专利名称：一种猪用免疫增强剂il-12b(p40)及其制备方法白介素12 (IL-12),又名细胞毒淋巴细胞成熟因子(cytotoxic lymphocytematuration factor, CLMF),或称细胞刺激因子(natural killer cell stimulationfactor, NKSF)。它是一种由分子量为40kDa和35kDa的两个亚基组成的异源二聚体的细胞因子，主要由树突状细胞(DC)、巨噬细胞(ΜΦ)、B淋巴细胞以及其他一些抗原提呈细胞(APC)产生，它能促进分化的CD4+T辅助细胞I (Thl)的增殖，诱导NK细胞和T细胞产生细·胞因子(主要是Y干扰素)，提高NK细胞的细胞毒性，促进细胞毒性T细胞的形成等等。IL-12在机体早期的非特异性免疫和随后的抗原特异性的适应性免疫过程均扮演了极重要的角色。
本发明的目的是提供一种猪用免疫增强剂IL_12B(P40)及其制备方法，应用于猪病原体(如猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒等)感染的预防及治疗。本发明的目的是通过以下技术方案来实现一种猪用免疫增强剂IL_12B(P40)，是一种基因重组蛋白，该蛋白含有猪IL-12的P40亚基[IL-12B(P40)]的主要氨基酸序列。一种猪用免疫增强剂IL_12B(P40)的制备方法，包括以下步骤I)以IL_12B(P40)特异性的上下游引物，通过RT-PCR合成包含EcoRI和XhoI两个酶切位点的IL-12B(P40)cDNA，经过纯化酶切，重组至原核表达载体pGEX-6p-l ；2)该重组质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，经IPTG诱导的表达产物为GST-IL-12B(P40)融合蛋白；3)将纯化的GST-IL-12B(P40)融合蛋白与化学合成的猪瘟病毒T细胞表位E290多肽(KHKVRNEVMVHWFDD)混匀，免疫猪后，通过淋巴细胞增殖实验检测机体的T细胞免疫反应。O本发明的有益效果为重组融合蛋白可作为一种免疫增强剂，与猪病原体(如猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒等)的一些T细胞表位(如猪瘟病毒T细胞表位E290多肽KHKVRNEVMVHWFDD)联合免疫动物，增强机体的细胞免疫水平，应用于猪病的预防及治疗。I、设计 IL_12B(P40)基因引物参考猪源IL-12B(P40)基因序列(GenBank 号NM_214013)设计扩增 IL_12B(P40)基因引物如下，引入酶切位点为EcoRI和Xho I (用斜体表示)F-E GC GAATTC ATGCACCTTCAGCAGCTG,R-X GC CTCGAG CTAATTGCAGGACACAGATGO2、提取猪外周血单核淋巴细胞(PBMC)的总RNA根据invitrogen公司的RNA提取试剂盒,从猪PBMC中提取总RNA。3、IL_12B(P40)基因的反转录及 PCR根据invitrogen公司的RT-PCR试剂盒进行反转录，获得IL-12B (P40) -mRNA的cDNA。然后根据上述引物为PCR扩增IL-12B(P40)基因。PCR反应条件如下94°C 4分钟；94°C 40秒，55°C 40秒，72°C 75秒；共30循环；720C 10分钟。结果得PCR产物约为975bp的目的片段。4、阳性重组质粒 pGEX-6p-l-IL_12B (P40)的获取I %琼脂糖凝胶电泳后，回收目的条带，按下列体系用EcoR I和Xho I双酶切回收PCR产物及载体pGEX-6p-l质粒
本发明涉及一种猪用免疫增强剂IL-12B(P40)及其制备方法，猪用免疫增强剂IL-12B(P40)是一种含有猪IL-12的P40亚基(IL-12B(P40)的主要氨基酸序列的基因重组蛋白，通过RT-PCR合成IL-12B(P40)的cDNA，经过纯化、酶切，将该基因克隆进原核表达载体pGEX-6p-1，该重组质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，经IPTG诱导的表达产物为GST-IL-12B(P40)融合蛋白，该融合蛋白经纯化后，纯度较高，将纯化的GST-IL-12B(P40)融合蛋白与化学合成的猪瘟病毒T细胞表位E290多肽(KHKVRNEVMVHWFDD)混匀，免疫猪后，能诱发机体显著的T细胞免疫反应。本发明的有益效果为重组GST-IL-12B(P40)融合蛋白可作为一种免疫增强剂应用于猪病原体(如猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒等)感染的预防及治疗。