专利名称：获得流感样本中流感病毒核酸的方法及其专用引物的制作方法在历史上有很多种瘟疫给人类带来大量死亡和深重灾难。近百年来，由于医学科学的发展和进步，大多数瘟疫得到了控制，唯独流感，人类还没有找到制服它的有效途径和方法。流感病毒属于正黏病毒科，有甲型、乙型与丙型流感病毒三个属。流感病毒因其具有较强的传染性，被认为是影响公共卫生安全的重要危险因素，其中以甲型流感危害最为严重。特别是2009年3月于墨西哥发现、并在世界范围内引起广泛传播的新甲型流感病毒 (swine H1N1)的暴发流行，更加重了人们对于流感病毒传播的担忧。流感由于其不断变异而造成周期性流行，其中变异最为明显的就是甲型流感病毒。该病毒抗原变异后，传染性大，传播迅速，易发生大范围流行。因此，研究病毒抗原性、 致病性和耐药性变异，分析新型流感流行病学规律、临床特征、追踪严重程度变化，科学评估流感大流行风险，对全球依法科学规范有序地防控流感大流行具有重要意义。为了及时了解流感病毒的流行和变异情况，开展以实验室监测是必要的手段。但是，在实验室进行流感监测中，如果采用细胞进行病毒分离的方法进行实验室监测，不但周期长而且对新发生的流感变异株需要更高的实验条件。这些因素造成了流感病毒分离的周期增加。
本发明的一个目的是提供一种用于扩增流感病毒核酸的引物对。本发明所提供的用于扩增流感病毒核酸的引物对，由序列表中序列9所示的引物和序列表中序列10所示的引物组成。所述流感病毒为甲型流感病毒。所述甲型流感病毒为甲型H3N2亚型流感病毒。本发明的另一个目的是提供获得流感病毒核酸的方法。本发明所提供的获得流感病毒核酸的方法，包括以下步骤以感染流感病毒的样本的总RNA为模板，用所述引物对进行RT-PCR扩增，得到 RT-PCR扩增产物，即得到所述流感病毒的核酸。所述流感病毒为甲型流感病毒。所述甲型流感病毒为甲型H3N2亚型流感病毒。所述样本为临床流感样病例的咽拭子。所述RT-PCR扩增的反应条件如下42°C 60分钟；94°C预变性2分钟；然后按照下列参数进行5次循环94°C变性30秒，45°C复性30秒，68°C延伸3分钟；再按照下列参数进行35次循环94°C变性30秒，57°C复性30秒，72°C延伸3分钟；循环反应结束后在68°C保持7分钟。所述获得流感病毒核酸的方法在制备流感疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。所述获得流感病毒核酸的方法在筛选预防和/或治疗流感的药物中的应用也属于本发明的保护范围。通过本专利的方法，不用进行病毒分离工作直接从临床样本的核酸提取物中扩增流感病毒的基因组，大大简化流感病毒基因研究的程序、节省实验成本。基于本方法，通过设计流感病毒的片段扩增引物，能够直接成功扩增出流感病毒的所有片段。图1为临床样品(具体为咽拭子)中流感病毒核酸的RT-PCR扩增结果。 4
3、RT-PCR 扩增过程本专利采用一步法试剂盒(SuperScript HI One-Step RT-PCR System with Platinum iTaq DNA Polymerase，货号12574-026)进行 RT-PCR 片段扩增。具体方法如下PCR扩增的引物序列如下IFA-U-F :AGCRAAAGCAGG (序列表中序列 9)，IFA-U-R :AGTAGAAACAAGG (序列表中序列 10)。RT-PCR扩增的体系为25ul
体系用量(ul)水5.5IOuMPrimers上0.5IOuMPrimers下0.52 X buffer12.5Super Script III1RNA5总体积25RT-PCR扩增的反应程序如下42V 60分钟；94°C预变性2分钟；然后按照下列参数进行5次循环94°C变性30 秒，45°C复性30秒，68°C延伸3分钟；再按照下列参数进行35次循环94°C变性30秒，57°C 复性30秒，72°C延伸3分钟；循环反应结束后在68°C保持7分钟。4、结果对RT-PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。图1中，泳道3 为DNA Maker，泳道1为阳性对照株的扩增结果，泳道2为提取临床样本(咽拭子)核酸使用本专利方法扩增获得的结果。各扩增片段分别为PB2 (2. 3kp)、PBl (2. 3kp)、PA (2. 2kp)、 HA(1. 8kp)、ΝΡ(1· 6kp)、ΝΑ(1· 4kp)、Μ(1· Okp)、NS (0. 9kp)。回收PCR产物进行测序，图1所示的每个扩增片段的测序结果分别为PB2的核苷酸序列如序列表中序列1所示；PBl的核苷酸序列如序列表中序列2所示；PA的核苷酸序列如序列表中序列3所示；HA的核苷酸序列如序列表中序列4所示；NP的核苷酸序列如序列表中序列5所示；NA的核苷酸序列如序列表中序列6所示；M的核苷酸序列如序列表中序列 7所示；NS的核苷酸序列如序列表中序列8所示。将以上样本各扩增片段的测序结果与已经发布的甲型H3N2亚型流感病毒基因组序列比较，结果一致，证明本发明的方法结果正确、可靠。


本发明公开了获得流感样本中流感病毒核酸的方法及其专用引物。本发明所提供的用于扩增流感病毒核酸的引物对，由序列表中序列9所示的引物和序列表中序列10所示的引物组成。本发明所提供的获得流感病毒基因组DNA的方法，包括以下步骤以感染流感病毒的样本的总RNA为模板，用所述引物对进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物，即得到所述流感病毒的核酸。通过本专利的方法，不用进行病毒分离工作直接从临床样本的核酸提取物中扩增流感病毒的基因组，大大简化流感病毒基因研究的程序、节省实验成本。基于本方法，通过设计流感病毒的片段扩增引物，能够直接成功扩增出流感病毒的所有片段。