专利名称：用于生产流感疫苗的方法用于生产流感疫苗的方法相关申请的交叉引用 本申请要求保护2009年10月27日提交的GB 0918830. I和2010年4月29日提交的US 61/329230 的权益。依照37C. F. R. § 1.71(E)的版权通告 本专利文件的部分公开内容包含受版权保护的材料。版权所有人不反对任何人传真复制专利文件或专利公开内容，因为它出现在专利和商标局专利档案或记录中，但除此以外在任何情况下均保留全部版权。背景 发明领域。 本发明涉及用于制备适用于疫苗的流感抗原和包含所述抗原的药物组合物的方法。相关背景描述 流感病毒是世界上存在的影响人和家畜两者的最遍在的病毒之一。流感导致显著的经济负担、发病率甚至死亡率。流感病毒是一种RNA包膜病毒，其颗粒的直径大小约为125 nm。它基本上由以下组成内部核衣壳或与核蛋白结合的核糖核酸(RNA)核心，外部环绕着具有脂质双层结构和外部糖蛋白的病毒包膜。病毒包膜的内层主要由基质蛋白组成，外层大部分由宿主来源的脂质物质组成。流感病毒包含两种表面抗原糖蛋白神经氨酸酶(NA)和血凝素(HA)，其在颗粒表面呈刺突，长为10-12 nm。正是这些表面蛋白质，特别是血凝素决定流感亚型的抗原特异性。病毒株是依据以下分类的宿主物种的起源、地理位置和分离年份，序列号和对于流感A，依据HA和NA亚型的血清学性质。对于甲型流感病毒，已鉴定出16个HA亚型(HI-HI 6)和 9 个NA亚型(N1-N9) [Webster RG等· Evolution and ecology of influenzaA viruses (甲型流感病毒的进化和生态学)· Microbiol. Rev. 1992; 56:152-179 ；Fouchier RA 等.Characterization of a Novel Influenza A Virus HaemagglutininSubtype (H16) Obtained from Black-Headed Gulls (新的甲型流感病毒血凝素亚型(H16)的表征).J. Virol. 2005;79:2814-2822)。自1918年以来，已在水生禽类中找到所有HA和NA亚型的病毒，但只有3个HA亚型(H1、H2和H3)和2个NA亚型(NI和N2)在人群中建立了稳定的谱系。对于乙型流感病毒仅鉴定出一个HA亚型和一个NA亚型。新的流感病毒以不可预测的时间间隔出现，具有与之前季节传播的毒株完全不同的亚型的血凝素抗原。此时，与先前在人类传播的毒株的相应蛋白质不同，所得抗原可变化20%到50%。称为“抗原性转变”的这种现象可导致病毒逃逸“群体免疫”并形成大流行。换句话说，当出现人群对之无免疫力的新的流感病毒时，便发生流感大流行。大流行期间，抗病毒药可能不充足或有效地满足需要，有流感风险的个体数将多于大流行间(interpandemic)时期的个体数，因此具有大量生产潜力及具有有效分配和给药潜力的合适疫苗的开发是非常重要的。使用于季节性(大流行间)流感疫苗的抗原生产最大化的改进方法也同样重要，因为人群总在老化，对流感疫苗的需要增加。本发明解决这种需求。发明概述第一个方面，本发明提供用于产生裂解流感病毒(split influenza virus)制备物或亚单位流感制备物(subunit influenza preparation)的方法,所述方法包括以下步骤(i)提供全病毒制备物；( )在第一去污剂存在下裂解全病毒制备物；(iii)将叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )加到所得裂解病毒制备物中；和(iv)将裂解病毒制备物过滤。本发明还涉及通过或可通过所述方法获得的裂解流感病毒制备物和/或亚单位流感病毒制备物。本发明还涉及用于制备药物组合物或免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤(i)提供通过按本文所述的本发明方法产生的裂解流感病毒制备物或亚单位流感制 备物，(ii)将所述裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物与药学上可接受的载体混合，以制备药物组合物或免疫原性组合物。本发明还涉及通过或可通过本发明的方法获得的药物组合物或免疫原性组合物。本发明还涉及在人受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括给予受试者本文所述的药物组合物或免疫原性组合物。本发明还涉及用于治疗或预防流感疾病或感染的本文所述药物组合物和/或免疫原性组合物。本发明还涉及包含流感病毒血凝素(HA)和去污剂的抗原制备物，其中去污剂(Kg/ml)与血凝素(Pg/ml)的重量比介于I. 5和15之间。本发明还涉及用于产生裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物的方法，所述方法包括以下步骤(i)提供全流感病毒制备物，(ii)在以适于防止病毒颗粒一旦裂解便聚集的量加入的去污剂存在下，裂解全病毒制备物。本发明还涉及包含一种或多种按照本文所述任何方法制备的裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物的疫苗。附图简述 图I公开了各种流感疫苗生产方法。图2公开了在不加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )的情况下在若干生产步骤后HA的丧失,8/1 :纯化的单价裂解病毒原液(split virus bulk) ;8/2和8/3 逐级过滤；8/4 :灭活。图3公开了在加入或不加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )的情况下所产生的HlNlv单价原液的SDS-PAGE。图4公开了在用不加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )的情况下制备的未加佐剂甲型/加利福尼亚/7/2009裂解疫苗免疫的BALB/c小鼠中II次免疫后第14 天的 HI 效价(GMT +/- CI95)。图5公开了在用加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )的情况下制备的未加佐剂甲型/加利福尼亚/7/2009裂解疫苗免疫的BALB/c小鼠中II次免疫后第14天的 HI 效价(GMT +/- CI95)。图6公开了在不加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )-14PI的情况下在用于AS03A佐剂化疫苗甲型/加利福尼亚/7/2009 NYMC X-179A的BALB/c小鼠中的HI 效价(GMT +/- CI95)。图7公开了在加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )-14PI的情况下，BALB/c小鼠中AS03A佐剂化疫苗甲型/加利福尼亚/7/2009 NYMC X-179A的血凝效价(GMT +/- CI95)抑制。图8公开了在不加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )-14PII的情况下，BALB/c小鼠中AS03A佐剂化疫苗甲型/加利福尼亚/7/2009 NYMC X-179A的血凝效价(GMT +/- CI95)抑制。图9公开了在加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )-14PII的情况下，BALB/c小鼠中AS03A佐剂化疫苗甲型/加利福尼亚/7/2009 NYMC X-179A的血凝效价(GMT +/- CI95)抑制。 详述
本发明人证实叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )与裂解病毒制备物联合使用增加病毒制备物的抗原组分的产量。该方法增加来自大流行毒株和季节性(大流行间)毒株的抗原的产量。高产是需要的，因为例如当这类疫苗剂量当下不足时，其允许生产更大量的疫苗剂量。叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X_100 )与裂解病毒制备物或亚单位制备物联合使用还提高流感抗原(例如HA或NA)的纯度。虽然不希望受理论束缚，但叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )与裂解流感病毒制备物联合使用有助于防止裂解病毒颗粒的聚集，并允许流感疫苗更易过滤，这就在整体上或部分地解释了当使用叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )时所观察到的产量增加。本发明总的来说涉及用于产生裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物的方法，所述方法包括以下步骤(i)提供全病毒制备物，(ii)在第一去污剂存在下裂解全病毒制备物，(iii)将叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )加到所得裂解病毒制备物中；和(iv)将裂解病毒制备物过滤。另一方面，本发明提供用于产生裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物的方法，所述方法包括以下步骤(i)提供全病毒制备物；(ii)在第一去污剂存在下裂解全病毒制备物，和(iii)将叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )加到所得裂解病毒制备物中；和Qv)将裂解病毒制备物过滤，其中将第二去污剂以至少0. 1% (v/v)的浓度用于步骤(iii)中。所述方法适宜在步骤(iii)后还可包括将所述裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物灭活的步骤。因此在第三个方面，本发明提供用于产生裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物的方法，所述方法包括以下步骤(i)提供全病毒制备物，( )在去污剂存在下裂解全病毒制备物；(iii)将叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )加到所得裂解病毒制备物中；(iv)将所述裂解病毒制备物灭活；和(V)将裂解病毒制备物过滤。去污剂
以前使用溶剂/去污剂处理来生产裂解流感病毒制备物，例如磷酸三正丁酯或与聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80 "*或POLYSORBATE 80 )组合的二乙醚(称为“吐温-乙醚”裂解法)，该方法仍用于一些生产设备中。现在使用的其它裂解剂包括去污剂或蛋白水解酶或胆汁盐，例如在专利号DD 155 875或WO 02/097072 (US7316813B2)中描述的脱氧胆酸钠，其通过引用结合到本文中。可用作裂解剂的去污剂包括阳离子去污剂(例如鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB))、其它离子去污剂(例如硫酸月桂酯、牛磺脱氧胆酸盐)或非离子去污剂，例如上述去污剂，包括叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )(例如Lina等，2000，Biologicals 28，95-103中描述的方法)和Triton N-101或者任两种或更多种去污剂的组合。在一方面，第一去污剂选自离子去污剂(例如阴离子或阳离子去污剂)、非离子去污剂、两性去污剂或其组合。合适去污剂的实例是脱氧胆酸钠、CTAB和叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 ) ο第一去污剂还可用于与其它去污剂(例如上文列举的去污剂)组合，并且可以是非离子去污剂的组合，例如脱氧胆酸钠和聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80 "*或 POLYSORBATE 80 )的组合或脱氧胆酸钠和叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )的组合。在一方面，第一去污剂不是叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )。在一个具体的实施方案中，在最终的裂解流感抗原制备物或亚单位抗原制备物中存在残留量的第一去污剂和叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )。在本发明的一个具体实施方案中，第一去污剂是叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )ο在本发明的一个备选实施方案中，第一去污剂是脱氧胆酸钠。叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )的同义词包括但不限于聚二乙醇对(1，I, 3, 3-四甲基丁基)-苯基醚、羊基酌■乙氧基化物、聚氧乙烯羊基苯基醚、4-羊基酌·聚乙氧基化物、Mono 30、TX-100、辛苯昔醇-9、辛苯昔醇10、Χ_100和辛基酚环氧乙烷缩合物。在一方面，叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )与其它去污剂联合使用，例如上文列举的去污剂(例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80 或POLYSORBATE 80 )，例如离子去污剂(例如阴离子或阳离子去污剂)、非离子去污剂、两性去污剂或其组合。可在裂解流感制备物过滤之前或期间加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITONX-100 )以改进过滤。因此，在本发明的一个实施方案中，提供用于产生裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物的方法，所述方法包括以下步骤(i)提供全病毒制备物；(ii)在第一去污剂存在下裂解全病毒制备物；(iii)将叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITONX-100 )加到所得裂解病毒制备物中；和(iv)将裂解病毒制备物过滤，其中步骤(iii)和(iv)同时进行。与在裂解后无去污剂处理的方法相比，加入裂解流感病毒制备物中的叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )为适于提高HA产量的量。适宜与在裂解后无去污剂处理的所得结果相比较，以评价提高的HA，例如正如通过0.2μπι滤膜过滤后对[ΗΑ]的SRD测定所测量的(J. Μ. Wood 等An improved single radial immunodiffusion techniquefor the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potencydetermination of inactivated whole virus and subunit vaccines (用于流感血凝素抗原测定的改进的径向免疫扩散技术适于灭活全病毒疫苗和亚单位疫苗的功效测定).J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247 ；J. M. Wood 等，International collaborativestudy of single radial diffusion and Immunoelectrophoresis techniques for theassay of haemagglutinin antigen of influenza virus (用于测定流感病毒血凝素抗原的径向扩散和免疫电泳技术的国际合作研究)· J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330)。因此，在一个实施方案中，提供本发明的方法，其中叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )以足以提高过滤的裂解病毒制备物中的HA产量的量存在。在一个具体的实施方案中，提供本发明的方法，其中，与其中在过滤前未将叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )加入裂解病毒制备物中的方法的HA相比，经过滤的裂解流感病毒制备物或亚单位制备物中的HA浓度大超过50%、75%、100%、150%、200%或250%。
在一个具体的实施方案中，叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )以大于
0.025% (w/v)的量存在。在一个具体的实施方案中，叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITONX-100 )以0. 1-1. 5%的量存在。在另外其它的实施方案中，叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )以0. 1-0. 8%的量存在。在又一个实施方案中，叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )以 0. 1-0. 4% (例如 O. 25% (w/v))的量存在。在一方面，本发明的方法包括在灭活步骤前、适宜地基本上恰在灭活之前的过滤步骤，且在过滤步骤之前或期间加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )。因此，在一方面，本发明涉及用于产生裂解流感病毒制备物或亚单位流感病毒制备物的方法，所述方法包括以下步骤(i)提供全病毒制备物，( )在第一去污剂存在下裂解全病毒制备物，(iii)将叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )加到所得裂解病毒制备物中，(iv)将制备物过滤，和(V)将所述经过滤的裂解病毒制备物灭活。在本发明的一个备选实施方案中，提供用于产生裂解流感病毒制备物或亚单位流感病毒制备物的方法，所述方法包括以下步骤(i)提供全病毒制备物，(ii)在第一去污剂存在下裂解全病毒制备物，(iii)将叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )加到所得裂解病毒制备物中，和(iv)将经灭活的裂解病毒制备物过滤，还包括在步骤(iii)之后和在步骤(iv)之前将裂解病毒制备物灭活的步骤。适宜通过I 0.45 μπι (例如0·2μπι或0.22Mm)的过滤器进行过滤。在一方面，
过滤之前是预过滤步骤。在一方面，预过滤产物经超声处理以利于过滤步骤。在一方面，叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇存在于裂解过程期间，即除第一去污剂以外还存在叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 ) ο在一方面，叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇在裂解期间以足以防止病毒颗粒一旦裂解便聚集的量存在，适宜通过裂解病毒制备物的过滤功效确定，例如经过滤后的HA浓度确定。本发明的一个备选方面包括用于产生裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物的方法，所述方法包括以下步骤(i)提供全病毒制备物，( )在叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )存在下裂解全病毒制备物，其以适宜在过滤后防止HA产量损失的量加入，其中产量损失通过与没有这类去污剂存在的方法进行比较确定。
在这个方面，叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )在裂解期间存在以提高HA的产量。裂解后可能不需要使用叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )。叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )可有助于裂解过程，但这不是必需的。叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )适宜能够有助于减少将制备物过滤时出现的HA的损失。因此，在一个实施方案中，提供本发明的方法，其中步骤(ii)和(iii)同时进行。流感毒株
本文所述全流感病毒制备物、亚单位流感病毒制备物或裂解流感病毒制备物可来源于任何流感毒株。在本发明的一个实施方案中，本文所述全流感病毒制备物、亚单位流感病毒制备物或裂解流感病毒制备物来源于甲型流感毒株或乙型流感毒株。在一方面，甲型流感病毒毒株具有HI、H3、H7、H9或H5血凝素亚型。在一方面，病毒是大流行毒株或潜在的大流行 (例如HlNlv或H5N1)毒株或非大流行(大流行间)(例如H3N2)毒株。本文提供了数据，表明本发明对大流行毒株(HINlv，例如甲型/加利福尼亚/7/2009 X-179A)和大流行间H3N2毒株两者具有优势。本发明的全流感病毒制备物、亚单位流感病毒制备物或裂解流感病毒制备物来源于合适毒株，其包括但不限于
HlNl毒株
甲型/新喀里多尼亚/20/99样毒株(like strain)、甲型/新喀里多尼亚/20/99(IVR-116)、甲型/所罗门群岛/3/2006样病毒、甲型/所罗门群岛/3/2006 (IVR-145)、甲型/布里斯班/59/2007样病毒、甲型/布里斯班/59/2007 IVR-148、甲型/新加坡/6/86样、甲型/新加坡/6/86、甲型/德克萨斯/36/91、甲型/拜恩/7/95样、甲型/约翰内斯堡/82/96 (NIB-39)、甲型/北京/262/95样毒株、甲型/北京/262/95 (X-127)、甲型/新喀里多尼亚/20/99样毒株、甲型/新喀里多尼亚/20/99 (IVR-116)、甲型/所罗门群岛/3/2006样、甲型/所罗门群岛/3/2006 (IVR-145)、甲型/布里斯班/59/2007样病毒、甲型/布里斯班/59/2007 IVR-148H3N2毒株
甲型/悉尼/5/97样毒株、甲型/悉尼/5/97 (IVR-108)、甲型/莫斯科/10/99样毒株、甲型/巴拿马/2007/99 (RESVIR-17)、甲型/福建/411/2002样毒株、甲型/怀俄明/3/2003(X-147)、甲型/惠灵顿/1/2004样毒株、甲型/惠灵顿/1/2004 (IVR-139)、甲型/加利福尼亚/7/2004 样毒株、甲型/New York/55/200 (NYMC X-157)、甲型 / 威斯康星/67/2005样毒株毒株、甲型/威斯康星/67/2005 (NYMC X-161-B)、甲型/布里斯班/10/2007样病毒、甲型/布里斯班/10/2007 (IVR-147)、甲型/乌拉圭/716/2007 NYMC X-175C、甲型/北京/353/89样毒株、甲型/贵州/54/89、甲型/北京/353/89、甲型/北京/32/92、甲型/山东/9/93、甲型/约翰内斯堡/33/94、甲型/武汉/359/95样毒株、甲型/南昌/933/95(RESVIR-9)、甲型/悉尼/5/97样毒株、甲型/悉尼/5/97 (IVR-108)、甲型/莫斯科/10/99样毒株、甲型/巴拿马/2007/99 (RESVIR-17)、甲型/福建/411/2002样毒株、甲型/怀俄明/3/2003 (X-147)、甲型 / 加利福尼亚/7/2004 样毒株、甲型 / 纽约/55/2004 NYMC (X-157、甲型/威斯康星/67/2005 (NYMC X-161)、甲型/威斯康星/67/2005样毒株、甲型/威斯康星/67/2005 (NYMC X-161-B)、甲型/布里斯班/10/2007样病毒、甲型/乌拉圭/716/2007NYMC X-175C乙型毒株
乙型/北京/184/93样毒株、乙型/山梨/166/98、乙型/四川/379/99样毒株乙型/约翰内斯堡/5/99、乙型/四川/379/99样毒株、乙型/约翰内斯堡/5/99乙型/香港/330/2001样毒株、乙型/山东/7/97、乙型/香港/330/2001样毒株、乙型/布里斯班/32/2002、乙型/上海/361/2002样毒株、乙型/江苏/10/2003、乙型/马来西亚/2506/2004样毒株、乙型/马来西亚/2506/2004、乙型/弗罗里达/4/2006样病毒
乙型/布里斯班/3/2007、乙型/山形/16/88、乙型/巴拿马/45/90、乙型/哈尔滨/7/94、乙型/北京/184/93样毒株、乙型/北京/184/93样毒株、乙型/山梨/166/98、乙型/四川/379/99样毒株、乙型/约翰内斯堡/5/99、乙型/香港/330/2001样毒株、乙型/山东/7/97、乙型/上海/361/2002样毒株、乙型/江苏/10/2003、乙型/马来西 亚/2506/2004样毒株、乙型/马来西亚/2506/2004、乙型/弗罗里达/4/2006样病毒、乙型/布里斯班/3/2007、乙型/布里斯班/60/2008样病毒、乙型/布里斯班/60/2008
全流感病毒制备物、亚单位流感病毒制备物或裂解流感病毒制备物来源于一种或多种流感病毒毒株，其适宜地为大流行间(季节性)毒株或与大流行暴发有关的或具有与大流行暴发有关的潜力的毒株。大流行间毒株例如为在大流行间期间在全球传播的毒株，例如但不限于H1N1、H1N2、H3N2或乙型毒株。市售可得的流感疫苗是三价组合，包括I种乙型流感毒株和2种甲型流感毒株(H1N1、H3N2)。赋予其引发大流行或与大流行流感毒株有关的流感疾病暴发的潜力的流感病毒毒株的特征是与目前传播的毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，因此几乎所有人都是无免疫的；它能够在人群中水平传播；并且对人类是致病性的。新的血凝素可以是在一段延长的时期(或许数十年)内在人群中不明显的血凝素，例如H2。或者它可以是之前未在人群中全球传播的血凝素，例如存在于禽类物种(鸟类)中的H5、H9、H7或H6。在任一种情况下，大多数或至少一大部分人口或甚至整个人口之前未遇到该抗原和/或对其无免疫。目前，经WHO鉴定为可能引起人类大流行的甲型流感病毒是高致病性H5N1禽流感病毒。因此，本文公开的大流行疫苗适宜包含H5N1、H9N2或H7N1。流感病毒毒株可以是大流行毒株。合适的大流行毒株为(但不限于)H5N1、H5N8、H5N9、H7N4、H9N2、H7N7、H7N3、H2N2 和 H7N1。人的其它大流行毒株H7N3、H10N7、H5N2 和H7N2。是大流行毒株或易与大流行有关的毒株的流感毒株在本文中可简称为“大流行毒株”。本文所述全流感病毒制备物、亚单位流感病毒制备物或裂解流感病毒制备物可以是鸡卵来源的或细胞培养物来源的。例如，可通过使流感病毒在鸡卵中生长，并从收获的尿囊液中纯化，从而从常规含胚卵方法得到本发明的全流感病毒制备物、亚单位流感病毒制备物或裂解流感病毒制备物。可在短期内收集大量鸡卵。或者，可采用细胞或细胞培养物使病毒生长或表达重组流感病毒表面抗原的任何新的生产方法得到。用于病毒生长的合适的细胞基底(cell substrate)包括例如狗肾细胞(例如MDCK或来自MDCK、MDCK样细胞克隆的细胞)、猴肾细胞(例如AGMK细胞包括Vero细胞)、合适的猪细胞系或适于生产用于疫苗目的的流感病毒的任何其它哺乳动物细胞类型。合适的细胞基底还包括人细胞，例如MRC-5细胞或Per. C6细胞系。在一个具体的实施方案中，本发明的全流感病毒制备物、亚单位流感病毒制备物或裂解流感病毒制备物得自原代细胞(例如鸡胚成纤维细胞)，还包括禽细胞系，例如鸡或鸭细胞系(例如EBx细胞系，例如公开于W003/076601 (US2004058441A1)和W008/129058(US2010062489A1)的来源于鸡的EB14或来源于鸭胚干细胞的EB24或EB66)。合适的昆虫细胞为Sf9或Hi5。在一个具体的实施方案中，本发明的全流感病毒制备物、亚单位流感病毒制备物或裂解流感病毒制备物来源于EB66细胞。在一方面，本发明涉及本发明方法获得的或可获得的裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物。在一方面，本发明涉及用于制备药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤(i)通过本文公开的任何方法提供裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物，和(ii)将所述裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物与药学上可接受的载体混合以制备疫苗。 在一方面，本发明涉及通过本发明的任何方法获得的或可获得的药物组合物和/或免疫原性组合物。含有裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物的本发明的药物组合物在本文可称为免疫原性组合物或疫苗。医学治疗
在一方面，本发明涉及诱导人受试者的免疫应答的方法，所述方法包括给予受试者本文所述的本发明的药物组合物和/或免疫原性组合物或疫苗。在本发明的又一个实施方案中，提供用于药物的本文所述的药物组合物/免疫原性组合物或疫苗。在本发明的又一个实施方案中，提供本文所述的药物组合物/免疫原性组合物或疫苗，其用于治疗和/或预防受试者中由流感病毒引起的疾病。在本发明的又一个实施方案中，提供本文所述的药物组合物/免疫原性组合物或疫苗在制备用于治疗和/或预防受试者中由流感病毒引起的疾病的药物中的用途。在本发明的一个具体实施方案中，给予本文所述的药物组合物/免疫原性组合物或疫苗的受试者为无免疫应答的。在一个具体的实施方案中，受试者超过60岁，特别是超过65岁或更大岁数。在又一个实施方案中，受试者是婴儿/儿童，特别是年龄在6个月以上、甚至更特别是介于6个月和23个月之间。佐剂
在一方面，本发明的药物组合物或免疫原性组合物不被佐剂化。另一方面，本发明的药物组合物或免疫原性组合物包含佐剂，例如水包油乳液。在一方面，本发明的佐剂是乳液，特别是水包油乳液，并可任选包含其它免疫刺激剂。在一个具体的实施方案中，水包油乳液包含可代谢的无毒油，例如角鲨烷或角鲨烯，任选母育酚(例如生育酚，特别是α生育酚(和任选角鲨烯和α生育酚两者))和乳化剂(或表面活性剂)，例如非离子表面活性剂聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80 或POLYSORBATE 80 )。可使用的表面活性剂的混合物为聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80 "*或POLYSORBATE 80 ) /脱水山梨醇三油酸酯(SPAN 85 )混合物或聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80 或POLYSORBATE 80 )/叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )混合物。母育酚(例如维生素E)也可用于油乳液佐剂(EP0382271B1、US5667784、W095/17210) ο 可按照 US5650155A、US5667784A、EP0382271B1 所述配制用于油乳液(任选水包油乳液)的母育酚，其中母育酚可以是母育酚液滴的分散体，任选包含任选直径小于I微米的乳化剂。或者，母育酚可与另一种油联用以形成油乳液的油相。本文描述了可与母育酚联用的油乳液的实例，例如上述可代谢油。在水包油乳液中，油和乳化剂应在含水载体中。含水载体可以是例如磷酸缓冲盐水或柠檬酸缓冲液。在一个方面，水包油乳液具有下列组成之一 -0. 5-11 mg角鲨烯、0. 05-5%聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80 或POLYSORBATE 80 )和任选 2-12% α -生育酚；或
-约5%角鲨烯、约0. 5%聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80 "*或POLYSORBATE80 )和约0. 5%脱水山梨醇三油酸酯(SPAN 85 ) ο该佐剂称为MF59。药物组合物和/或免疫原性组合物
在一个实施方案中，本发明的药物组合物和/或免疫原性组合物包含一种或多种毒株的血凝素，量为约15Pg/毒株、约7. 5Pg/毒株、约3. 8Pg/毒株、约I. 9Pg/毒株或5Pg/毒株。一些现存疫苗由于在裂解过程中使用去污剂而存在残留的去污剂。在其它情况下，可将去污剂加入疫苗抗原中。在本发明中，去污剂的使用，例如在病毒裂解后(适宜在过滤前并适宜在灭活前)加入的非离子表面活性剂，例如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )，在制备方法后产生的最终单价原液中，提供叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 ) : HA之比介于I. 5和15之间、适宜介于2. 5和15之间、适宜介于3和15之间、适宜介于3. 3和15之间或更高比率，这通过叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITONX-100 )和HA的重量/体积比来评价。在一方面，本发明涉及包含流感病毒血凝素(HA)和非离子表面活性剂的药物组合物或免疫原性组合物，其中非离子表面活性剂与血凝素的重量/体积比介于I和15之间。表面活性剂可以是叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )。HA浓度可介于2和200 μ g/毒株/ml之间。叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )浓度可介于10和500 yg/ml之间。在一方面，本发明涉及由多种流感毒株制备的疫苗，其中至少一种组分按照本发明的方法制备。适宜采用本发明的方法制备包含2种或3种毒株的疫苗。在一方面，在最终的疫苗中，包含多价毒株的本发明的药物组合物或免疫原性组合物的叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 ) :HA比率介于I和15之间，适宜例如介于I. 5和15之间,例如介于2和15之间、例如介于2. 5和15之间、适宜介于3和15之间、适宜介于3. 3和15之间或更高比率，这通过叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )和HA的重量/体积比来评价。裂解流感制备物
用于药物组合物或免疫原性组合物的裂解流感病毒制备物的制备方法可包括多个不同的过滤和/或其它分离步骤，例如以多个不同组合的超速离心、超滤、区带离心和色谱法(例如离子交换)步骤，以及任选例如可在裂解之前或之后进行的用热、甲醛或β-丙内酯或紫外线的灭活步骤。裂解方法可按分批方法、连续方法或半连续方法进行。WO 02/097072(US7316813B2)中描述了用于裂解免疫原性组合物的优选的裂解和纯化方法，其通过引用以其整体结合到本文中。这类方法适宜包括以下步骤
初步过滤、病毒裂解、过滤、灭活、过滤；其中过滤可以是超滤步骤。因此，在一个实施方案中，提供本发明的方法，其还包括将裂解流感病毒制备物灭活的步骤。灭活可通过本领域技术人员已知的任何方法进行，包括但不限于使用甲醛。可在该方法的步骤(ii)之后的任何阶段进行灭活。在本发明的具体实施方案中，在步骤(iii)之后进行灭活。 本发明的方法包括至少一个过滤步骤(步骤iv)，但除步骤(iv)以外，还可包括
1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个过滤步骤。例如，裂解流感病毒制备物可使用一系列不同尺寸的过滤器(例如O. 5Mm、0. 45Mm和/或O. 2/0. 22Mm过滤器)过滤。在具体的实施方案中，使用一种或多种滤膜进行过滤步骤(步骤iv)，其中至少一种滤膜是无菌级的(例如O. 2Mffl或O. 22Mffl)。在又一个实施方案中，提供本发明方法，其除步骤(iv)的过滤步骤以外还包括过滤裂解流感病毒制备物的步骤。在具体的实施方案中，步骤iv)以外的过滤步骤使用无菌级过滤器(例如O. 2Mffl或O. 22ΜΠ1过滤器)进行。在又一个实施方案中，提供本发明方法，其还包括超速离心裂解流感病毒制备物的步骤。适宜超滤使用截止(cut-off)约20 kDa MW的醋酸纤维素膜进行。在又一个实施方案中，提供本发明方法，其还包括使全病毒制备物澄清的步骤。在又一个实施方案中，提供本发明方法，其包括超速离心全病毒制备物的步骤。本发明的优选裂解流感病毒制备物包含从生产过程中留下的残留量的聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80 "*或POLYSORBATE 80 )和/或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )，但可在制备裂解抗原后将其加入或调节其浓度。在一个实施方案中，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80 或POLYSORBATE 80 )和叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100 )两者均存在。疫苗剂量中产生自抗原制备物的聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80 或POLYSORBATE 80 )的终浓度的优选范围为
聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80 或POLYSORBATE 80 ) :0. 01-1%或约0. 1%(v/v)。在具体的实施方案中，产生自裂解流感病毒制备物的聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80 或 POLYSORBATE 80 )的终浓度的范围为 0. 025%_0. 09% w/v。在另一具体的实施方案中，提供裂解流感病毒制备物为2倍浓缩的混合物，其具有浓度范围为
0.025%-0. 2% (w/v)的聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(TWEEN-80 或POLYSORBATE 80 )，并且在佐剂化(或对照制剂中的缓冲液)的最终制剂中必须稀释2倍。在一个实施方案中，在存在低水平的硫柳汞或不存在硫柳汞时制备裂解流感病毒制备物。在另一实施方案中，所得裂解流感病毒制备物在不存在有机汞防腐剂时是稳定的，具体地讲，制备物不含残余硫柳汞。具体地讲，裂解流感病毒制备物包含在不存在硫柳汞或在低水平的硫柳汞下(一般为5 yg/ml或以下)稳定化的血凝素抗原。具体地讲，通过α生育酚的衍生物，例如琥珀酸α生育酚(亦称琥珀酸维生素Ε，即VES)进行乙型流感毒株的稳定化。这类制备物及其制备方法公开于WO 02/097072 (US7316813B2)，其通过引用以其整体结合到本文中。优选的组合物含有由WHO推荐的合适的流感季节毒株制备的3种灭活裂解流感病毒制备物。在一个实施方案中，本发明的裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物和佐剂装在同一容器中。它亦称‘一小瓶法’。在另一个实施方案中，小瓶是预灌装注射器。在一个备选实施方案中，本发明的裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物和佐剂被装入不同的容器或小瓶，在给予受试者前不久或给予时混合。它亦称‘两小瓶法’。两小瓶法适宜由O. 5ml浓缩的本文所述裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物(以I型玻璃小瓶(抗原容器)提供)和装有O. 5ml佐剂的预灌装I型玻璃注射器(佐剂容器)组成。或者两小瓶法以2个小瓶(一个用于抗原，一个用于佐剂，各为10剂)提供，在给予第一患者之前在24小时内在室温下混合，随后在4°C下保存一段短的时间(例如至多一周)用于随后的给药。在注射时，将多剂量小瓶或装有佐剂的注射器的内容物注入装有浓缩裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物的小瓶中。混合后，将内容物抽到注射器中，将针更换为肌内针。一剂佐 剂化的裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物(药物组合物或免疫原性组合物)相当于
O.5ml ο在一个实施方案中，通过SRID测定的每人剂量的药物组合物或免疫原性组合物含有15Pg HA/流感毒株/剂。这特别用于年长人群。本发明的一个重要方面是流感抗原可以低于之前认为有用的量使用的事实，适宜每人剂量的免疫原性组合物的水平低于15Pg HA/病毒毒株，例如介于I和IOPg HA/毒株。因此，在一个实施方案中，每人剂量的药物组合物或免疫原性组合物含有低剂量的血凝素(HA)，限定为低于15Pg HA/剂的量，适宜低于l(^g，这通过径向免疫扩散(SRD)测量(J.M· Wood等· J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247 J. M. Wood等，工 Biol. Stand.9 (1981) 317-330)。在一个具体的实施方案中，人用剂量的免疫原性组合物包含每毒株的血凝素(HA)剂量水平为约lOPg、例如介于5至15Pg之间、适宜介于6至14Pg之间、例如介于7至13Pg之间或介于8至12Pg之间或介于9至I Mg之间或者为lOPg。在又一个实施方案中，人用剂量的免疫原性组合物包含每毒株的血凝素(HA)剂量水平为约5Pg，例如介于I至9Pg之间或介于2至8Pg之间或适宜介于3至7Pg或4至6Pg之间或者为5Pg。可以测定的合适量为 1.9 μ g、2. 5 yg、3.8 yg,5. O μ g、7. 5 μ g或 10 μ g HA或者低于 15 μ g HA的任何合适的量，使得疫苗组合物符合本文确定的功效标准。有利的是，可使用可允许符合表C或/和表D确定的调节标准的Mg HA或甚至更低的HA剂量(例如0. 5μg HA)。HA的合适量为例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14卜8 (w/v) /流感毒株/人用剂量的免疫原性组合物中的任一个。所述低量的HA可以低至实际上是可行的，条件其允许配制符合下述国际(例如EU或FDA)功效标准的疫苗(参见表3和表4及给出的具体参数)。适宜使用0. 5ml的药物组合物或免疫原性组合物剂量。Iml (0. 5ml佐剂加0. 5ml抗原制备物)的药物组合物或免疫原性组合物剂量也是适宜的。有利的是，可以比常规注射的裂解流感疫苗(一般为约0. 5,0. 7或Iml/剂)少的体积，提供本发明的药物组合物或免疫原性组合物剂量，特别是低HA量的疫苗。本发明的小体积剂量适宜每剂低于500 μ I、通常低于300 μ I、适宜不超过约200 μ I或更低。按常规，可根据原始原液样品中的HA浓度，或根据具有通过鼻内或皮内途径给予的较小剂量的递送途径，或根据目标人群(例如婴儿可接受成人剂量的一半)，对剂量体积略作改动。本发明的流感药物组合物或免疫原性组合物适宜符合疫苗的某些国际标准。标准在国际上适于测量流感疫苗的功效。按照欧洲药品评价局(European Agency for theEvaluation of Medicinal Products)人用标准评价血清学变量(CHMP/BWP/214/96,专利药品委员会(Committee for Proprietary Medicinal Products, CPMP)。用于临床试验的 Abie for harmonization of requirements for influenza vaccines, 1997。 CHMP/BWP/214/96通知N° 96-0666:1-22涉及流感疫苗的年度许可程序(表3或表4)。对成年人口(18-60岁)和老年人口(>60岁)的要求不同(表C)。对于大流行间流感疫苗，至少一种评价(血清转化因子、血清转化率、血清保护率)应符合对疫苗中所包括的全部流感毒株的欧洲要求。等于或大于1:40的效价比例被视为最相关，因为预期这些效价对保护有最佳相关性[Beyer W 等，1998. Clin Drug Invest. ; 15:1-12]
正如 在 “Guideline on dossier structure and content for pandemicinfluenza vaccine marketing authorisation application (有关大流行流感疫苗销售批准申请的档案结构与内容的准则)(CHMP/VEG/4717/03，2004年4月5日，或2007年I 月 24 日更近期的 EMEA/CHMP/VWP/263499/2006，标题为 ‘Guidelines on flu vaccinesprepared from viruses with a potential to cause a pandemic (由具有弓I发大流行潜力的病毒制备流感疫苗的准则)’，可获自www. emea. eu. int)中规定的一样,在有关来自非传播毒株的流感疫苗的具体标准不存在的情况下，预期大流行候选疫苗应(至少)能够在未接触抗原的(unprimed)成人或年长受试者中，在2剂疫苗后引发足够的免疫应答以适宜地符合为现有疫苗设定的所有3个现行标准。EMEA准则描述了以下情况在大流行的情况下人口将是无免疫的，并因此假定可通过大流行候选疫苗满足用于季节性疫苗的所有3个CHMP标准。未明确要求需要在接种前血清阴性受试者中证实该情况。本发明的组合物对于组合物中所包括毒株适宜符合至少一个所述标准(一个标准足以获得批准)，适宜至少两个，或通常表3给出的用于保护的至少所有3个标准。表3 (CHMP 标准)
|18-60 岁 |>60 岁一 血清转化率* >40% >30% —
转化因子** >2.5 >2.0 —
保护率 *** I>70% I>60% —
*血清转化率定义为保护性接种后效价(protective post-vaccination titre)彡1:40的每组中受试者的比例。简单来说，血清转化率是HI效价在接种前〈I: 10，接种后^ 1:40的受试者的百分比。然而，如果起始效价> 1:10，则接种后抗体的量需要至少4倍的增加。**转化因子定义为接种后每种疫苗毒株的血清HI几何平均效价(GMT)的增加倍数。***保护率定义为接种前血清阴性且(保护性)接种后HI效价> 1:40的受试者比例或接种前血清阳性且接种后效价具有4倍显著增加的受试者比例；它通常被公认为指不性保护(indicating protection)。
FDA采用稍有不同的年龄截止点，但是他们的标准以CHMP标准为基础。合适的终点类似地包括1)达到HI抗体效价> 1:40的受试者的百分比，和2)血清转化率，定义为接种后HI抗体效价的4倍增加。几何平均效价(GMT)应包括在该结果中，但是数据不应只包括点估计值，而且还包括血清转化发生率95%置信区间的下限，且第42天HI效价彡1:40的发生率必须超过目标值。因此应提供这些数据和这些评价的点估计值的95%置信区间(Cl)。FDA草案指引要求符合两个目标。这被概括于表4中。表4
*血清转化率定义为a)基线效价> 1:10、4倍或更多倍增加的受试者；或幻基线效
价〈1:10，增加至彡1:40的受试者。这些标准必须符合真实值95% Cl的下限。


本发明涉及用于产生裂解流感病毒制备物或亚单位流感制备物的方法，所述方法包括以下步骤(i)提供全病毒制备物；(ii)在第一去污剂存在下裂解所述全病毒制备物；(iii)将叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITONX-100 )加到所得裂解病毒制备物中；和(iv)将所述裂解病毒制备物过滤。