定量测定骨形成蛋白(bmp)活性细胞株的建立方法

朱帮福, 陈苏民, 陈南春

2002年7月10日

2001年12月7日

2001年12月7日

中国人民解放军第四军医大学

C12Q1/06GK1357621SQ0113181

bmp 定量 蛋白 活性 测定 形成

1.定量测定骨形成蛋白(BMP)活性细胞株的建立方法，包括以下步骤a.首先将串联6个BMP作用关键元件的骨钙素部分启动子连接上荧光素酶报告基因，克隆、构建其真核表达载体；该启动子序列为5’-CCAAC CACACCAAC CACA CCAAC CACA CCAAC CACA CCAAC CACA CCAAC CACAGCC GAT ATA AAT GCT ACT GGA TGC TGG AGG GTG CAG AAC AGA CAAGTC-3’；b.然后转入成肌细胞C2C12中，利用载体本身的抗性基因用抗生素进行压力筛选，获得稳定表达荧光素酶报告基因的单克隆细胞株；荧光素酶报告基因的表达产物为荧光素酶，荧光素酶的活性可通过检测其分解底物产生荧光量测得；上述真核表达载体也可转入其它细胞系，如NIH3T3、C3H10T1/2细胞中；具体检测方法为收集BMP刺激、培养2天的单克隆细胞，加入细胞裂解液，待细胞完全裂解后高速离心5分钟，然后取部分离心上清，加入到一定量的荧光素酶作用底物液中，在化学发光检测仪上测定产生荧光量；c.通过检测各细胞株对BMP作用的反应性，最终挑选到对BMP刺激反应强度高、检测指标—荧光素酶分解产生荧光量灵敏的细胞株；d.经过特异性、稳定性等检验证实，该细胞株稳定可靠，适用于BMP活性的定量测定

本发明涉及一种生物技术中的细胞因子活性的检测方法，进一步涉及一种定量测定骨形成蛋白(BMP)活性细胞株的建立方法现有的骨形成蛋白(BMP)活性测定方法，即动物体内植入实验，存在周期长、不能定量，且受动物品种、植入部位等多种因素影响的缺点至今尚无专门用于定量测定骨形成蛋白的细胞株或细胞学方法骨钙素是骨形成过程中成骨细胞分泌的一种必需的基质蛋白，它正是骨形成蛋白(BMP)作用的重要靶分子之一本发明采用的技术方案是首先合成串联6个BMP作用关键元件的骨钙素部分启动子(6OCP)，(序列为5’-CCAAC CACA CCAAC CACA CCAACCACA CCAAC CACA CCAAC CACA CCAAC CACA GCC GAT ATA AAT GCTACT GGA TGC TGG AGG GTG CAG AAC AGA CAA GTC-3’)连接上荧光素酶报告基因，克隆、构建其真核表达载体，使荧光素酶报告基因处于该启动子(6OCP)控制之下然后将上述载体转入成肌细胞C2C12中，利用表达载体本身的抗性基因用抗生素进行压力筛选，获得可受BMP诱导、稳定表达荧光素酶报告基因的单克隆细胞株荧光素酶报告基因的表达产物为荧光素酶，荧光素酶的活性可通过检测其分解底物产生荧光量测得具体检测方法为收集BMP刺激、培养2天的单克隆细胞，加入细胞裂解液，待细胞完全裂解后高速离心5分钟，然后取部分离心上清，加入到一定量的荧光素酶作用底物液中，在化学发光检测仪上测定产生荧光量通过检测各单克隆细胞株对BMP作用的反应性；最终挑选到对BMP刺激反应强度高、检测指标(荧光素酶产生荧光量)灵敏的细胞株本发明的方法经过特异性、稳定性等检验证实，该细胞株稳定可靠，适用于BMP活性的定量测定利用本发明测定BMP的活性仅需要2天时间，且操作简便，所测指标敏感，可以进行量化分析a.首先合成串联6个BMP作用关键元件的骨钙素部分启动子(6OCP)，序列为5’-CCAAC CACA CCAAC CACA CCAAC CACA CCAAC CACACCAAC CACA CCAAC CACA GCC GAT ATA AAT GCT ACT GGA TGC TGGAGG GTG CAG AAC AGA CAA GTC-3’，连接上荧光素酶报告基因，克隆、构建其真核表达载体，使荧光素酶报告基因处于该启动子(6OCP)控制之下；b.然后转入成肌细胞C2C12中，利用载体本身的抗性基因用抗生素进行压力筛选，获得可受BMP诱导、稳定表达荧光素酶报告基因的单克隆细胞株；上述真核表达载体也可转入其它细胞系，如NIH3T3、C3H10T1/2细胞中；c.通过检测各细胞株对BMP作用的反应性具体检测方法为收集BMP刺激、培养2天的单克隆细胞，加入细胞裂解液，待细胞完全裂解后高速离心5分钟，然后取部分离心上清，加入到一定量的荧光素酶作用底物液中，在化学发光检测仪上测定产生荧光量；d.最终挑选到对BMP刺激反应强度高、检测指标灵敏的细胞株；e.经过特异性、稳定性等检验证实，该细胞株稳定可靠，适用于BMP活性的定量测定；采用不同来源、不同批次的BMP刺激该细胞株后，检测荧光素酶活性，结果显示BMP的作用剂量与荧光素酶活性呈线性正相关