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F。配制方法
为检测不同改进佐剂的效果，将每种多糖结合物的剂量保持在0.1μg不变，并用AlPO4和3D-MPL佐剂以不同剂量和组合形式进行配制，其中包括不加任何佐剂。其结果以数值形式列于表3，以供参考。吸附在AlPO4上
被吸附的浓缩单价疫苗的制备方法如下。将50μg AlPO4(pH5.1)与5μg结合物多糖混合。2小时后将其pH调至pH5.1，然后再放置16小时。添加1500mM NaCl，使盐浓度最终为150mM。5分钟后，添加5mg/ml的2-苯氧乙醇。放置30分钟，再将pH调至6.1，然后于4℃放置3天以上。稀释剂的制备
在NaCl 150mM/5mg/ml苯氧乙醇中制备3种稀释剂
A1mg/ml AlPO4
B浓度分别为250和1000μg/ml的吸附在AlPO4上的3D-MPL，3D-MPL/AlPO4的重量比＝5/20。
C浓度分别为561和1000μg/ml的吸附在AlPO4上的3D-MPL，3D-MPL/AlPO4的重量比＝50/89。被吸附的11价疫苗的制备
将11种被吸附的浓缩PS-PD单价疫苗以适当比例混合。按稀释剂A补加AlPO4。当需要加3D-MPL时，则以水溶液形式(未吸附形式，见下文的方法1)或按稀释剂B或C(2倍剂量的吸附在AlPO4上的3D-MPL，见下文的方法2)添加。方法1
将3D-MPL以水性悬浮液形式添加到被吸附的组合型结合物中。室温下将其与11价疫苗混合10分钟，并在给药前保存于4℃。方法2
将3D-MPL预先吸附在AlPO4上，然后添加到被吸附的组合型结合物中(稀释剂B和C)。室温下将3D-MPL的水性悬浮液(250或561μg)与1mg溶于150mM NaCl pH6.3的AlPO4混合5分钟，制成1ml稀释剂。用NaCl pH6.1/苯氧乙醇稀释该溶液，再4℃保温过夜。未被吸附的11价疫苗的制备
将11种PS-PD结合物混合，并以适当比例稀释于150mM NaClpH6.1，苯氧乙醇。当需要加3D-MPL时，则以溶液形式(未吸附形式)添加。
用于注射的所有制剂都是在首次给药前第18天时制备。ELISA
测量大鼠IgG的ELISA方法采用的是WHO Workshop的方案，该ELISA方法可用来测定人类血清中的抗肺炎链球菌荚膜多糖IgG抗体含量。从本质上说，是用纯化的荚膜多糖直接包被微量滴定板。将血清样品与所有肺炎球菌共有的细胞壁多糖(C物质)预保温，该细胞壁多糖在按照公开内容(EP 72513 B1)纯化的肺炎球菌多糖中约占0.5％。然后利用Jackson ImmunoLaboratories Inc.试剂检测结合的鼠IgG。根据内标物(单克隆抗体)的逻辑对数方程模型绘制效价曲线。再利用SoftMax Pro软件加以计算。可认为这些结果的最大绝对误差系数小于2。相对误差则低于30％。调理素吞噬作用
通过CDC方法(用分化的HL60细胞检测肺炎链球菌的调理素吞噬作用，1.1方案)用纯化的人PMN和幼兔补体测定血清型3、6B、7F、14、19F及23F的调理素效价。所做修改包括使用自身(in house)肺炎球菌菌株并用纯化的人嗜中性粒细胞PMN代替HL60吞噬细胞(这些吞噬细胞之间具有高度的相关性)。此外还在微量滴定板中加入3mm玻璃珠以加强混合，这样能够使吞噬细胞细菌的比例降低至400这一推荐值。结果IgG浓度
表4-10显示每种血清型与PD的IgG浓度几何平均数。为便于比较，还提供了此前由4价疫苗制剂获得的血清型6B、14、19F及23F的结果。
表4-10突出显示了最高的IgG浓度。表11为3D-MPL相对于3D-MPL/AlPO4组合物的统计学p值。在11种血清型中，有9种血清型的最高GMC’s是由第4号佐剂配方(含有高剂量3D-MPL的未吸附结合物)获得。另一种最具免疫原性是低剂量MPL配方，占5/11。此外，与改变剂量的方法相比，佐剂化方法能够使所有血清型都获得更高的GMC’s(数据未显示)，血清型4、6B、7F、18C和23F在这一方面具有统计显著性(由95％CI得出的p＜0.05)。调理素吞噬作用
表4-8显示血清型3、6B、7F、14、19F和23F的合并血清的调理素吞噬作用结果。这些调理素效价在很大程度上可进一步证实GMCIgG。事实上，血清型6B、19F、23F的IgG浓度相关性大于85％(数据未显示)。重要的是应注意到，对血清型3而言，只有3D-MPL组诱导出了高于阈值的调理素活性。结论
在该实验中，出乎意料的是单独使用3D-MPL诱导出的IgG浓度最高。
将通过改变佐剂获得的最大GMC IgG与通过改变PS剂量获得的最大GMC进行比较，可发现在11种血清型中，有5种是3D-MPL诱导出明显更高的应答。
表11显示，通过3D-MPL与3D-MPL/AlPO4组合物的比较(比较配制方法和3D-MPL剂量)可发现，只用3D-MPL配制时的免疫原性明显高于用3D-MPL+AlPO4配制时的免疫原性的多糖结合物有5种PS 4、PS 6B、PS 18C、PS 19F和PS 23F。实施例3-组合方法对PS 4、PS 6B、PS 18C、PS 19F和PS 23F在成年大鼠中的免疫原性影响的研究
用肺炎球菌多糖-蛋白D结合物疫苗单独免疫成年大鼠，或用合并的多价组合物(4价、5价、7价或10价)免疫成年大鼠。10只大鼠为1组，每组免疫两次，间隔28天，并在第28天和第42天(第二次给药后第14天)取血测试。
通过ELISA测定血清中的抗肺炎球菌多糖IgG抗体。ELISA的测定结果表明，所有结合物都诱导出特定的IgG抗体。表12显示单价PS 6B、PS 18C、PS 19F和PS 23F蛋白D结合物的组合方法对其在成年大鼠中的免疫原性的影响，该结果是通过测量第二次给药后第14天的IgG浓度而获得。
对所有样品进行统计分析，以确定组合后的抗体浓度是否有明显差异。用血清型PS 6B、PS 18C、PS 19F和PS 23F蛋白D结合物任意组合的多价疫苗均不会明显改变其免疫原性。表1PS肺炎链球菌-蛋白D结合物的特定活化/偶联/淬灭条件表211价肺炎球菌PS-PD疫苗的详细说明(批号代码的第一个数表明血清型)表3.在未成年大鼠中测试的11价肺炎球菌PS-PD所使用的佐剂配方一览表表4.用含有不同佐剂的11价PS-PD对未成年大鼠进行III级免疫后第28天的血清型6B的IgG浓度几何平均数、血清转化和调理素平均效价(与4价疫苗免疫相比)表5.用含有不同佐剂的11价PS-PD对未成年大鼠进行III级免疫后第28天的血清型14的IgG浓度几何平均数、血清转化和调理素平均效价(与4价疫苗免疫相比)表6.用含有不同佐剂的11价PS-PD对未成年大鼠进行III级免疫后第28天的血清型19F的IgG浓度几何平均数、血清转化和调理素平均效价(与4价疫苗免疫相比)表7.用含有不同佐剂的11价PS-PD对未成年大鼠进行III级免疫后第28天的血清型23F的IgG浓度几何平均数、血清转化和调理素平均效价(与4价疫苗免疫相比)表8.用含有不同佐剂的11价PS-PD对未成年大鼠进行III级免疫后第28天的血清型3和7F的IgG浓度几何平均数、血清转化和调理素平均效价表9.用含有不同佐剂的11价PS-PD对未成年大鼠进行III级免疫后第28天的血清型1、4和5的IgG浓度几何平均数及血清转化表10.用含有不同佐剂的11价PS-PD对未成年大鼠进行III级免疫后第28天的血清型9V、18C以及PD的IgG浓度几何平均数和血清转化表11某些肺炎球菌多糖结合物只用3D-MPL配制时的免疫原性相对于用3D-MPL/AlPO4配制时的免疫原性的改进情况的统计显著性(p值)。p值小于0.01则被认为显著性很高。方法1和方法2表明配制方法。表12单独使用1.0μg多糖蛋白D结合物或使用4价、5价、7价或10价组合疫苗对成年大鼠进行第二次给药后第14天的IgG浓度几何平均数(μg/ml)。这些数据综合了5次单独实验的结果。实施例4-添加肺炎球菌溶血素及3D-MPL对11价多糖PD结合物疫苗在抗小鼠肺炎球菌性肺集群方面的保护效果的有益影响免疫显示肺炎球菌溶血素特异性血清IgG的ELISA用量
用稀释于PBS的2μg/ml重组天然肺炎球菌溶血素(PLY)以100μl/孔的量将Maxisorp Nunc免疫板37℃包被2小时。用NaCl 0.9％Tween-20 0.05％缓冲液将板清洗3次。然后加入作为标准曲线(从670ng/ml IgG开始)的依次2倍稀释(于PBS/Tween-20 0.05％，l00μl/孔)的抗PLY参照血清以及血清样品(由1/10稀释度开始)，20℃振荡保温30分钟。如前所述清洗，加入5000×稀释于PBS/Tween-20 0.05％的过氧化物酶偶联山羊抗鼠IgG(Jackson)，20℃振荡保温30分钟。如上清洗，然后室温下与100μl/孔的显象缓冲液(溶于100mM柠檬酸缓冲液pH4.5的OPDA 0.4mg/ml和H2O20.05％)保温15分钟。通过加入50μl/孔HCl 1N终止显象。利用Emax免疫读出仪(Molecular Devices)在490和620nm下测量光密度。用SoftMaxPro软件以4参数数学法计算抗体效价。溶血抑制
该测定方法可测量血清抗体对肺炎球菌溶血素(PLY)溶血活性的抑制能力。为了去除胆固醇(易与PLY相互作用)，将血清样品进行如下的2×处理与等体积的氯仿混合后振荡保温45分钟。1000rpm离心10分钟，然后收集