专利名称：疫苗的制作方法肺炎链球菌是一种革兰氏阳性细菌，引起相当大发病率和死亡率(特别是在青少年和老年人中)，引起侵袭性疾病例如肺炎、菌血症和脑膜炎，以及引起与定居相关的疾病例如急性中耳炎。在美国60岁以上的人中，肺炎球菌性肺炎的发病率估计为3-8/100,000。在20％的所述病例中这导致菌血症和其它表现，例如脑膜炎，甚至用抗生素治疗的死亡率也接近30％。肺炎球菌被有化学连接的多糖的荚膜，所述多糖提供血清型特异性。有90种已知血清型的肺炎球菌，其荚膜是肺炎球菌的主要毒力决定子，因为荚膜不仅保护细菌的内表面抵抗补体，而且其免疫原性差。多糖是不依赖T的抗原，不能在MHC分子上加工或呈递，以与T细胞相互作用。然而，它们可以通过一种涉及B细胞表面受体交联的替代机制来刺激免疫系统。在几个实验中，表明抵抗侵袭性肺炎球菌性疾病的保护作用与对荚膜特异性的抗体的关系最密切相关，所述保护作用是血清型特异性的。基于多糖抗原的疫苗是本领域众所周知的。已经批准用于人类的四种疫苗包括伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)的Vi多糖；得自流感嗜血菌的PRP多糖；由血清型A、C、W135和Y组成的四价脑膜炎球菌疫苗；以及由对应于血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33的多糖(占肺炎球菌血分离菌的至少90％)组成的23价肺炎球菌疫苗。后三种疫苗提供抵抗引起呼吸系统感染、在婴儿中导致严重病死率的细菌的保护作用，但这些疫苗尚未批准用于不满两岁的儿童，因为它们在该年龄组中的免疫原性不足[Peltola等(1984)，N.Engl.J.Med.3101561-1566]。肺炎链球菌是婴幼儿侵袭性细菌性疾病和中耳炎的最常见的病因。同样，老年人对肺炎球菌疫苗应答的建立不好[Roghmann等，(1987)，J.Gerontol.42265-270]，因而在该人群中细菌性肺炎的发生率增加[Verghese和Berk，(1983)Medicine(Baltimore)62271-285]。已经设计用以解决这种在婴儿中免疫原性缺乏的策略包括将所述多糖与大免疫原性蛋白连接，所述大免疫原性蛋白提供旁观者T细胞辅助，并且诱导针对与其缀合的所述多糖抗原的免疫记忆。目前正在评估肺炎球菌糖蛋白缀合物疫苗在各个年龄组中的安全性、免疫原性和功效。A)肺炎球菌多糖疫苗所述23价未缀合的肺炎球菌疫苗在临床功效中已经表现出变化大，从0％至81％(Fedson等(1994)Arch Intern Med.1542531-2535)。所述功效看来与正被免疫的风险组(例如老年人)、Hodgkin病、脾切除术、镰状细胞贫血病和丙球蛋白缺乏血症相关(Fine等(1994)Arch InternMed.1542666-2677)，也与所述疾病表现相关。所述23价疫苗未表现出抗肺炎球菌性肺炎(在某些高危组例如老年人中)和中耳炎疾病的保护作用。因此需要改进的肺炎球菌疫苗组合物，特别是将在老年人和幼儿中更有效地预防或缓解肺炎球菌性疾病(特别是肺炎)的疫苗。本发明提供这样一种改进的疫苗。B)选定的肺炎球菌多糖缀合物+3D-MPL组合物人们普遍认为，商业化未缀合的肺炎球菌疫苗的保护功效多少涉及接种疫苗后诱导的抗体的浓度；实际上，所述23种多糖仅因每种组分多糖的免疫原性而被批准(Williams等编著，New York Academy ofSciences 1995第241-249页)。因此，进一步增强对所述肺炎球菌多糖的抗体应答，有可能提高婴儿和老年人对首次注射的多糖或多糖缀合物以保护性水平抗体应答的百分比，并且可以减少诱导抗肺炎链球菌所致感染的保护性免疫所需的注射剂量和注射次数。
由于在20世纪早期，研究人员已经用大量的可以加入抗原中以增强其在疫苗组合物中免疫原性的化合物进行了实验[综述参见M.F.Powell和M.J.Newman，Plenum Press，NY，“Vaccine Design-theSubunit and Adjuvant Approach”(1995)第7章，“疫苗佐剂和赋形剂简述”]。许多化合物是非常有效的，但因为引起显著的局部和系统性不利反应，而使其不能应用于人用疫苗组合物中。首次描述于1926年的铝基佐剂(aluminium-based adjuvant)(例如明矾、氢氧化铝或磷酸铝)仍是在美国批准的用于人用疫苗的仅有的免疫佐剂。
铝基佐剂是载体类佐剂的实例，它通过其诱导的“缓释(depot)效应”而发挥作用。抗原被吸附至其表面，当注射所述组合物时，所述佐剂和抗原在血流中不是立即消散，而是所述组合物在注射的局部环境中持久存在，引起更显著的免疫应答结果。这类载体佐剂具有的额外己知优点是适合于使倾向于分解的抗原(例如某些多糖抗原)稳定化。
3D-MPL是非载体佐剂的一个实例。其全名为3-O-脱酰单磷酰基脂质A(或3脱-O-酰化单磷酰基脂质A或3-O-去酰基-4’单磷酰基脂质A)，并且称为3D-MPL，以表明还原性末端氨基葡萄糖的3位是脱-O-酰化的。关于其制备，参见GB 2220211 A。在化学上，它是具有4、5或6个酰化链的3-脱酰单磷酰基脂质A的混合物。它最初在20世纪90年代早期制备，当时将脂质A的4’-单磷酰基衍生物(MPL)3-O-脱酰化的方法产生毒性进一步减弱而免疫刺激活性没有变化的分子。
3D-MPL其本身已经用作佐剂，或者优先与缓释型载体佐剂(例如氢氧化铝、磷酸铝)或水包油乳剂联合用作佐剂。在这类组合物中，抗原和3D-MPL包含在相同的微粒结构中，提供抗原信号和免疫刺激信号更为有效的传递。研究表明，3D-MPL能够进一步增强明矾所吸附的抗原的免疫原性[Thoelen等，Vaccine(1998)16708-14；EP 689454-B1]。在本领域中，对于倾向于吸附的抗原(例如细菌多糖缀合物)也优选这类组合，其中吸附至明矾上往往使所述抗原稳定化。主要使用沉淀的铝基佐剂，因为它们是目前在已批准的人用疫苗中使用的仅有的佐剂。因此，本领域偏爱含有与铝基佐剂联用的3D-MPL的疫苗，是因为它们易于研制并且引入市场的速度快。
已经用几种单价多糖-缀合物疫苗抗原评估了作为佐剂的MPL(非3-脱酰化的)。对于以下四种单价多糖缀合物而言，共同注射盐水中的MPL增强了血清抗体应答肺炎球菌PS 6B-破伤风类毒素、肺炎球菌PS 12-白喉类毒素以及与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)内毒素A缀合的金黄色葡萄球菌(S.aureus)5型和金黄色葡萄球菌8型[Schneerson等，J.Immunology(1991)1472136-2140]。增强的应答被认为是抗原特异性的。水包油乳剂(一种载体类型的佐剂)中的MPL由于MPL和抗原存在于同一微粒结构中，一致地增强盐水中的MPL的效应，并且被认为是选择用于其它多糖缀合物疫苗最佳传递的佐剂系统。
Devi等[Infect.Immun.(1991)593700-7]评估了盐水中的MPL(非3-脱酰化的)在对新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)荚膜多糖的TT缀合物的鼠抗体应答方面的佐剂效应。当MPL与所述缀合物同时使用时，对所述PS的IgM特异性应答和IgG特异性应答都仅有最低限度的增加；然而，当在给予所述缀合物后2天给予时，MPL的效应要大得多。尤其在婴儿中采用需要相对于抗原延迟给予MPL的免疫方案的实用性有问题。MPL对于多糖和多糖-蛋白质缀合物的佐剂效应看来是组合物依赖性的。再者，在适当的缓释传递系统(例如采用载体佐剂)中加入MPL，提供了更为持久的佐剂效应并且避开定时给予和延迟给予的问题。
总之，现有技术水平已经表明对于特定的多糖或多糖-缀合物抗原而言，当将MPL或3D-MPL用作佐剂时，最好将其与载体佐剂(例如铝基佐剂)一起使用，以便使其免疫刺激效应最大化。
出乎意料的是，本发明人已经发现，对于某些肺炎球菌多糖缀合物而言，当将所述抗原仅与3D-MPL一起配制，而不是将所述抗原与结合载体佐剂(例如铝基佐剂)的3D-MPL一起配制时，疫苗组合物的免疫原性明显更大。此外，所观察的改进与所用的3D-MPL浓度以及所述特定缀合物是否在单价组合物中或者它们是否混合形成多价组合物无关。C)细菌多糖-D蛋白缀合物如上所述，基于多糖抗原的疫苗是本领域众所周知的。上述已批准的多糖疫苗具有不同的已证明的临床功效。已经估计Vi多糖疫苗在预防培养物证实的伤寒方面的功效为55％-77％(Plotkin和Cam，(1995)Arch Intern Med 1552293-99)。表明脑膜炎球菌C多糖疫苗在流行病条件下的功效为79％(De Wals P等(1996)Bull World Health Organ.74407-411)。已经表明，所述23价肺炎球菌疫苗的临床功效变化大，从0％至81％(Fedson等(1994)Arch Intern Med.1542531-2535)。如上所述，人们认为，所述肺炎球菌疫苗的保护性功效多少与疫苗接种后诱导的抗体浓度有关。
在与疫苗接种的多糖途径相关的问题中，事实是多糖本身是不良免疫原。已经设计用于解决这种免疫原性缺乏的策略包括将所述多糖与提供旁观者T细胞辅助的大的高免疫原性蛋白载体连接。
目前在多糖免疫原生产中常用的这些高免疫原性载体的实例包括白喉类毒素(DT或CRM197突变体)、破伤风类毒素(TT)、匙孔?血蓝蛋白(KLH)和结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)。与常用载体相关的问题许多问题与这些常用载体中的每种载体相关，包括在GMP缀合物生产方面以及在所述缀合物的免疫特性方面的问题。
尽管通常使用这些载体并且它们在诱导抗多糖抗体应答方面获得了成功，但它们也伴随有几个缺点。例如，已知抗原特异性免疫应答可能由于存在针对所述载体(在这种情况下是破伤风毒素)的已有抗体而受到抑制(表位抑制)(Di John等；(1989)Lancet，21415-8)。在所述人群中，通常非常高百分比的人群普遍具有针对DT和TT两者的已有的免疫应答，因为人们常规接种这些抗原。在美国例如95％的儿童接受包含DT和TT两者的DTP疫苗。其它作者已经描述了在动物模型中对肽疫苗的表位抑制的问题(Sad等，Immunology，1991；74223-227；Schutze等，J.Immunol.1354，1985；2319-2322)。
另外，对于需要定期加强的疫苗而言，应用高免疫原性载体例如TT或DT，在数次注射后有可能抑制所述多糖的抗体应答。这些多次疫苗接种也可能伴随有不希望有的反应，例如迟发型反应性过高(DTH)。
KLH已知为有效的免疫原，并且在人类临床试验中已经用作IgE肽的载体。然而，已经观察到某些不利反应(DTH样反应或IgE致敏)以及针对抗体的抗体应答。
因此，选择用于基于多糖的疫苗的载体蛋白，将需要在使用一种于所有患者中有效(广泛的MHC识别)的载体的必要性、高水平抗多糖抗体应答的诱导以及针对所述载体的低抗体应答之间的平衡。
因此，先前用于基于多糖的疫苗的载体有许多缺点。在联合疫苗中情况尤为如此，在联合疫苗的情况下如果不同的多糖抗原使用同一种载体，则表位抑制尤其成问题。在WO98/51339中，在联合疫苗中使用多种载体，以便尝试克服这种效应。
本发明提供一种新型载体，以用于制备基于多糖/多肽的免疫原性缀合物，所述新型载体没有上述缺点。
本发明提供得自流感嗜血菌的D蛋白(EP 0 594 610 B1)或其片段，作为基于多糖的免疫原性组合物(包括疫苗)的载体。在联合疫苗中应用该载体尤为有利。
发明概述A)肺炎球菌多糖疫苗因此，发明提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含至少一种肺炎链球菌多糖抗原(最好是缀合的)和一种肺炎链球菌蛋白抗原或其免疫功能等同体，任选地包含一种Th1佐剂(诱导Th1免疫应答的佐剂)。最好是既包括肺炎球菌蛋白，又包括Th1佐剂。本发明的组合物尤其适合于治疗老年人肺炎。
肺炎球菌多糖疫苗(缀合的或非缀合的)在肺炎发病率非常高的老年人群中可能不能保护人们抵抗肺炎。抗肺炎球菌的关键防御机制是调理素吞噬作用(opsonophagocytosis)(由于产生抗肺炎球菌多糖的抗体引起的一种体液B细胞/嗜中性粒细胞介导的事件，所述细菌最终被吞噬)，然而，在老年人中所涉及的调理素机制的部分受损，即PMN(多形核细胞)产生超氧化物、产生其它活性氧种类、PMN迁移、PMN凋亡、PMN变形。在老年人中抗体应答也受损。
与普遍的看法相反，正常水平的抗荚膜多糖抗体可能在完全清除细菌方面不是有效的，因为肺炎球菌可能侵入宿主细胞以逃避免疫系统的这一分支。
出人意料的是，本发明人已经发现，通过除刺激免疫系统的体液分支(B细胞介导的)外，还同时刺激免疫系统的细胞介导的分支(例如T细胞介导的免疫)，产生能够加强从宿主中清除肺炎球菌的协同作用。这是一个发现，这将有助于一般预防(或治疗)肺炎球菌感染，而对于在显示基于多糖的疫苗无效的老年人中预防(或治疗)肺炎尤为重要。
本发明人已经发现，如果肺炎球菌多糖(最好是缀合的)与肺炎球菌蛋白(最好是在肺炎球菌表面表达或分泌或释放的蛋白，它可以被加工并且在受感染哺乳动物细胞表面上的II类和I类MHC环境下呈递)一起给予时，免疫系统的两个分支都可以以这种方式协同作用。虽然肺炎球菌蛋白自身可以触发细胞介导的免疫，但本发明人也已经发现，在疫苗制剂中存在Th1诱导性佐剂，有助于免疫系统的该分支，并且出乎意料地进一步增强免疫系统两个分支之间的协同作用。B)选定的肺炎球菌多糖缀合物+3D-MPL组合物因此，本发明也提供一种抗原性组合物，所述抗原性组合物包含一种或更多种肺炎球菌多糖缀合物、用3D-MPL作为佐剂并且基本上不含铝基佐剂，其中所述肺炎球菌多糖缀合物中的至少一种在包含3D-MPL的组合物中的免疫原性显著高于在包含与铝基佐剂结合的3D-MPL的组合物中的免疫原性。
提供的优选实施方案是包含以下肺炎球菌荚膜多糖的一种或更多种的缀合物的抗原性组合物血清型4、6B、18C、19F和23F。在这类组合物中，每种所述多糖在仅包含3D-MPL的组合物中意外地比在包含3D-MPL和铝基佐剂的组合物中的免疫原性高。
因此，在本发明的一个实施方案中，提供包含与免疫原性蛋白缀合的肺炎链球菌荚膜多糖血清型4、6B、18C、19F或23F以及3D-MPL佐剂的抗原性组合物，其中所述组合物基本上不含铝基佐剂。
在第二个实施方案中，本发明提供一种联合抗原性组合物，所述组合物基本上不含铝基佐剂，并且包含3D-MPL佐剂和两种或更多种选自以下的肺炎球菌多糖缀合物血清型4、血清型6B、血清型18C、血清型19F和血清型23F。C)细菌多糖-D蛋白缀合物因此，本发明提供一种多糖缀合物抗原，其包含一种得自致病细菌、与流感嗜血菌D蛋白或其D蛋白片段缀合的多糖抗原。另外，本发明提供多价疫苗组合物，其中一个或多个所述多糖抗原与D蛋白缀合。
发明的描述A)肺炎球菌多糖疫苗本发明提供尤其用于预防或缓解老年人(和/或婴儿和学步幼儿)肺炎球菌感染的改进疫苗。
在本发明正文中，如果患者年龄为55岁或55岁以上，通常超出60岁，更为通常超过65岁，则认为该患者为老年人。
因此，在本发明的一个实施方案中，提供一种适用于老年人(和/或婴儿和学步幼儿)的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含至少一种肺炎链球菌多糖抗原和至少一种肺炎链球菌蛋白抗原。
在第二个优选实施方案中，本发明提供一种疫苗(适用于预防老年人肺炎)，其包含至少一种肺炎链球菌多糖抗原和至少一种肺炎链球菌蛋白抗原和一种Th1佐剂。
设想了这样一种疫苗也将可应用于在其它高危人群组(例如婴儿或学步幼儿)中治疗肺炎球菌感染(例如中耳炎)。
在第三个实施方案中，提供包含一种肺炎球菌多糖抗原和一种Th1佐剂的疫苗组合物。本发明的肺炎链球菌多糖抗原本发明的肺炎链球菌疫苗通常将包含多糖抗原(最好是缀合的)，其中所述多糖得自至少4种血清型的肺炎球菌。所述四种血清型优选包括6B、14、19F和23F。更优选在所述组合物中包含至少7种血清型，例如得自血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的那些多糖。再更优选在所述组合物中包含至少11种血清型，例如在一个实施方案中所述组合物包括得自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的荚膜多糖(最好是缀合的)。在本发明的一个优选实施方案中，包括至少13种多糖抗原(最好是缀合的)，虽然本发明也设想了其它多糖抗原，例如23价(例如血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)。
对于老年人疫苗(例如用于预防肺炎)，最好是在上述11价抗原性组合物中包括血清型8和12F(最优选15和22)，以形成15价疫苗，而对于婴儿或学步幼儿而言(其中更关注中耳炎)，最好包括血清型6A和19A，以形成13价疫苗。
为了预防/缓解老年人群(+55岁)的肺炎以及婴儿(至18个月)和学步幼儿(通常为18个月至5岁)的中耳炎，本发明的一个优选实施方案是将本文所述的一种多价肺炎链球菌多糖与一种肺炎链球菌蛋白或其免疫功能等同体联合。本发明的肺炎球菌蛋白对于本发明的目的而言，“免疫功能等同体”的定义是包含至少一种来自本发明蛋白的保护性表位的肽或蛋白。这类表位是特征性表面暴露、高度保守的，并且可以诱发宿主的细菌抗体应答或防止毒性效应。最好是，所述功能等同体具有得自本发明蛋白的至少15个、优选30个或30个以上的连续氨基酸。最优选的是，可以使用所述蛋白的片段、缺失体例如其跨膜缺失变异体(即应用所述蛋白的胞外域)、融合体、化学或遗传解毒衍生物等，前提是它们能够产生与所述天然蛋白的情况基本上相同的免疫应答。
本发明的优选蛋白是在肺炎球菌外表面暴露的那些肺炎球菌蛋白(在所述肺炎球菌生命周期中的至少部分时期能够为宿主免疫系统所识别)，或是所述肺炎球菌分泌或释放的蛋白。最优选的是，所述蛋白是肺炎链球菌的毒素、粘附素、双组分信号转导物或脂蛋白、或其免疫功能等同体。
包括在这种联合疫苗中的特别优选的蛋白包括但不限于肺炎球菌溶血素(最好是经化学处理或突变解毒)[Mitchell等，Nucleic AcidsRes.1990年7月11日；18(13)4010“肺炎链球菌1型和2型的肺炎球菌溶血素基因和蛋白的比较”，Mitchell等Biochim Biophys Acta 1989年1月23日；1007(1)67-72“肺炎球菌溶血素基因在大肠杆菌中的表达快速纯化和生物学特性”，WO96/05859(A.Cyanamid)，WO90/06951(Paton等)，WO99/03884(NAVA)]；PspA及其跨膜缺失变异体(US5804193-Briles等)；PspC及其跨膜缺失变异体(WO97/09994-Briles等)；PsaA及其跨膜缺失变异体(Berry和Paton，Infect Immun 1996年12月；64(12)5255-62“PsaA的序列异质性，一种肺炎链球菌毒力必需的37千道尔顿推定的粘附素”)；肺炎球菌胆碱结合蛋白及其跨膜缺失变异体；CbpA及其跨膜缺失变异体(WO97/41151；WO99/51266)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Infect.Immun.1996 643544)；HSP70(WO96/40928)；PcpA(Sanchez-Beato等，FEMS Microbiol Lett 1998，164207-14)；M样蛋白、SB专利申请号EP 0837130；和粘附素18627，SB专利申请号EP 0834568。
用于本发明的蛋白最好选自肺炎球菌溶血素、PsaA、PspA、PspC、CbpA或两种或更多种这类蛋白的组合。本发明也包括这类蛋白的免疫功能等同体(如上定义)。
在所述组合物中，所述蛋白可以有助于诱导针对肺炎球菌性疾病的T细胞介导的应答，尤其是保护抵抗肺炎所需的应答，所述应答与免疫系统的体液分支协同作用，以抑制肺炎球菌的侵入，并且刺激调理素吞噬作用。
包括所述蛋白抗原的其它优点是呈递其它抗原以进行调理素吞噬作用过程，并且抑制细菌粘附(如果使用粘附素)或中和毒素(如果使用毒素)。
因此，在本发明的一个实施方案中，提供肺炎链球菌疫苗，包括肺炎球菌多糖缀合物疫苗，所述疫苗包含得自至少四种血清型、优选是至少7种血清型、更优选至少11种血清型的多糖抗原和至少一种、但最好两种肺炎链球菌蛋白。所述蛋白之一优选是肺炎球菌溶血素或PsaA或PspA或CbpA(最优选是解毒的肺炎球菌溶血素)。一种优选的组合至少含有肺炎球菌溶血素或其衍生物和PspA。
如上所述，与疫苗接种的多糖途径相关的问题是多糖本身是不良免疫原的事实。为了解决这一问题，可以将多糖与提供旁观者T细胞辅助的蛋白载体缀合。因此，最好是将用于本发明的多糖与这样一种蛋白载体连接。目前通常用来生产多糖免疫原的这类载体的实例包括白喉类毒素和破伤风类毒素(分别为DT，DT CRM197和TT)、匙孔?血蓝蛋白(KLH)、得自脑膜炎奈瑟氏球菌(N.neningitidis)的OMPC和结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)。
然而，许多问题与这些常用载体中的每种相关(参见上述“与常用载体相关的问题”一节)。
在一个优选实施方案中本发明提供一种用于制备基于多糖的免疫原构建体的、没有上述缺点的新型载体。用于基于肺炎球菌多糖的免疫原性组合物(或疫苗)的优选载体是流感嗜血菌的D蛋白(EP594610-B)或其片段。适合应用的片段包括包含T辅助细胞表位的片段。特别是，D蛋白片段最好包含该蛋白N末端的1/3。
用于所述肺炎球菌多糖的再一优选载体是所述肺炎球菌蛋白本身(如在“本发明的肺炎球菌蛋白”一节中所定义)。
本发明的疫苗最好加有佐剂。合适的佐剂包括铝盐，例如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝，但也可以是钙盐、铁盐或锌盐，或可以是酰化酪氨酸或酰化糖、阳离子或阴离子衍生化多糖或聚磷腈的不溶性悬浮液。
最好是，选择作为TH1型应答优先诱导物的佐剂，以有助于免疫应答的细胞介导分支。本发明的TH1佐剂高水平的Th1型细胞因子往往有助于诱导对给定抗原的细胞介导的免疫应答，而高水平的Th2型细胞因子往往有助于诱导对所述抗原的体液免疫应答。
重要的是记住Th1型和Th2型免疫应答的区分不是绝对的。实际上一个个体将支持称为主要为Th1或主要为Th2的免疫应答。然而，通常方便的是根据Mosmann和Coffman在鼠CD4+veT细胞克隆中的描述(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)TH1和TH2细胞不同的淋巴因子分泌模式导致不同的功能特性。Annual Review of Immunology，7，第145-173页)来考虑细胞因子家族。传统上，Th1型应答与T淋巴细胞产生IFN-γ和IL-2细胞因子有关。其它细胞因子通常直接与不是由T细胞产生的Th1型免疫应答的诱导相关，例如IL-12。相反，Th2型应答与IL-4、IL-5、IL-6、IL10的分泌有关。促进主要为Th1应答的合适佐剂系统包括单磷酰基脂质A或其衍生物(特别是3-脱-O-酰化单磷酰基脂质A)以及单磷酰基脂质A(最好是3-脱-O-酰化单磷酰基脂质A(3D-MPL))与铝盐的组合。
一种增强的系统涉及单磷酰基脂质A和皂苷衍生物的组合，特别是WO94/00153中公开的QS21和3D-MPL的组合，或较低反应原性组合物，其中如WO96/33739中公开的，用胆固醇猝灭(quench)QS21。
一种在水包油乳液中包含QS21、3D-MPL和生育酚的特定有效的佐剂制剂描述于WO95/17210，并且是优选的制剂。
最好是，所述疫苗还包含一种皂苷，更优选是QS21。所述制剂也可以包含一种水包油乳剂和生育酚(WO95/17210)。
本发明也提供一种生产疫苗制剂的方法，包括将一种本发明的蛋白与一种药学上可接受的赋形剂(例如3D-MPL)混合在一起。
含有未甲基化CpG的寡核苷酸(WO96/02555)也是TH1应答的优先诱导物，适用于本发明。
特别优选的本发明组合物包含一种或更多种缀合的肺炎球菌多糖、一种或更多种肺炎球菌蛋白和一种Th1佐剂。采用这样一种Th-1佐剂，可能有助于通过肺炎球菌蛋白(如上所述)诱导细胞介导的应答以及免疫系统两个分支之间的协同作用，产生一种特别有效的普遍抗肺炎球菌性疾病、重要的是在老年人中抗肺炎球菌性肺炎的疫苗。
在本发明的再一个方面，提供本文所述的用于医药的免疫原或疫苗。
在本发明的又一个方面，提供包含一种肺炎球菌多糖缀合物和一种Th1佐剂(最好是3D-MPL)的组合物，它能够使得血清转化，或者在无反应者群体中诱导针对所述多糖抗原的体液抗体应答。
已知10-30％的所述人群对于多糖免疫是无反应者(对疫苗中50％以上的血清型不反应)(Konradsen等，Scand.J.Immun 40251(1994)；Rodriguez等，JID，1731347(1996))。对于缀合疫苗也可能是这种情况(Musher等，Clin.Inf.Dis.271487(1998))。这对于高危区的所述人群(婴儿、学步幼儿和老年人)而言可能尤为严重。
本发明人已经发现，缀合的肺炎球菌多糖(所述多糖在特定人群中有低应答的倾向)与Th1佐剂(参见以上“本发明的Th1佐剂”)的组合可以出乎意料地解决这种无应答性。最好是，应该使用3D-MPL，最优选使用不含铝基佐剂的3D-MPL(这还提供更好的应答)。因此，本发明提供这类组合物，还提供一种通过给予这类组合物治疗肺炎球菌多糖无反应者的方法，还提供Th1佐剂在以下方面的应用包含缀合的肺炎球菌多糖抗原的药物的生产、在所述多糖抗原无反应者中抗肺炎球菌性疾病的治疗(或保护所述多糖抗原无反应者免患肺炎球菌性疾病)。
在一个实施方案中，提供预防或缓解老年人肺炎的方法，包括给予所述老年患者安全且有效量的本文所述的疫苗，所述疫苗包含一种肺炎链球菌多糖抗原和或者一种Th1佐剂或者一种肺炎球菌蛋白(最好是这两者)。
在再一实施方案中，提供预防或缓解婴儿或学步幼儿中耳炎的方法，包括给予所述婴儿或学步幼儿安全而有效量的疫苗，所述疫苗包含一种肺炎链球菌多糖抗原和或者一种肺炎球菌蛋白或者一种Th1佐剂(最好是这两者)。
最好是，上述的本发明方法中，所述多糖抗原以多糖蛋白缀合物呈递。本发明的疫苗制剂通过系统途径或粘膜途径给予本发明的疫苗制剂，可以用本发明的疫苗支持保护或治疗易患感染的哺乳动物。这些给药可以包括经肌内、腹膜内、皮内或皮下途径注射；或经粘膜给予口/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。最好是鼻内给予疫苗以治疗肺炎或中耳炎(因为可以更为有效地预防肺炎球菌的鼻咽运输，因此在最早阶段减弱感染)。
每个疫苗剂量中的缀合物抗原量被选定为在典型的疫苗中诱导免疫保护性应答且无显著不利副作用的量。这种量将根据使用何种特定免疫原以及如何呈递所述免疫原而变化。一般而言，预期每一剂量将包含0.1-100μg多糖，最好是0.1-50μg，优选0.1-10μg，其中1-5μg是最优选的范围。
所述疫苗中所述蛋白抗原的含量通常为1-100μg，优选5-50μg，最优选的范围是5-25μg。
特定疫苗各组分的最佳量可以通过标准研究来确定，所述标准研究包括观察受治疗者中的适当免疫应答。在初次接种疫苗后，受治疗者可以接受适当间隔的一次或数次加强免疫。
在Vaccine Design(“亚单位和佐剂途径(The subunit and adjuvantapproach)”(Powell M.F.和Newman M.J.编著)(1995)Plenum Press NewYork)中全面描述了疫苗制剂。Fullerton的美国专利4,235,877描述了在脂质体中包胶囊。B)选定的肺炎球菌多糖缀合物+3D-MPL组合物对于本发明的目的，术语“本发明的肺炎球菌多糖缀合物”描述了肺炎链球菌荚膜多糖的那些缀合物，它们在包含3D-MPL的组合物中的免疫原性高于在包含3D-MPL和铝基佐剂的组合物中的免疫原性(例如血清型4、血清型6B、血清型18C、血清型19F或血清型23F的缀合物)。
对于本发明的目的，术语“基本上不含铝基佐剂”描述了不含足够的铝基佐剂(例如氢氧化铝，特别是磷酸铝)的组合物，与包含3D-MPL而不加入铝基佐剂的等同组合物相比，所述铝基佐剂使得本发明肺炎球菌多糖缀合物的免疫原性降低。最好是，所述抗原性组合物应该含有基本上由3D-MPL组成的佐剂。每剂量铝基佐剂的加入量优选应低于50μg，更优选低于30μg，再更优选低于10μg，最优选在本发明的抗原性组合物中不加入铝基佐剂。
对于本发明的目的，确定肺炎球菌多糖缀合物在包含3D-MPL的组合物中的免疫原性是否显著高于在包含3D-MPL和铝基佐剂的组合物中的免疫原性，这应该如实施例2中所述进行确立。作为当仅包含3D-MPL时组合物的免疫原性是否显著更高的指标，仅含3D-MPL的组合物与含有3D-MPL和磷酸铝佐剂的等同组合物之间的GMC IgG浓度(按实施例2所述方法测定)比应该大于2，优选大于5，更优选大于7，再更优选大于9，最优选大于14。
多糖本身是不良的免疫原，这一事实是与疫苗接种的多糖途径相关的问题之一。已经设计用于解决这种免疫原性缺乏的策略包括将所述多糖与提供旁观者T细胞辅助的大蛋白载体连接(缀合)。最好是，将本发明的肺炎球菌多糖与提供旁观者T细胞辅助的蛋白载体连接。可以使用的这类载体的实例包括白喉类毒素、白喉突变体类毒素和破伤风类毒素(分别为DT、CRM197和TT)、匙孔?血蓝蛋白(KLH)、结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)和脑膜炎奈瑟氏球菌的OMPC。
最优选将流感嗜血菌的D蛋白(EP 0 594 610-B)或其片段(参见C节)用作本发明的肺炎球菌多糖的免疫原性蛋白载体。
在一个实施方案中，本发明的抗原性组合物包含与一种免疫原性蛋白缀合的肺炎球菌多糖血清型(PS)4，并且用3D-MPL佐剂配制，其中所述组合物基本上不含铝基佐剂。在其它实施方案中，所述抗原性组合物分别包含与免疫原性蛋白缀合的PS 6B、18C、19F或23F，并且用3D-MPL佐剂配制，其中所述组合物基本上不含铝基佐剂。
在本发明的再一个实施方案中，提供联合抗原性组合物，该组合物包含2种或更多种得自组PS 4、PS 6B、PS 18C、PS 19F和PS 23F并且用3D-MPL佐剂配制的肺炎球菌多糖缀合物，其中所述组合物基本上不含铝基佐剂。
本发明的肺炎球菌多糖缀合物的免疫原性不受与其它肺炎球菌多糖缀合物(实施例3)组合的显著影响。因此，本发明的一个优选方面提供一种联合抗原性组合物，所述组合物包含与一种或更多种其它肺炎球菌多糖缀合物联合的一种或更多种本发明的肺炎球菌多糖缀合物，其中所述组合物用3D-MPL佐剂配制，但基本上不含铝基佐剂。
在本发明的再一优选实施方案中，提供联合抗原性组合物，所述组合物包含PS 4、6B、18C、19F或23F肺炎球菌多糖缀合物中的至少一种、优选2种、3种、4种或所有5种，还包含与其它肺炎球菌多糖缀合物的任何组合，所述组合物用3D-MPL佐剂配制，但基本上不含铝基佐剂。
本发明的肺炎链球菌联合抗原性组合物通常将包含多糖缀合物抗原，其中所述多糖得自至少4、7、11、13、15或23种血清型(关于根据待治疗疾病的优选血清型组合，参见以上“本发明的肺炎链球菌多糖抗原”)。
本发明的抗原性组合物最好作为疫苗组合物使用，以预防(或治疗)肺炎球菌感染，特别是在老年人和婴儿以及学步幼儿中预防(或治疗)肺炎球菌感染。
本发明的其它实施方案包括提供用于医药的上述抗原性组合物；诱导针对肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的免疫应答的方法，包括给予患者安全而有效量的一种上述抗原性组合物的步骤；和应用上述抗原性组合物之一生产肺炎球菌性疾病的预防(或治疗)药物。
为了预防/缓解老年(+55岁)人群的肺炎以及婴儿(至18个月)和学步幼儿(通常为18个月至5岁)的中耳炎，本发明的再一优选实施方案是将如本文所述配制的多价肺炎链球菌多糖缀合物与一种肺炎链球菌蛋白或其免疫功能等同体联合。关于优选蛋白/蛋白组合参见上节“本发明的肺炎球菌蛋白”。
优选将上文描述的抗原性组合物(和疫苗)冻干待用，使用时用稀释剂将它们临时重建。更优选将它们在3D-MPL存在下冻干，并且用盐水溶液临时重建。
将所述组合物冻干，产生更为稳定的组合物(例如它防止所述多糖抗原分解)。该过程也意外地致使仍然针对所述肺炎球菌多糖的抗体效价更高。已经表明这对于PS 6B缀合物是尤为明显的。因此，本发明的另一方面是包含PS 6B缀合物、加有3D-MPL佐剂并且基本上不含铝基佐剂的冻干抗原性组合物。
关于疫苗的制备，参见上文“本发明的疫苗制剂”一节。C)细菌多糖-D蛋白缀合物联合疫苗发展方向的优点是减少接受者的不适，便于制定时间表和确保方案的完整；但也伴随有降低疫苗功效的风险(参见上文关于因过度使用载体蛋白引起表位抑制的讨论)。因此，制备满足人群需求并且另外在其组分之间没有表现出免疫原性干扰的疫苗组合将是有利的。这些优势可以通过本发明的免疫原性组合物(或疫苗)来实现，将联合疫苗给予高危组别(例如婴儿、学步幼儿或老年人)特别有益。
本发明提供作为基于多糖的免疫原性组合物(包括疫苗)载体的流感嗜血菌D蛋白或其片段。适合使用的片段包括包含T辅助细胞表位的片段。特别是，D蛋白片段最好含有所述蛋白N末端的1/3。
D蛋白是一种得自流感嗜血菌的IgD结合蛋白(EP 0 594 610B1)，并且是一种潜在的免疫原。
本发明设想的待与D蛋白缀合的多糖包括但不限于针对伤寒沙门氏菌的Vi多糖抗原、脑膜炎球菌多糖(包括A、C、W135和Y型，以及B组脑膜炎球菌的多糖和修饰多糖)、得自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的多糖、得自无乳链球菌(Streptococcusagalactae)的多糖、得自肺炎链球菌的多糖、得自分枝杆菌例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的多糖(例如甘露磷酸肌醇海藻糖、分枝菌酸、甘露糖加帽的阿拉伯甘露糖、其荚膜和阿拉伯半乳聚糖)、得自新型隐球菌的多糖、不可定型的(non-typeable)流感嗜血菌的脂多糖、得自流感嗜血菌b的荚膜多糖、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxellacatharralis)的脂多糖、索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)的脂多糖、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)的脂肽基磷酸聚糖(lipopeptidophospholycan)(LPPG)、癌症相关的神经节苷脂GD3、GD2、肿瘤相关的粘蛋白(特别是T-F抗原以及唾酸T-F抗原)以及结构上涉及T-F抗原的HIV相关多糖。
可以用任一已知方法(例如Likhite的美国专利4,372,945和Armor等的美国专利4,474,757描述的方法)将所述多糖与所述载体蛋白连接。最好是进行CDAP缀合(WO95/08348)。
在CDAP中，最好用氰化(cyanylating)试剂四氟硼酸1-氰基-二甲氨基吡啶鎓(CDAP)来合成多糖-蛋白缀合物。所述氰化反应可以在相对温和的条件下进行，避免碱敏感性多糖的水解。该合成允许直接与载体蛋白偶联。
在水或盐水溶液中溶解所述多糖。将CDAP溶于乙腈中，并且立即加入到所述多糖溶液中。CDAP与多糖的羟基反应，形成氰酸酯。在所述活化步骤后，加入载体蛋白。赖氨酸的氨基与所述活化多糖反应，形成异脲共价键。
在偶联反应之后，加入大量过量的甘氨酸，以猝灭残留的活化官能。然后使该产物通过凝胶渗透，以除去未反应的载体蛋白和残留的试剂。因此，本发明提供产生多糖D蛋白缀合物的方法，包括活化多糖和将多糖与D蛋白连接的步骤。
在本发明的一个优选实施方案中，提供一种用于预防肺炎链球菌感染的免疫原性组合物(或疫苗)制剂。
人们对肺炎球菌传播到肺、脑脊液和血液的机制知之甚少。到达正常肺泡的细菌由于其相对干燥以及肺泡巨噬细胞的吞噬活性，其生长受到抑制。这些协同防御的任何解剖学变化或生理学变化往往增加肺对感染的易感性。肺炎链球菌的细胞壁在肺泡中产生炎性反应方面具有重要作用(Gillespie等(1997)，I&I653936)。
通常，本发明的肺炎链球菌疫苗将包含D蛋白多糖缀合物，其中所述多糖得自至少4、7、11、13、15或23种血清型。关于根据待治疗疾病的优选血清型组合，参见以上“本发明的肺炎链球菌多糖抗原”。
在本发明的再一实施方案中，提供一种脑膜炎奈瑟氏球菌疫苗；所述脑膜炎奈瑟氏球菌特别是来自血清型A、B、C W-135和Y的脑膜炎奈瑟氏球菌。脑膜炎奈瑟氏球菌是细菌性脑膜炎的最重要的病因之一。这些生物的糖类荚膜可以用作毒力决定子和保护性抗体的靶。然而，众所周知糖类在幼儿中是差的免疫原。本发明提供一种特别适用于这些多糖的蛋白载体-D蛋白，它提供T细胞表位，所述T细胞表位可以激活T细胞应答，以有助于多糖抗原特异性B细胞增殖和成熟以及诱导免疫记忆。
在本发明的一个替代实施方案中，提供一种流感嗜血菌b的荚膜多糖(PRP)-D蛋白缀合物。
本发明也设想了提供抗多种不同病原体的保护作用的联合疫苗。出乎意料的是，D蛋白载体可用作联合疫苗中的载体，其中将多种多糖抗原缀合。如上所述，如果每种多糖使用同一载体，则有可能发生表位抑制。WO98/51339提出了多种组合物，尝试通过将所述组合物中一定比率的所述多糖缀合到DT上、并且将其余多糖缀合到TT上，将这种干扰最小化。
出乎意料的是，本发明人已经发现D蛋白特别适合于将联合疫苗中的这类表位抑制效应最小化。可以有利地将一种组合中的一种或更多种多糖缀合到D蛋白上，最好在这类联合疫苗中将所有抗原都缀合到D蛋白上。
一种优选组合包括提供抗脑膜炎奈瑟氏球菌C和Y(最好是A)感染保护作用的疫苗，其中将得自一种或更多种血清型Y和C(最优选是A)的多糖抗原与D蛋白连接。
基于流感嗜血菌多糖的疫苗(优选与TT、DT或CRM197缀合的、或最优选与D蛋白缀合的PRP)可以与上述联合疫苗一起配制。
许多儿科疫苗现在作为联合疫苗给出，以便减少儿童必须接受的注射次数。因此，对于儿科疫苗而言，可以将其它抗原与本发明的疫苗一起配制。例如，本发明的疫苗可以与众所周知的“三价”联合疫苗一起配制，或分别但同时给予；所述“三价”联合疫苗包含白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)和百日咳组分[通常为解毒的百日咳类毒素(PT)和丝状血细胞凝集素(FHA)与任选的pertactin(PRN)和/或凝集素1+2]，例如市售的疫苗INFANRIX-DTPaTM(SmithKlineBeechamBiologicals)，它含有DT、TT、PT、FHA和PRN抗原或具有全细胞百日咳组分，例如SmithKlineBeecham Biologicals s.a.出售的的组分，例如TritanrixTM。所述联合疫苗也可以包含其它抗原，例如乙型肝炎表面抗原(HbsAg)、脊髓灰质炎病毒抗原(例如灭活的三价脊髓灰质炎病毒-IPV)、粘膜炎莫拉氏菌外膜蛋白、不可定型的流感嗜血菌蛋白、脑膜炎奈瑟氏球菌B外膜蛋白。
可以包括在联合疫苗(尤其是用于预防中耳炎)中的优选粘膜炎莫拉氏菌蛋白抗原的实例是OMP106[WO97/41731(Antex)和WO96/34960(PMC)]、OMP21、LbpA和LbpB[WO98/55606(PMC)]、TbpA和TbpB[WO97/13785和WO97/32980(PMC)]、CopB[Helminen ME等(1993)Infect.Immun.612003-2010]、UspA1/2[WO93/03761(University of Texas)]和OmpCD。可以包括在联合疫苗(尤其是用于预防中耳炎)中的不可定型流感嗜血菌抗原的实例包括丝束蛋白(Fimbrin protein)[(US 5766608-Ohio State Research Foundation)]和包含其肽的融合体[例如LB1(f)肽融合体；US 5843464(OSU)或WO99/64067]、OMP26[WO97/01638(Cortecs)]、P6[EP 281673(StateUniversity of New York)]、TbpA和TbpB、Hia、Hmw1，2、Hap和D15。
本发明设想的优选儿科疫苗是a)脑膜炎奈瑟氏球菌C多糖缀合物和流感嗜血菌b多糖缀合物，任选地与脑膜炎奈瑟氏球菌A和/或Y多糖缀合物，前提是至少一种多糖抗原、最好是所有多糖抗原与D蛋白缀合。b)疫苗a)与DT、TT、百日咳组分(最好是PT、FHA和PRN)、乙型肝炎表面抗原和IPV(灭活的三价脊髓灰质炎病毒疫苗)。c)与D蛋白缀合的肺炎链球菌多糖抗原。d)疫苗c)与一种或更多种得自粘膜炎莫拉氏菌和/或不可定型流感嗜血菌的抗原。
所有上述联合疫苗均可以受益于包括D蛋白作为载体。显然，包括在联合疫苗中载体愈多(例如为了克服表位抑制)，则最终的疫苗愈昂贵和愈复杂。使联合疫苗的所有多糖抗原或大部分多糖抗原与D蛋白缀合，则提供了明显的优势。
为了预防老年(+55岁)人群中的肺炎和婴儿或学步幼儿的中耳炎，本发明的一个优选实施方案是将本文所述的多价肺炎链球菌多糖-D蛋白抗原与一种肺炎链球菌蛋白或其免疫功能等同体组合。关于可以包括在这类组合中的优选蛋白/蛋白组合，参见以上“本发明的肺炎球菌蛋白”一节。
因此，本发明提供一种免疫原性组合物，所述组合物包含一种肺炎链球菌多糖-D蛋白缀合物和一种肺炎链球菌蛋白抗原。
本发明的多糖-D蛋白缀合物抗原最好在本发明的疫苗制剂中辅以佐剂。合适的佐剂包括铝盐例如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝，但也可以是钙盐、铁盐或锌盐，或可以是酰化酪氨酸、或酰化糖、阳离子或阴离子衍生化多糖、或聚磷腈的不溶性悬浮液。
对于老年人疫苗，最好是选择作为TH1型应答优先诱导物的佐剂。
关于具体的Th1佐剂，参见以上“本发明的Th1佐剂”。
在本发明的再一方面，提供用于医药的本文所述的免疫原或疫苗。
关于所述缀合物的疫苗制备/给予，参见以上“本发明的疫苗制剂”。
D蛋白也可以有利地用于抗中耳炎的疫苗，因为它本身是一种能够产生抗不可定型流感嗜血菌(ntHi)的B细胞介导的保护作用的免疫原。ntHi可以侵入宿主细胞，并且逃避由蛋白抗原诱发的B细胞介导的效应。本发明人已经意外地发现了一种提高D蛋白(或者其本身或者作为多糖的载体)作为中耳炎疫苗抗原的效力的方式。这通过用D蛋白作为佐剂来进行，使得在受治疗者中诱发强Th1应答，因此使免疫系统的细胞介导分支对D蛋白最优化。这一目的可以采用一种冻干组合物来意外地达到，所述组合物包含D蛋白和一种Th1佐剂(最好是3D-MPL)，所述冻干组合物可在给药前不久重建。因此，本发明还提供这类组合物、制备这类组合物的方法(通常将包含D蛋白和一种Th1佐剂的混合物冻干)和这样一种组合物在中耳炎治疗方面的应用。
广义来讲，本发明人预计将免疫原在一种Th1佐剂(参见“本发明的Th1佐剂”)、最好是3D-MPL存在下冻干，一般将增强抗所述免疫原的Th1免疫应答。因此，本发明适用于需要较强Th1免疫应答的任何免疫原。这类免疫原包括细菌蛋白抗原、病毒蛋白抗原和肿瘤蛋白抗原以及自身蛋白和肽。
实施例所述实施例说明本发明，但不限制本发明。
在上述构建体的基础上，产生用于D蛋白表达的最终构建体。从pMGNS1PrD中除去一个BamHI/BamHI片段。该DNA水解除去了除前3个N末端残基外的NS1编码区。再连接所述载体时，产生了具有以下N末端氨基酸序列的融合蛋白的编码基因-----MDP SSHSSNMANT-----NS1 D蛋白D蛋白不含前导肽或正常连接脂质链的N末端半胱氨酸。因此，该蛋白既不分泌到周质中，又不会被脂质化，并且以可溶性形式保留在胞质中。
通过于37℃热激，将最终的构建体pMG-MDPPrD导入AR58宿主菌株中。在卡那霉素存在下选择含质粒的细菌。通过用选定的特定内切核酸酶消化所分离的质粒DNA，证实D蛋白编码DNA插入片段的存在。该重组大肠杆菌菌株称为ECD4。
D蛋白的表达受控于λPL启动子/OL操纵基因。宿主菌株AR58在基因组中含有一个温度敏感型cI基因，它在低温下通过与OL结合，阻断λPL的表达。一旦温度升高，cI则从OL上释放，因此D蛋白表达。在发酵结束时，将细胞浓缩并冷冻。
如下从收获的细胞中提取并纯化D蛋白。将冷冻的细胞培养物沉淀解冻，并重悬于细胞破碎溶液(柠檬酸缓冲液pH6.0)，至最终OD650＝60。使该悬浮液2次于P＝1000巴下通过高压匀浆器。通过离心澄清细胞培养物匀浆，并通过过滤除去细胞碎片。在第一个纯化步骤中，将经过滤的裂解液加样至阳离子交换层析柱(SP Sepharose Fast Flow)上。PD通过离子相互作用与凝胶基质结合，并通过一步增加洗脱缓冲液的离子强度而被洗脱下来。
在第二个纯化步骤中，杂质保留在阴离子交换基质(Q SepharoseFast Flow)上。PD不结合至凝胶上，并且可以在流通液中收集。
在两个柱层析步骤中，通过OD监测分步收集物。通过超滤，浓缩含有所述纯化D蛋白的阴离子交换柱层析流通液。
最后，让含D蛋白的超滤保留物(retentate)通过0.2μm膜。化学活化和偶联化学活化条件和偶联条件对于每种多糖是特定的。在表1中给出了这些条件。将天然多糖(除PS3外)溶于NaCl 2M或注射用水中。评估对于所有血清型的最适多糖浓度。
由100mg/ml乙腈储备液，将CDAP(CDAP/PS比为0.75mg/mg PS)加入到多糖溶液中。1.5分钟后，加入0.2M三乙胺以获得特定活化pH。于25℃，在2分钟内在该pH下进行所述多糖的活化。将D蛋白(其量取决于原始PS/PD比)加入到活化多糖中，于特定pH下进行1小时偶联反应。然后用甘氨酸25℃30分钟并于4℃过夜，猝灭该反应。
采用以0.2M NaCl平衡的Sephacryl 500HR凝胶过滤柱，通过凝胶过滤纯化所述缀合物。
测定洗脱出的流分中的糖含量和蛋白含量。将所述缀合物合并，并在0.22μm除菌膜上过滤除菌。测定所述缀合物制剂中的PS/蛋白比。特征鉴定对每种缀合物进行了特征鉴定，并且符合表2所述的具体描述。通过间苯二酚试验测定多糖含量(μg/ml)，而通过Lowry试验测定蛋白含量(μg/ml)。通过所述浓度比确定最终的PS/PD比(w/w)。残留DMAP含量(ng/μg PS)用CDAP活化所述多糖，在所述多糖中引入了一个氰酸基团，并释放出DMAP(4-二甲氨基-吡啶)。通过SB发展的特定测定，测定残留DMAP含量。游离多糖含量(％)在与α-PD抗体一起温育、用硫酸铵饱和、然后离心之后获得的上清液上，测定于4℃保持或于37℃贮藏7天的缀合物的游离多糖含量。
用α-PS/α-PS ELISA来定量测定上清液中的游离多糖。也通过α-PD/α-PS ELISA测定缺乏缀合物的对照。减少游离多糖的量产生一种改进的缀合物疫苗。抗原性在夹心型ELISA中分析相同缀合物的原性，其中抗体的捕获和检测分别为α-PS和α-PD。游离蛋白含量(％)通过采用以SDS处理样品的方法，测定残留“游离”D蛋白的水平。将缀合物在0.1％SDS存在下于100℃加热10分钟，并注射到SEC-HPLC凝胶过滤柱(TSK 3000-PWXL)上。由于D蛋白是二聚体，因此由于用SDS使所述结构解离，有过高估计“游离”D蛋白水平的风险。分子大小(Kav)在SEC-HPLC凝胶过滤柱(TSK 5000-PWXL)上进行分子大小测定。稳定性在HPLC-SEC凝胶过滤(TSK 6000-PWXL)上测定于4℃保持并于37℃贮藏7天的缀合物的稳定性。
表2给出了所述11价疫苗的特征鉴定。
可以将所述蛋白缀合物吸附至磷酸铝上，并混合形成最终的疫苗。结论已经产生的免疫原性缀合物，因为已经表明所述缀合物是有希望的疫苗的组分。发现了用于每种所述11价疫苗的最佳质量的最终缀合肺炎球菌多糖产物的优化CDAP条件。通过上述改进(优化)CDAP法获得的这些肺炎球菌多糖的缀合物(无论何种载体蛋白，但最好是D蛋白)因此是本发明的再一方面。实施例2-改进(advanced)佐剂对所述11价肺炎球菌PS-PD缀合物疫苗在大鼠幼鼠中免疫原性的影响的研究采用以下佐剂制剂无、AlPO4、3D-MPL、AlPO4上的3D-MPL，用11价肺炎球菌PS-PD缀合物疫苗(按照实施例1的方法制备的)以每种多糖0.1μg的剂量免疫大鼠幼鼠。
对于11种抗原中的5种抗原而言，仅具有3D-MPL的制剂的免疫原性(最高GMC IgG)在统计学上(并且意外地)高于其它制剂。在高浓度和低浓度3D-MPL下情况都是如此。
调理素吞噬作用证实所述GMC结果。材料和方法免疫方案将OFA大鼠幼鼠随机分给不同的母鼠，当所述幼鼠接受第一次免疫时为7日龄。14天和28天后它们接受另外2次免疫。在第56天(第三次后28天)放血。所有的疫苗均皮下注射，每个疫苗组有10只大鼠。
用包含缀合至D蛋白上的以下多糖血清型的一种11价肺炎球菌缀合物疫苗免疫大鼠1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F。制剂为了检查不同改进佐剂的效应，缀合物的剂量保持恒定，为每种多糖0.1μg，佐剂AlPO4和3D-MPL以不同剂量和组合配制，包括根本无佐剂。这些以数值列于表3中用于参考。在AlPO4上的吸附按照以下方法制备浓缩的吸附型单价制剂。将50μg AlPO4(pH5.1)与5μg缀合多糖混合2小时。将pH调至pH5.1，并将混合物再放置16小时。加入1500mM NaCl，以使盐浓度为150mM。5分钟后，加入5mg/ml 2-苯氧乙醇。再经30分钟后，将pH调至6.1，并于4℃放置超过3天。稀释剂的制备在NaCl 150mM/5mg/ml苯氧乙醇中制备三种稀释剂。
A1mg/ml AlPO4。
B分别为250μg/ml和1000μg/ml AlPO4上的3D-MPL重量比3D-MPL/AlPO4＝5/20C分别为561μg/ml和1000μg/ml AlPO4上的3D-MPL重量比3D-MPL/AlPO4＝50/89吸附型11价制剂的制备以正确的比率混合11种浓缩的吸附型PS-PD单价制剂。加入补足量作为稀释剂A的AlPO4。需要时，将3D-MPL或者作为水溶液(非吸附型，方式1，参见下文)或者作为稀释剂B或C(以两个剂量吸附至AlPO4上的3D-MPL，方式2，参见下文)加入。方式1将3D-MPL作为水性悬浮液加入到联合吸附型缀合物中。将其混合到所述11价制剂中，于室温达10分钟，并贮藏于4℃直至给药。方式2将3D-MPL预吸附至AlPO4，然后加入所述联合吸附型缀合物(稀释剂B和C)中。为了制备1ml稀释剂，将3D-MPL(250或561μg)的水性悬浮液与NaCl 150mM pH6.3中的1mg AlPO4于室温混合5分钟。该溶液在NaCl pH6.1/苯氧基中稀释，并于4℃温育过夜。非吸附型11价制剂的制备将11种PS-PD缀合物在NaCl 150mM pH6.1苯氧基中混合并以正确的比率稀释。需要时，将3D-MPL作为溶液(非吸附型)加入。
在首次给予之前18天，制备用于所有注射的制剂。ELISA进行ELISA，以用衍生自WHO Workshop对ELISA法的方案测量大鼠IgG，以定量测定人血清中针对肺炎链球菌荚膜多糖的IgG抗体。实质上，将纯化的荚膜多糖直接包被在微量滴定板上。血清样品与所有肺炎球菌共有的并约以0.5％按照公开内容(EP 72513 B1)纯化的肺炎球菌多糖存在的细胞壁多糖(C物质)预温育。用JacksonImmunoLaboratories Inc.的试剂检测结合的鼠IgG。效价曲线以通过对数log公式建模的内部标准(单克隆抗体)作为参比。运用SaftMax Pro软件，进行计算。这些结果的最大绝对误差预期在2倍的范围内。相对误差低于30％。调理素吞噬作用采用CDC方案(采用分化的HL60细胞的肺炎链球菌调理素吞噬作用，版本1.1)与纯化的人PMN和幼兔补体，测定血清型3、6B、7F、14、19F和23F的调理素效价。改进包括使用in-house肺炎球菌菌株，并且用纯化的人嗜中性粒细胞PMN再接种吞噬性HL60细胞(在这些吞噬细胞之间有高度相关性)。另外，将3mm玻璃珠加入微量滴定板各孔中，以增加混合，这使得可以降低吞噬细胞细菌之比，该比率建议为400。结果IgG浓度测量的每种血清型的几何平均IgG浓度和PD示于表4-10。对于血清型6B、14、19F和23F，包括先前用四价制剂获得的结果用于对比。
在表4-10中突出了最高IgG浓度。3D-MPL组合物与3D-MPL/AlPO4组合物的统计学p值示于表11中。4号佐剂制剂(具有高剂量3D-MPL的非吸附型缀合物)对于11种情况中的9种产生最高GMC。在5/11种情况下，低剂量的MPL具有第二最高免疫原性。另外，对于所有血清型而言，加入佐剂产生的GMC高于通过改变剂量产生的GMC(数据未显示)，这对于血清型4、6B、7F、18C和23F而言是统计学显著的(来自95％CI的p＜0.05)。调理素吞噬作用在表4-8中显示了血清型3、6B、7F、14、19F和23F的混合血清的调理素吞噬作用结果。对于大部分而言，这些调理素效价证实了GMC IgG。实际上，对于血清型6B、19F、23F，与IgG浓度的相关性高于85％(数据未显示)。对于血清型3，重要的是注意到仅3D-MPL组诱发高于阈值的调理素活性。结论在该实验中，仅应用3D-MPL能够诱导最高IgG浓度是出乎意料的。
将通过改变佐剂获得的最大GMCIgG与通过改变PS剂量获得的最大GMC进行比较，发现3D-MPL在5/11的血清型中可以诱发显著更高的应答。
表11表明，当比较(比较配制方法和3D-MPL剂量)3D-MPL和3D-MPL/AlPO4组合物时，当仅用3D-MPL配制而不用3D-MPL+AlPO4配制时，其中5种所述多糖缀合物在免疫原性方面得到显著改进PS4、PS 6B、PS 18C、PS 19F和PS 23F。实施例3-组合对PS 4、PS 6B、PS 18C、PS 19F和PS 23F缀合物在成年大鼠中的免疫原性影响的研究成年大鼠用或者单独的、或者在多价组合物(或者四价、五价、七价或十价)中联合的肺炎球菌多糖-D蛋白缀合物疫苗免疫。以28天的间隔对每组10只大鼠免疫2次，在第28天和第42天(第二次给药后14天)获得试验放血血样。
通过ELISA测试血清中抗所述肺炎球菌多糖的IgG抗体。通过ELISA测定，所有缀合物均诱导特异性IgG抗体。表12显示了根据第二次给药后14天时IgG的浓度测定的、单价PS 6B、PS 18C、PS 19F和PS 23F D蛋白缀合物的组合对其在成年大鼠中免疫原性的影响。
对所有样品进行统计学分析，以确定联合时抗体浓度的差异是否显著。血清型PS 6B、PS 18C、PS 19F和PS 23F D蛋白缀合物中任一种在多价疫苗中的联合不显著改变其免疫原性。表1PS肺炎链球菌-D蛋白缀合物的具体活化/偶联/猝灭条件
表211价肺炎球菌PS-PD疫苗的具体描述(批号代码的第一个数字表示血清型)
表3. 在大鼠幼鼠中用11价肺炎球菌PS-PD测试的佐剂制剂的概述表
表4.采用不同佐剂用11价PS-PD第3次免疫大鼠幼鼠后第28天血清型6B的几何平均IgG浓度、血清转化和平均调理素效价(和与四价免疫进行比较)
表5.采用不同佐剂用11价PS-PD第3次免疫大鼠幼鼠后第28天血清型14的几何平均IgG浓度、血清转化和平均调理素效价(和与四价免疫进行比较)
表6.采用不同佐剂用11价PS-PD第3次免疫大鼠幼鼠后第28天血清型19F的几何平均IgG浓度、血清转化和平均调理素效价(和与四价免疫进行比较)
表7.采用不同佐剂用11价PS-PD第3次免疫大鼠幼鼠后第28天血清型23F的几何平均IgG浓度、血清转化和平均调理素效价(和与四价免疫进行比较)
表8.采用不同佐剂用11价PS-PD第3次免疫大鼠幼鼠后第28天血清型3和7F的几何平均IgG浓度、血清转化和平均调理素效价
表9.采用不同佐剂用11价PS-PD第3次免疫大鼠幼鼠后第28天血清型1、4和5的几何平均IgG浓度和血清转化
表10.采用不同佐剂用11价PS-PD第3次免疫大鼠幼鼠后第28天血清型9V、18C和PD的几何平均IgG浓度和血清转化
表11.当仅用3D-MPL配制相对于用3D-MPL/AlPO4配制时，某些肺炎球菌多糖缀合物的免疫原性是否改进的统计学显著性(p值)。低于0.01的p值被认为是高度显著性的。方式1和方式2表明配制的方法。
表12在用单独的或与四价、五价、七价或十价疫苗联合的1.0μg多糖-D蛋白缀合物第二次免疫成年大鼠后第14天的几何平均IgG浓度(μg/ml)。这些数据由5组独立实验综合。
实施例4-加入肺炎球菌溶血素和3D-MPL对PD缀合的11价多糖疫苗在小鼠中抗肺炎球菌性肺部定居的保护效应的有益影响免疫读出肺炎球菌容血素特异性血清IgG的ELISA剂量Maxisorp Nunc免疫板用100μl/孔在PBS中稀释的2μg/ml重组天然肺炎球菌溶血素(PLY)于37℃包被2小时。用NaCl 0.9％ Tween-200.05％缓冲液洗板3次。然后，将抗PLY血清参考的2倍连续稀释液(在PBS/Tween-20 0.05％中，100μl/孔)作为标准曲线(始于670ng/ml IgG)加入，在搅拌下将血清样品(始于1/10稀释度)于20℃温育30分钟。经如上所述洗涤后，在搅拌下，将在PBS/Tween-20 0.05％中稀释5000倍的过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(Jackson)于20℃温育30分钟(100μl/孔)。洗涤后，将板于室温与100μl/孔显色缓冲液(100mMpH4.5柠檬酸缓冲液中的OPDA0.4mg/ml和过氧化氢0.05％)温育15分钟。加入50μl/孔HCl 1N终止显色。用Emax免疫读数仪(Molecular Devices)于490nm和620nm读出光密度。运用SoftMaxPro软件，通过4参数数学方法计算抗体效价。溶血抑制进行该测定以测量血清抗体抑制肺炎球菌溶血素(PLY)溶血活性的能力。为了消除胆固醇(易与PLY相互作用)，将血清样品如下处理2次将其与等体积氯仿混合，然后在搅拌下温育45分钟。以1000rpm离心10分钟后，收集上清液。在96孔小平板(Nunc)中稀释(在1mM二硫苏糖醇，0.01％BSA，15mM TRIS，150mM NaCl，pH7.5中2倍连续稀释)清除胆固醇的血清。每孔中加入50μl含4 HU(溶血单位)PLY的溶液，并于37℃温育15分钟。然后，加入100μl绵羊红细胞(1％溶液)于37℃达30分钟。以1000rpm离心10分钟后，收集上清液(150μl)，并将其置于另一96孔小平板中，以读出405nm的光密度。结果以中点稀释效价表示。肺炎球菌溶血素的化学解毒将重组天然肺炎球菌溶血素(PLY)对磷酸盐50mM NaCl 500mMpH7.6缓冲液透析。在偶尔搅拌下于39.5℃进行所有以下步骤。第1天，将Tween-80 10％(1/250v/v)、N-乙酰色氨酸57.4mM pH7.6(3/100v/v)、甘氨酸2.2M的磷酸缓冲液(1/100v/v)和10％甲醛的磷酸缓冲液(3/100v/v)加入PLY溶液中。第2天和第3天，分别以3/100和2/100v/v的比率再加入10％甲醛。在偶尔搅拌下继续于39.5℃温育直至第7天。最后，将PLY对磷酸盐50mM NaCl 500mM pH7.6缓冲液透析。在溶血测定中证明PLY完全失活。在OF1小鼠中肺炎球菌的鼻内攻击在麻醉下，给7周龄OF1雌性小鼠鼻内接种5.105CFU适应小鼠的肺炎链球菌血清型6B。攻击后6小时取出肺并将其在Todd HewithBroth(THB，Gibco)培养基中匀浆(Ultramax，24000rpm，4℃)。将肺匀浆的10倍连续稀释液接种到含补充酵母提取物的THB琼脂的培养皿中，于37℃培养过夜。以CFU数/小鼠测定肺炎球菌肺感染，并以对数加权平均表示。检测极限是2.14log CFU/小鼠。实施例4A 3D-MPL对抗肺炎球菌溶血素免疫应答的佐剂效应在该实施例中，我们评估了3D-MPL佐剂对抗天然重组肺炎球菌溶血素(PLY，由J.Paton提供，Children’s Hospital，North Adelaide，澳大利亚)及其化学解毒对应物(DPLY)免疫应答的影响。如上所述进行化学解毒。
在第0、14和21天，用包含在AAlPO4 100μg；或BAlPO4 100μg+5μg 3D-MPL(3脱-O-酰化单磷酰基脂质A，有Ribi Immunochem供应)中的1μg PLY或DPLY，肌内免疫每组10只雌性6周龄Balb/c小鼠。

图1A和1B显示在第三次免疫后血清中测量的ELISA IgG和溶血抑制效价(HLI)。
无论何种抗原，都在用补充3D-MPL的制剂接种的动物中诱导最佳免疫应答。有趣的是，当用AlPO4+3D-MPL一起给予时，DPLY的免疫原性与PLY相同，而在AlPO4制剂中DPLY是较弱的免疫原。这显示出3D-MPL有利的改进抗解毒肺炎球菌溶血素抗体应答的能力。
在含肺炎球菌溶血素的组合物中，可能最好使用化学解毒的肺炎球菌溶血素，而非突变解毒的肺炎球菌溶血素。这是因为迄今获得的解毒突变体仍具有残留的毒素活性，而化学解毒的肺炎球菌溶血素不具此活性。因此，认为本发明的另一方面一般而言是包含已经化学解毒用于疫苗的肺炎球菌溶血素(或肺炎球菌溶血素突变体)的组合物，应该加入Th1佐剂，最好是3D-MPL。本发明提供这类组合物。也设计了提高免疫原性组合物中化学解毒肺所述炎球菌溶血素的免疫应答的方法，包括加入Th1佐剂(最好是3D-MPL)到组合物中的步骤。实施例4B 加入减毒突变肺炎球菌溶血素和3D-MPL佐剂对在用血清型6B鼻内攻击的OF1小鼠中PD缀合的11价多糖疫苗抗肺炎球菌肺定居保护效应的有益影响在本实施例中，我们评估了与经典的AlPO4吸附型11价多糖-D蛋白缀合物制剂相比，含所述11价多糖-D蛋白缀合物、减毒突变肺炎球菌溶血素抗原(PdB，WO90/06951)和AlPO4+3D-MPL佐剂的疫苗的预防功效。
第0天和第14天，用含A50μgAlPO4；B0.1μgPS/血清型的PD缀合的11价多糖疫苗+50μgAlPO