用于检测bmpr2基因突变的引物组、该引物组的用途及包含该引物组的试剂盒制作方法

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专利名称

用于检测bmpr2基因突变的引物组、该引物组的用途及包含该引物组的试剂盒制作方法
发明者

卢文菊, 张晨婷, 王健
公开日

2013年3月13日
申请日期

2012年7月23日
优先权日

2012年7月23日
申请人

广州医学院第一附属医院
文档编号

C12Q1/68GK102965430SQ20121025551
关键字

bmpr 引物基因突变检测用于
权利要求

1.用于检测BMPR2基因突变的引物组，其特征在于，包括BMPR2基因第I至第13外显子区、3 ’ UTR、5 ’ UTR和启动子中任一区域对应的PCR扩增引物组，所述的PCR扩增引物组包括 (1)所述启动子的PCR扩增引物组包括具有SEQID NO. I所示的核苷酸序列的引物PlF和具有SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列所示的引物PlR的引物组； (2)所述5’UTR的PCR扩增引物组包括具有SEQID NO. 3所示的核苷酸序列的引物P2-1F和具有SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列的引物P2-1R的引物组、具有SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列的引物P2-2F和具有SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列的引物P2-2R的引物组、具有SEQID NO. 7所示的核苷酸序列的引物P3-1F和具有SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列的引物P3-1R的引物组； (3)所述Exonl的PCR扩增引物组包括具有SEQID NO. 9所示的核苷酸序列的引物P3-2F和具有SEQ ID NO. 10所示的核苷酸序列的引物P3-2R的引物组； (4)所述Exon2的PCR扩增引物组具有SEQID NO. 11所示的核苷酸序列的引物P4F和具有SEQ ID NO. 12所示的核苷酸序列的引物P4R的引物组； (5)所述Exon3的PCR扩增引物组包括具有SEQID NO. 13所示的核苷酸序列的引物P5F和具有SEQ ID NO. 14所示的核苷酸序列的引物P5R的引物组； (6)所述Exon4的PCR扩增引物组包括具有SEQID NO. 15所示的核苷酸序列的引物P6F和具有SEQ ID NO. 16所示的核苷酸序列的引物P6R的引物组； (7)所述Exon5的PCR扩增引物组包括具有SEQID NO. 17所示的核苷酸序列的引物P7F和具有SEQ ID NO. 18所示的核苷酸序列的引物P7R的引物组； (8)所述Exon6的PCR扩增引物组包括具有SEQID NO. 19所示的核苷酸序列的引物P8F和具有SEQ ID NO. 20所示的核苷酸序列的引物P8R的引物组； (9)所述Exon7的PCR扩增引物组包括具有SEQID NO. 21所示的核苷酸序列的引物P9F和具有SEQ ID NO. 22所示的核苷酸序列的引物P9R的引物组； (10)所述Exon8的PCR扩增引物组包括具有SEQID NO. 23所示的核苷酸序列的引物PlOF和具有SEQ ID NO. 24所示的核苷酸序列的引物PlOR的引物组； (11)所述Exon9的PCR扩增引物组包括具有SEQID NO. 25所示的核苷酸序列的引物PllF和具有SEQ ID NO. 26所示的核苷酸序列的引物PllR的引物组； (12)所述ExonlO的PCR扩增引物组包括具有SEQID NO. 27所示的核苷酸序列的引物P12F和具有SEQ ID NO. 28所示的核苷酸序列的引物P12R的引物组； (13)所述Exonll的PCR扩增引物组包括具有SEQID NO. 29所示的核苷酸序列的引物P13F和具有SEQ ID NO. 30所示的核苷酸序列的引物P13R的引物组； (14)所述Exonl2的PCR扩增引物组包括具有SEQID NO. 31所示的核苷酸序列的引物P14F和具有SEQ ID NO. 32所示的核苷酸序列的引物P14R的引物组、具有SEQ ID NO. 33所示的核苷酸序列的引物P15F和具有SEQ ID NO. 34所示的核苷酸序列的引物P15R的引物组、具有SEQID NO. 35所示的核苷酸序列的引物P16F和具有SEQ ID NO. 36所示的核苷酸序列的引物P16R的引物组； (14)所述Exonl3的PCR扩增引物组包括具有SEQ ID NO. 37所示的核苷酸序列的引物P17F和具有SEQ ID NO. 38所示的核苷酸序列的引物P17R的引物组；(15)所述3’UTR的PCR扩增引物组包括具有SEQID NO. 39所示的核苷酸序列的引物P18F和具有SEQ ID NO. 40所示的核苷酸序列的引物P18R的引物组、具有SEQ ID NO. 41所示的核苷酸序列的引物P19-1F和具有SEQ ID NO. 42所示的核苷酸序列的引物P19-1R的引物组、具有SEQ ID NO. 43所示的核苷酸序列的引物P19-2F和具有SEQ ID NO. 44所示的核苷酸序列的引物P19-2R的引物组、具有SEQ ID NO. 45所示的核苷酸序列的引物P20F和具有SEQ ID NO. 46所示的核苷酸序列的引物P20R的引物组、具有SEQ ID NO. 47所示的核苷酸序列的引物P2IF和具有SEQ ID NO. 48所示的核苷酸序列的引物P2IR的引物组、具有SEQ ID NO. 49所示的核苷酸序列的引物P22-1F和具有SEQ ID NO. 50所示的核苷酸序列的引物P22-1R的引物组、具有SEQ ID NO. 51所示的核苷酸序列的引物P22-2F和具有SEQID NO. 52所示的核苷酸序列的引物P22-2R的引物组、具有SEQ ID NO. 53所示的核苷酸序列的引物P23F和具有SEQ ID NO. 54所示的核苷酸序列的引物P23R的引物组、具有SEQ IDNO. 55所示的核苷酸序列的引物P24F和具有SEQ ID NO. 56所示的核苷酸序列的引物P24R的引物组、具有SEQ ID NO. 57所示的核苷酸序列的引物P25F和具有SEQ ID NO. 58所示的核苷酸序列的引物P25R的引物组、具有SEQ IDNO. 59所示的核苷酸序列的引物P26F和具有SEQ ID NO. 60所示的核苷酸序列的引物P26R的引物组、具有SEQ ID NO. 61所示的核苷酸序列的引物P27F和具有SEQ ID NO. 62所示的核苷酸序列的引物P27R的引物组、具有SEQ IDNO. 63所示的核苷酸序列的引物P28F和具有SEQ IDNO. 64所示的核苷酸序列的引物P28R的引物组、具有SEQ ID NO. 65所示的核苷酸序列的引物P29F和具有SEQ ID NO. 66所示的核苷酸序列的引物P29R的引物组、具有SEQ ID NO. 67所示的核苷酸序列的引物P30F和具有SEQ ID NO. 28所示的核苷酸序列的引物P30R的引物组2.用于检测BMPR2基因突变的引物组，其特征在于，还包括BMPR2基因第I至第13外显子区、3’ UTR、5’ UTR和启动子中任一区域对应的PCR测序引物，所述的PCR测序引物包括 (16)所述启动子的PCR测序引物包括具有SEQID NO. I所示的核苷酸序列的引物PlF ； (17)所述5’UTR的PCR测序引物包括具有SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列的引物P2-1F、具有SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列的引物P2-2R和SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列的引物P3-1R ； (18)所述Exonl的PCR测序引物组包括具有SEQID NO. 9所示的核苷酸序列的引物P3-2F ； (19)所述Exon2的PCR测序引物组包括具有SEQID NO. 11所示的核苷酸序列的引物P4F ； (20)所述Exon3的PCR测序引物组包括具有SEQID NO. 13所示的核苷酸序列的引物P5F ； (21)所述Exon4的PCR测序引物组包括具有SEQID NO. 16所示的核苷酸序列的引物P6R ； (22)所述Exon5的PCR测序引物组包括具有SEQID NO. 17所示的核苷酸序列的引物P7F ； (23)所述Exon6的PCR测序引物组包括具有SEQID NO. 19所示的核苷酸序列的引物P8F ； (24)所述Exon7的PCR测序引物组包括具有SEQID NO. 22所示的核苷酸序列的引物P9R ； (25)所述Exon8的PCR测序引物组包括具有SEQID NO. 23所示的核苷酸序列的引物PlOF ； (26)所述Exon9的PCR测序引物组包括具有SEQIDNO.26所示的核苷酸序列的引物PllR ； (27)所述ExonlO的PCR测序引物组包括具有SEQID NO. 28所示的核苷酸序列的引物P12R ； (28)所述Exonll的PCR测序引物组包括具有SEQID NO. 30所示的核苷酸序列的引物P13R ； (29)所述Exonl2的PCR测序引物组包括具有SEQID NO. 31所示的核苷酸序列的引物P14F、具有SEQ ID NO. 33所示的核苷酸序列的引物P15F和具有SEQ ID NO. 35所示的核苷酸序列的引物P16F ； (30)所述Exonl3的PCR测序引物组包括具有SEQID NO. 37所示的核苷酸序列的引物P17F ； (31)所述3’UTR的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO. 39所示的核苷酸序列的引物P18F、具有SEQ ID NO. 41所示的核苷酸序列的引物P19-1F、具有SEQ ID NO. 43所示的核苷酸序列的引物P19-2F、具有SEQ ID NO. 45所示的核苷酸序列的引物P20F、具有SEQID NO. 47所示的核苷酸序列的引物P21F、具有SEQ ID NO. 50所示的核苷酸序列的引物P22-1R、具有SEQ IDN0. 51所示的核苷酸序列的引物P22-2F、具有SEQ ID NO. 53所示的核苷酸序列的引物P23F、具有SEQ ID NO. 55所示的核苷酸序列的引物P24F、具有SEQ IDNO. 57所示的核苷酸序列的引物P25F、具有SEQ ID NO. 59所示的核苷酸序列的引物P26F、具有SEQ ID NO. 61所示的核苷酸序列的引物P27F、具有SEQ ID NO. 63所示的核苷酸序列的引物P28F、具有SEQ ID NO. 65所示的核苷酸序列的引物P29F和具有SEQ ID NO. 67所示的核苷酸序列的引物P30F3.权利要求I所述的PCR扩增引物组在制备通过PCR扩增自生物样品获得核酸样品检测BMPR2基因是否突变的试剂中的用途4.包含权利要求I的引物组的用于检测BMPR2基因突变的试剂盒，其特征在于，包括BMPR2基因第I至第13外显子区、3’UTR、5’UTR和启动子分别对应的PCR扩增引物组中的一组或两组以上的PCR扩增引物组，所述的PCR扩增引物组如权利要求I所示5.根据权利要求4所述的用于检测BMPR2基因突变的试剂盒，其特征在于，还包含有权利要求2所述的PCR测序引物组6.根据权利要求4或5所述的用于检测BMPR2基因突变的试剂盒，其特征在于，还包括常规PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂和DNA测序试剂7.一种使用权利要求I或2所述的引物组或者权利要求4或5所述的试剂盒对BMPR2基因的PCR扩增方法，其特征在于，取权利要求I所述的BMPR2基因第I至第13外显子区、.3 ’ UTR、5 ’ UTR和启动子分别对应的PCR扩增引物组中的一组或两组以上的PCR扩增引物组对BMPR2基因进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应包括第一阶段反应和第二阶段反应(1)第一阶段反应包括11个扩增循环反应，其条件为变性温度98 94° C，退火起始温度为62° C，每两次扩增循环退火温度递减O. 5° C，直至扩增循环结束，延伸温度为72° C， (2)第一阶段反应包括24个扩增循环反应，其条件为变性温度94 95° C，退火温度为57° C，延伸温度68 72° C8.根据权利要求7所述的BMPR2基因的PCR扩增方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应中每20 μ I的反应体系中使用O. 2 I μ I的各引物和IO-IOOng模板DNA9.根据权利要求7或8所述的BMPR2基因的PCR扩增方法，其特征在于，还包括PCR产物纯化步骤，所述产物纯化的条件为37° C孵育60min，70° ClOmin
技术领域

本发明涉及引物，具体涉及用于检测BMPR2基因突变的引物组，本发明还涉及该引物组的用途，以及包含该引物组的试剂盒
背景技术

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权力要求
说明书
法律状态

专利名称：用于检测bmpr2基因突变的引物组、该引物组的用途及包含该引物组的试剂盒的制作方法肺动脉高压是各种原因引起的静息状态下右心导管测得的肺动脉平均压(mean pulmonary arterial pressure, mPAP) ^ 25mmHg的一组临床病理生理综合征。肺动脉高压可以作为一种疾病而独立存在，更常见的是很多疾病进展到一定阶段的病理生理表现。由于肺血管重塑引起肺循环血流动力学改变，最终可导致右心衰竭，甚至死亡。这是一种极度恶性的疾病，七成多患者是年轻人，几乎每个人都知道癌症愈后差，但没有人知道肺动脉高压是一种极度恶性疾病，它的病因复杂、发病率高、误诊率高、危害性强，其愈后是灾难性的，可以说，这种病就是心血管疾病中的癌症。这种疾病平均发病年龄是36岁，75%患者集中于20-40岁年龄段，还有15%患者年龄在20岁以下，几岁的孩子也会发病。世界上该病的发病率在I X 10_5 I X 10_6之间，其中约6%为家族性的。多数家族性肺动脉高压和超过26%的散发病例都伴有骨形成蛋白II型受体基因(Bone morphogenetic proteinreceptor II gene, BMPR2)序列改变。BMPR2存在大量不同的突变，但其临床表现和病理学特征与散发例完全一致。因此采用DNA检测寻找BMPR2基因突变有助于识别家系中高风险的成员，以及未出生孩子的患病风险，这对提高人口素质，优生优育有重要的意义。对于散发性病人进行BMPR2基因突变检测，对指导用药，基因评估具有重要的意义。
本发明的目的之一是提供一种用于检测BMPR2基因突变的引物组。BMPR2基因第I到第13外显子区、3’UTR、5’UTR和启动子中的任一区域在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，都视为BMPR2基因发生了突变。因而，根据BMPR2基因第I至第13外显子区、3’UTR、5’UTR和启动子分别设计出能专一性鉴别BMPR2基因是否突变的特异性引物组，可通过PCR扩增和测序测定BMPR2基因上述区域是否发生改变，以鉴定BMPR2基因是否发生突变，因此，本发明的用于检测BMPR2基因突变的引物组可以是BMPR2基因第I至第13外显子区、3’ UTR、5’ UTR和启动子中任一区域对应的引物组。本发明第一个目的提供的用于检测BMPR2基因突变的引物组，包括BMPR2基因第I到第13外显子区，3’ UTR,5, UTR和启动子中任一区域对应的PCR扩增引物组，即选自BMPR2基因第I到第13外显子区、3’ UTR、5’ UTR和启动子分别对应的PCR扩增引物组，具体地，所述引物组选自BMPR2基因的第I外显子区(Exonl)的PCR扩增引物组、第2外显子区(Exon2)的PCR扩增引物组、第3外显子区(Exon3)的PCR扩增引物组、第4外显子区(Exon4)的PCR扩增引物组、第5外显子区(Εχοηδ)的PCR扩增引物组、第6外显子区(Exone)的PCR扩增引物组、第7外显子区(Εχοη7)的PCR扩增引物组、第8外显子区(ExonS)的PCR扩增引物组、第9外显子区(Exon9)的PCR扩增引物组、第10外显子区(ExonlO)的PCR扩增引物组、第11外显子区(Exonll)的PCR扩增引物组、第12外显子区(Exon12)的PCR扩增引物组、第13外显子区(Exonl3)的PCR扩增引物组、3’UTR的PCR扩增引物组、5’UTR的PCR扩增引物组和启动子的PCR扩增引物组中的任意一组，所述的上述各PCR扩增引物组为表I所示。表I :BMPR2基因PCR扩增引物序列本发明公开了用于检测BMPR2基因突变的引物组，至少包括BMPR2基因第1至第13外显子区、3’UTR、5’UTR和启动子中任一区域对应的PCR扩增引物组和PCR测序引物组。本发明还公开了所述引物组的用途、包含所述引物组的试剂盒以及使用所述引物组对BMPR2基因进行PCR扩增方法。所述的引物组可以专一性鉴别BMPR2基因是否突变，确保了测定结果的准确性和唯一性。

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