专利名称：用于大流行流感的疫苗的制作方法·大流行是当新疾病出现时保留下来，感染人(从而引起严重疾病)并且迅速地在人之间传播的传染病的全球性大流行。当流感病毒的新株系或亚型从另一种动物物种(例如鸟类或猪)传播至缺乏因先前暴露于相关病毒而产生的免疫的人群中时，流感大流行可发生。流感大流行早在16世纪后期已有记载并且自那以来定期发生，最近的有1957的“亚洲型流感”(H2N2)、1968的“香港流感” (H3N2)和2009年的“猪流感” (HlNl)。20世纪90年代出现的H5N1 “亚洲型流感”已感染了人但到目前为止因无效的人与人之间的传播而还未引起大流行。随着全球旅游和城市化增加，预计由新型病毒引起的流感流行的传播可极快地变成大流行(WH0，“大流行防备”)。禽流感由包含分段的RNA基因组的正粘病毒引起。感染通过病毒血凝素(HA)蛋白与宿主细胞上的唾液酸连接的糖蛋白的结合起始。可基于抗原性和序列特征将血凝素蛋白分成16个亚型。除了 HA外，流感病毒还包含另外的表面蛋白神经氨酸酶(NA)，其参与病毒在感染后从细胞的释放。神经氨酸酶蛋白目前被分成9个亚型。16个HA与9个NA亚型的所有可能的组合据认为存在于自然界中，其中野生禽类(例如鸭)用作无症状病毒贮主(asymptomatic virus reservoir)。偶尔地,流感病毒从野生禽类传播至家禽中，其中已描述了疾病的两种形式。一种形式为常见但轻度的，另一种形式为罕见但高度致命的。禽类的高致病性禽流感病毒(HPAI)感染通常由H5和H7亚型引起。HPAI病毒的HA蛋白与其它不太致病的H5和H7亚型HA蛋白区别在于HA切割位点中的一组碱性氨基酸。禽类被某些HPAI病毒的持续感染以及禽类与人的相对亲近度已导致4个禽流感亚型(H5N1、H7N3、H7N7和H9N2)至人的传播。H7或H9亚型病毒对人的感染通常导致轻度的非致命性疾病。相反地,H5亚型病毒对人的感染导致严重的通常致命的疾病(“Cumulativenumber of Confirmed Human Cases of Avian Influenza A/(H5N1)Reported to WHO, 2010年 2 月 17 日，www. who. int)。H5N1病毒对人的持续感染加上病毒在野生禽类和家禽中的地理扩张已导致H5N1病毒的遗传进化，现可将所述遗传进化在遗传上和抗原性分类至不同的进化枝和子分枝(subclade)(世界卫生组织全球流感监测网络程序(WHO Global Influenza ProgramSurveillance Network), Emerging Infectious Disll: 1515-1521，2005)。如果这类新型病毒的任一种获得迅速地在人之间传播的能力，则H5N1流感大流行的可能性较高。鉴于与H5N1感染相关的高死亡率，与这样的大流行相关的潜在全球性影响可以是相当严重的。因此，WHO已起始了大流行警告的程序。抗击破流感大流行的疫苗的开发是WHO和许多政府进行流感大流行防备的基石。需要大量安全有效剂量的大流行疫苗来满足美国和世界其它地方的潜在需要。抗当前循环大流行前株的疫苗的贮存是目前大流性预防策略的关键组成部分。预期可能将与新出现的大流行病毒不完全相同的这些疫苗可提供足够的保护，同时正在产生更专一的株系匹配的疫苗。迄今为止，3种H5N1疫苗(两种裂解病毒体(split-virion)和一种全病毒体(whole-virion))已获得监管机构的批准并且几种其它疫苗正处于后期开发。许多国家现正在贮存这些疫苗，近期美国目标是收集足够的疫苗来治疗2000万人。然而，许多科学、技术和经济挑战使得全球性流感大流行的防备变得复杂。重要地，通过常规基于鸡蛋的方法进行的大流行前或大流行疫苗的制造是非常耗时的、昂贵的，并且需要数十亿鸡蛋来制造足够的疫苗剂量以免疫全世界的高危个体。产生减毒病毒的基于细胞·的替代策略正在开发中，但这类再装配病毒通常包含相对低水平的疫苗抗原。该低抗原产率在H5N1疫苗的背景中是值得特别关注的，因为禽H5血凝素固有地在人中表现出比来自其它亚型的HA更低的免疫原性。因此，相对于季节性流感疫苗，需要更大的抗原剂量来诱导抗体反应。此外，鉴于人对于H5血凝素具有特异性免疫力(immunologically naive), —个剂量的免疫计划可能不具有保护作用。为了举例说明这些观点，最早由FDA批准的基于H5进化枝I病毒(A/Vietnam/1203/2004)的疫苗仅在54%的研究参与者中诱导“保护性”中和滴度并且在90 μ g的HA上需要两个剂量，为季节性疫苗的HA含量的12倍(Treanor等人 New Engl J Med354:1343-1351，2006)。需要可显著提高疫苗生产能力同时增强H5N1免疫原性的其它技术。大流行前疫苗的理想特征是其可被容易且便宜地制造并且具有长贮存期限。重要地，其应当使用最小限量的抗原产生强劲的保护性免疫反应，并且提供抗遗传上不同的病毒，理想地来自不同进化枝的病毒的交叉保护。此外，疫苗还必须是安全的。
本发明涉及用作疫苗的组合物和利用所述疫苗免疫受试者的方法，其中疫苗包含来自大流行前或大流行性流感病毒的重组血凝素和佐剂。在一个实施方案中，佐剂为被描述为具有各自独立地选自葡糖基和氨基取代的葡糖基的还原端和非还原端的二糖的化合物(DSLP化合物)，其中非还原端的I位上的碳通过醚(-0-)或氨基(-NH-)基团连接于还原端的6’位上的碳，二糖通过非还原端的4’碳键合于磷酸基团以及通过酰胺(-NH-C(O)-)和/或酯(-o-c(o)-)键键合于多个脂质基团，其中酯或酰胺键的羰基(-C(O)-)基团直接连接于脂质基团，且每一个脂质基团包含至少8个碳。在具体的组合物和方法中，佐剂为GLA(参见，例如，美国专利申请公布2008/0131466)，其在不同的实施方案中可以不含油，被配制为水包油乳剂或利用其它佐剂例如明矾、铝盐来进行配制。特别感兴趣的血凝素包括来自高致病性H5N1病毒的H5和来自HlNl ( “猪流感”)大流行性流感病毒的Hl。组合物可以是节省药量的(dosage-sparing)和/或重组血凝素可以以节省剂量的量存在。方法可包括用组合物的单次注射即非多次注射来免疫受试者。例如，组合物可通过下列的一项或多项(即，其任何组合)来进行定义rHA以节省剂量的量存在；rHA以在佐剂不存在的情况下不提供保护性免疫的浓度存在；rHA来自禽流感的致病株；rHA来自H5N1流感的致病株；rHA来自进化枝I或进化枝2 ;rHA来自大流行猪流感病毒株；rHA来自大流行HlNl株；组合物包含单种，即不超过一种不同的重组蛋白；每剂rHA的量在约15 μ g至约O. I μ g的范围内；rHA从昆虫或哺乳动物细胞表达以获得优选水平的糖基化；rHA被表达为融合蛋白；佐剂仅为GLA或包括GLA ;佐剂仅为3D-MPL或包括3D-MPL，组合物不含油；组合物包含低于约1%ν/ν的油或低于约O. P/ov/v的油；佐剂在与抗原组合之前被配制为水溶液；佐剂在与抗原组合之前被配制为包含脂质体的组合物；组合物还包含铝盐或皂苷。在一个实施方案中，本发明提供了免疫有此需要的受试者抗大流行前或大流行性流感病毒的方法，包括施用单次注射的药物组合物，所述药物组合物包含(a)来自大流行前或大流行性流感病毒的重组血凝素(rHA)和(b)佐剂，其中佐剂包含具有各自独立地选自葡糖基和氨基取代的葡糖基的还原端和非还原端的二糖，其中非还原端的I位上的碳通过醚(-0-)或氨基(-NH-)基团连接于还原端的6’位上的碳，二糖通过非还原端的4’碳键合于磷酸基团以及通过酰胺(-NH-C(O)-)和/或酯(-O-C(O)-)键键合于多个脂质基团，其 中酯或酰胺键的羰基(-C(O)-)基团直接连接于脂质基团，且每一个脂质基团包含至少8个碳，其中在单次注射后施用实现血清转换(seroconversion)。在各种实施方案中,其可单独地或以任何组合进一步定义本发明组合物不包括乳剂；佐剂为GLA，佐剂为3D-MPL。例如，本发明在一个实施方案中提供了用于通过单次注射药物组合物免疫有此需要的受试者抗大流行前或大流行性流感病毒的方法的药物组合物，所述药物组合物包含(a)来自大流行前或大流行性流感病毒的重组血凝素(rHA)和(b)佐剂，其中佐剂包含具有各自独立地选自葡糖基和氨基取代的葡糖基的还原端和非还原端的二糖，其中非还原端的I位上的碳通过醚(-0-)或氨基(-NH-)基团连接于还原端的6’位上的碳，二糖通过非还原端的4’碳键合于磷酸基团以及通过酰胺(-NH-C(O)-)和/或酯(-O-C(O)-)键键合于多个脂质基团，其中酯或酰胺键的羰基(-c(o)-)基团直接连接于脂质基团，且每一个脂质基团包含至少8个碳。药物组合物可用于免疫群体抗大流行前或大流行性流感病毒的方法，其中组合物的施用在单次注射后在至少50%、或至少60%或更多的群体中实现血清转换。在一个方面，药物组合物不包括任何油，即不含油，或包含不影响组合物的血清转换效率的最少量的油，并且不包括任何含油乳剂。与这些实施方案的任何实施方案组合，本发明的一个方面是将GLA用作佐剂。在另一个方面，3D-MPL可用作佐剂。作为另一个实例，本发明提供了用于免疫有此需要的受试者抗大流行前或大流行性流感病毒的方法的药物组合物，其中组合物包含(a)来自大流行前或大流行性流感病毒的重组血凝素(rHA)和(b)佐剂，其中佐剂包含具有各自独立地选自葡糖基和氨基取代的葡糖基的还原端和非还原端的二糖，其中非还原端的I位上的碳通过醚(-0-)或氨基(-NH-)基团连接于还原端的6’位上的碳，二糖通过非还原端的4’碳键合于磷酸基团以及通过酰胺(-NH-C(O)-)和/或酯(-O-C(O)-)键键合于多个脂质基团，其中酯或酰胺键的羰基(-C(O)-)基团直接连接于脂质基团，且每一个脂质基团包含至少8个碳，并且其中组合物是节省药量的。用于免疫受试者抗大流行前或大流行性流感病毒的方法的药物组合物，其中rHA以节省剂量的量存在。在不同的实施方案中，其可单独地或以任何组合进一步定义本发明rHA以在佐剂不存在的情况下不提供保护性免疫的浓度存在；组合物包含单种、即不超过一种重组蛋白；每剂量rHA的量在约15 μ g至约Iyg的范围内；并且佐剂为GLA，rH5来自H5N1流感病毒的致病株。当参考下列详细描述和附图后，这些和其它方面将变得显然。图IA-C。rH5/GLA-SE疫苗的单次注射保护小鼠免受H5N1感染。(A)用在2% v/V SE 乳剂或 GLA-SE 佐剂(20 μ g GLA)中配制的 50、150、450、900 或 2700 ng rH5 (VN)免疫小鼠(5只/组)一次，随后在第14天用H5N1病毒(IOOOx LD50)进行攻击。在两周的时期中测定每一组的每组体重减轻最大百分比的平均值。测定每一个rH5的剂量的曲线下面积(随时间过去的体重减轻百分比)。(B)在病毒攻击后在连续天数时的小鼠的体重减轻百分比。用利用单独的SE配制的或利用GLA-SE佐剂配制的50ng rH5或在蛋白质不存在的情况下用GLA-SE或SE接种小鼠。每一个数据点代表每组平均体重减轻+/-s. e.m。(C)C57B1/6小鼠中佐剂介导的rH5保护作用。用单独的GLA-SE或50ng的用2% v/v的单独的SE配制的rH5 (VN)、单独的5 μ g GLA或5 μ g GLA-SE接种动物(5只/组)一次。在第·14天用H5N1 Viet Nam 1203病毒(IOOOxLD50)攻击(IN)小鼠，监控其存活率和体重减轻。每一个数据点代表每组平均体重减轻+/-s. e. m。图2。GLA-SE佐剂在用异源H5N1病毒攻击后提高已接种的小鼠的存活率。用50ng利用GLA-SE佐剂配制的同源(VN)rH5、50ng或200ng于GLA-SE佐剂中配制的异源(Indo)rH5或200ng单独的异源rH5或利用SE乳剂配制的rH5接种动物(5只/组)。在第14天用H5N1 Viet Nam 1203病毒(IOOOxLD50)攻击(IN)小鼠，监控其存活率和体重减轻。每一个数据点代表每组平均体重减轻+/-s. e. m。图3A-C。GLA-SE加速抗原特异性免疫的诱导和疾病的恢复。(A)作为攻击之前接种的天数的函数的存活率百分比。用50 ng单独的rH5和利用SE或GLA-SE配制的rH5或单独的GLA-SE免疫小鼠，在用H5N1 Viet Nam 1203病毒(IOOOxLD50)接种后第0、2、4、6、8、10或12天进行攻击。⑶在病毒攻击后第6或14天用50ng单独的rH5或利用SE或GLA-SE配制的rH5接种的小鼠随时间变化的体重减轻百分比。(C)基于观察的评分系统的来自(B)的小鼠的一般健康的变化；0=正常；1=尚未确定的疾病；2=轻度但确定的疾病；3=中度疾病；4=严重的，垂死的。图4A-C。基于GLA的rH5疫苗在同源和异源病毒攻击后在小鼠中提供了持久的保护性免疫。(A)用50ng单独的或如所指示配制的同源(VN)rH5接种小鼠(5只/组)和46天后用H5N1 Viet Nam 1203病毒(IOOOxLD5ci进行攻击。在攻击后每天监控小鼠的体重变化，进行2周。每一个数据点代表每组平均体重减轻+/-s. e. m。(B)用50ng的单独的或如所指示配制的异源(Indo)rH5接种小鼠(5只/组)，46天后用H5N1 Viet Nam 1203病毒(IOOOxLD5ci)进行攻击。在攻击后每天监控小鼠的体重变化，进行2周。每一个数据点代表每组平均体重减轻+/-s. e. m。(C)在攻击后第3天或第6天测定用指定的制剂中的同源(VN)或异源(Indo)rH5接种的动物的病毒载量。图5A-B。利用基于GLA的rH5疫苗的单次注射保护鼬免受H5N1感染。用O. 5 μ g的单独的rH5抗原或指定的制剂中的rH5注射动物(4只/组)一次(頂)，随后在第28天通过H5N1VN1203(0. 75xl06pfu)的鼻内输注进行攻击。(A)体重的百分比变化。每一个数据点代表4只动物的平均值+/-s. e. m.，除提供分别来自I和2个存活者的结果的GLA-SE和rH5组外。(B)基于观察的评分系统的一般健康的变化；0=正常；1=尚未确定的疾病；2=轻度但确定的疾病；3=中度疾病；4=严重的，垂死的。



药物和疫苗组合物包含来自大流行前或大流行性流感病毒的重组血凝素和含有GLA的佐剂。特别相关的大流行前流感病毒为H5N1。还提供了使用组合物的试剂盒和方法。