专利名称：时钟基因Bmal的表达调节剂的制作方法
鉴于上述情况，本发明的目的是提供能调节作为生物钟核心基因的Bmal基因的表达的活性剂。由于本发明人已经发现某些植物提取物或精油具有诱导时钟基因Bmal的表达节律以及促进其表达的特性，所以发明人完成了本发明。本发明的Bmal基因的表达调节剂包含作为活性成分的一种或多种选自以下的物质日本扁柏提取物(hinoki cypress extract)、小球藻提取物(chlorella extract)、酒花提取物(hop extract)、花椒提取物(Zanthoxylum extract)、刺柏油(juniper oil)、熏衣草油、桉树油、乳香、柏木油(cypress oil)、玫瑰草油(palmarosa oil)、松针油、玫瑰油、依兰油、榄香油、卑朽1油(petitgrain oil)、胡椒油(pepper oil)、百里香油和春黄菊油。上文提及的特定的植物提取物或精油能调节时钟基因的表达迄今为止尚未为人所知。在本发明中基因表达的调节不仅包括基因表达的促进而且包括基因表达的节律(相或周期)的调节。本发明的昼夜节律调节剂包含上文提及的Bmal基因的表达调节剂。如上所述，时钟基因直接或间接控制参与身体器官的功能和内分泌系统的多种基因的昼间表达。通过调节作为生物钟核心基因的Bmal基因的表达，调节受所述基因控制的活的生物体的多种行为节律和生理功能的昼夜节律是可能的。此外，本发明的发明人已经在使用人皮肤成纤维细胞的实验中发现上文所述的一些的具有调节Bmal基因表达的活性的所述物质还能够调节透明质酸合成酶(Has)的基因的表达。因此本发明的Bmal基因的表达调节剂被认为能够通过调节皮肤中透明质酸产生的昼夜节律以及通过增加其产量而改善皮肤功能。本发明的Bmal基因的表达调节剂可单独使用或与其它时钟基因的表达调节剂组合使用。例如，其可与Period基因的表达调节剂(其它核心时钟基因中的一种)组合使用。在如图I中所示的昼夜节律产生系统中，BMALl (Bmal基因的表达产物)与CLOCK形成异源二聚体以促进Period基因的转录，而表达的PERIOD (PER)与CRYPTOCHROME (CRY)形成异源二聚体以抑制BMAL和CLOCK活性，由此形成在24小时期间波动的反馈回路。在哺乳动物中，Bmal和Period基因的昼夜节律波动的相转换时间约12小时。Bmal表达在夜间增加，而Period表达在白天增加。因此认为经由Period和Bmal基因二者的表达的调节可调节生物钟的核心回路，从而可更有效地调节昼夜节律。本发明所有的Bmal基因的表达调节剂为草药(herbal medicine)或香料。它们可通过多种施用模式诸如透皮、经口和吸入施用而应用，且可用于包括药物、医药部外品 (quasi-drug)、化妆品、食品、杂货、衣物等的多种实施方案中。通过有效地调节Bmal基因的表达，改善多种由昼夜节律功能障碍导致的心身或皮肤症状或疾病是可能的。而且，在本发明的Bmal基因的表达调节剂中，调节Has表达节律的那些调节剂能促进其表达，因此被认为通过调节皮肤中透明质酸产生的昼夜节律以及通过增加其产量而改善皮肤功能。附图简述图I是仅显不时钟基因参与的昼夜节律广生系统的核心回路的不意图。图2是显示在培养的人皮肤成纤维细胞中使用氢化可的松和福斯高林诱导时钟基因表达的昼夜节律的图。图3是显示在培养的人皮肤成纤维细胞中受测试物质调节的时钟基因Bmall的表达的图。 实施本发明的最佳模式本发明的Bmal基因的表达调节剂包含作为活性成分的特定的植物提取物或精油。能调节Bmal基因的表达的植物提取物包括选自日本扁柏提取物、小球藻提取物、酒花提取物和花椒提取物的草药提取物。关于这些草药的细节请参考日本化妆品成分词典(Nihon Hann-you Keshouhin Genryou Shu)第四版(YAKUJI NIPPO LIMITED)。以上提及的草药提取物可通过通常已知的技术获得，例如，通过使用提取溶剂将植物材料(各提取物来自其中)浸溃或加热至回流、随后过滤并浓缩。通常用于提取的任何溶剂可用作提取溶剂，所述溶剂包括水、甲醇、乙醇、丙二醇、1，3-丁二醇、甘油和其他的醇类、含水醇类溶剂、氯仿、二氯乙烷、四氯化碳、丙酮、乙酸乙酯、己烷和其他的有机溶剂，这些溶剂可以单独或组合使用。使用上文提及的溶剂获得的提取物可原样使用，或者可使用吸附技术(例如经离子交换树脂或多孔聚合物(例如Amberlite XAD-2)柱)、随后用甲醇或乙醇洗脱、然后浓缩除去杂质后使用。也可使用例如，使用水/乙酸乙酯等得到的提取物。所有的这些草药提取物可商购获得，且下文对它们中的每一个进行简述。日本扁柏提取物(hinoki cypress extract)由柏科(Cupressacea)日本扁柏(日本扁柏(Chamaecyparis obtusa))获得,优选从日本扁柏的树干(木材)用30%乙醇或类似溶剂提取得到。小球藻提取物(chlorella extract)由单细胞植物小球藻(Chlorella vuIRaris)获得，优选从小球藻藻本体用80%乙醇或类似溶剂提取得到。酒花提取物(hop extract)由大麻科(Cannabaceae)酒花(啤酒花(Humuluslupulus))获得，优选从雌花穗状花序用80%乙醇或类似溶剂提取得到。花椒提取物(Zanthoxylum extract)由花椒果实(川陕花椒(Zanthoxylumpiperitum))获得，优选从花椒果实的果皮用70%乙醇或类似溶剂提取得到。能调节Bmal基因表达的植物精油(芳香剂)包括刺柏油(juniper oil)、熏衣草油、桉树油、乳香、柏木油(cypress oil)、玫瑰草油(palmarosa oil)、松针油、玫瑰油、依兰油、榄香油、卑朽1油(petitgrain oil)、胡椒油(pepper oil)、百里香油和春黄菊油。这些香料均是商购可得的，将其简述如下。刺柏油是通过水蒸气蒸懼刺柏(欧洲刺柏(.Tuniperus communis L),该植物是柏科(Cupressacea)的常绿树)的枝和叶而获得的精油。 熏衣草油是通过水蒸气蒸懼药用薰衣草(Lavandula officinalis)的精选的花而获得的精油，该植物为唇形科(Lamiaceae)的矮灌木。桉树油是通过水蒸气蒸懼桉树(例如蓝桉(Eucalypus Rlobulus))的枝和叶而获得的精油，该植物是属于桃金娘科(Myrtaceae)的常绿成材木。乳香是通过水蒸气蒸馏由灌木或低成材木诸如阿拉伯乳香树(Boswelliacarterii Birdw,其属于物牛儿苗目橄榄科(Burseraceae))的树皮渗出的树脂而获得的精油。柏木油是通过水蒸气蒸懼柏木(地中海柏木(Cupressus sempervirene))的枝和叶而获得的精油。玫瑰草油是通过水蒸气蒸懼禾本科(Poaceae)的玫瑰草(鲁沙香茅(CymbopoRonmartini))的叶而获得的精油。松针油是通过水蒸气蒸懼松树诸如松科(Pinaceae)欧洲赤松(Pinussylvestris)或者冷杉属(Abies)的库叶冷杉(Sakhalin fir)的针叶和小枝而获得的精油。玫瑰油是通过水蒸气蒸懼洋蔷薇(百叶蔷薇(Rosa centifolia L))、大马士革蔷薇(突厥蔷薇(Rosa damascena Mill.))和其他蔷薇花而获得的精油。依兰油是通过直接水蒸气蒸懼番蒸枝科(Anonaceae)的植物依兰(CanninRodorata)的花或者用石油醚或其他溶剂提取新鲜的花而获得的精油。榄香油是通过水蒸气蒸懼elemi (橄榄科橄榄属(Canarium)的中等至高大的树)的树皮渗出的树脂(含油树脂)而获得的精油。卑朽1油是通过水蒸气蒸懼芸香科(Rutaceae)苦橙(bitter orange)(酸橙(Citrus aurantium))的叶和其他部分的而获得的精油。胡椒油是通过水蒸气蒸懼胡椒(胡椒(Piper niRrum L.))的衆果而获得的精油，该植物属于胡椒科的多年生植物。百里香油是通过水蒸气蒸懼百里香(磨香草(Thymus vulgaris L.))全植物而获得的精油，该植物是唇形科的多年生草本植物。春黄菊油是通过水蒸气蒸懼黄春菊(Ornemis mutticaulls)而获得的精油。本发明的Bmal基因的表达调节剂可包含一种或多种的上文提及的植物的提取物(草药)或精油(香料)。例如，所述表达调节剂可包含一种或多种的上文提及的草药与一种或多种的上文提及的香料的组合。本发明的昼夜节律的调节剂包含一种或多种的作为Bmal基因的表达调节剂的上文提及的植物提取物或精油。Bmal基因的表达调节剂可单独使用或与具有调节其它的时钟基因表达的作用的活性剂组合使用。其它的时钟基因的实例包括Period 基因(Periodl、Period2、Period3)、Clock基因、Cryptochrome基因、白蛋白D位点结合蛋白(Dbp)基因、E4BP4基因、Npas2基因和Rev-erb基因。然而，Bmal基因的表达调节剂优选与Period、Clock和/或Cryptochrome基因、生物钟的其它核心基因的表达调节剂组合使用，尤其优选与一种或多种Period基因的表达调节剂组合施用。Period基因的表达调节剂包括但不限于草药诸如，阿尼菊(arnica)、日本萍蓬草(nuphar)、黑茶提取物、花椒(Zanthoxylum)和其它的提取物；和香料，诸如刺柏油、雪松油(cedar oil)、熏衣草油、丁香花蕾油(clove bud oil)、柏木油、玫瑰油、依兰油、格蓬油(galbanum oil)、卑朽1油、胡椒油、百里香油、罗勒油、β-石竹烯和其它的精油。已确认这些草药或香料能在培养的皮肤成纤维细胞中诱导Period基因的表达节律或促进其表达。此外，Bmal基因的表达调节剂和本发明的昼夜节律调节剂可单独使用或可包含在各种不同的物体中。根据物体的种类，所述物体可补充地包含任何成分以及上文提及的必需成分。例如，当所述物体为应用于皮肤的外用制剂，根据其剂型(例如液体制剂、粉末制剂、颗粒剂、气雾剂、固体制剂、凝胶剂、贴剂、栓剂等)或其产品形式(例如化妆品、药物、医药部外品等)可包含通常存在于这样的外用制剂中的任何成分以及上文提及的Bmal基因的表达调节剂。应用于皮肤的外用制剂包括通常应用于皮肤(包括头部皮肤、头发和指甲)的组合物，且包括化妆品诸如护肤品、美容品、护发产品、洗面产品、洗发产品等，以及各种药物和医药部外品诸如软膏剂、贴剂、栓剂、牙膏等。所述剂型包括但不限于基于水的系统、增溶系统、乳剂、基于油的系统、凝胶剂、糊剂、软膏剂、气雾剂、水-油两相系统、水-油-粉末三相系统等。当应用于皮肤的外用制剂为化妆品时，其包括香水、淡香水(eauxde toilet)、古龙香水(eaux de cologne)、霜、乳状液、化妆水、粉底化妆品、擦脸粉、唇膏、肥阜、洗发剂和护发素、沐浴露(body shampoo)、沐浴乳(body rinse)、爽身粉、浴阜等。本发明的Bmal基因的表达调节剂可包含在空气清新剂、除臭剂、芳香蜡烛、香(incense)、文具、钱包、包、鞋和任何其它的杂货；内衣、全套服装(outfit)、帽子、长袜、短袜和任何其它衣物中；或在粉末、颗粒剂、胶囊剂和多种其他制剂中作为食物补充剂；和在零食、饮料和任何其它食品中。此外，当本发明的Bmal基因的表达调节剂包含上文提及的精油(香料)时，其可用于吸入剂诸如药物吸入产品和雾化剂中，只要本发明产生其作用即可。在本说明书中举例阐述了本发明的Bmal基因的表达调节剂的实施方案。然而本发明不仅限于说明书中描述的实施方案，而且可采用于任何应用模式，条件是产生本发明的作用。根据具体的应用模式，可将具有调节昼夜节律作用的其它活性剂与本发明的Bmal基因的表达调节剂组合，条件是不妨碍本发明的作用。在物体中的本发明的Bmal基因的表达调节剂的含量不被特别限制，且可根据所用的草药或香料的种类和形式、该物体等适当地进行选择，例如为该物体的总质量的O. 00001质量％至100质量％、优选O. 0001质量％至50质量％、且更优选O. 0001质量％至20质量％。本发明的Bmal基因的表达调节剂或昼夜节律的调节剂以及包含所述调节剂的物体的具体应用不被特别限制，只要与昼夜节律的调节相关即可。例如，其可应用于飞行时差反应综合征、轮班制工作综合征(shift work syndrome)、睡眠时相延迟综合征、非24小时型睡眠-觉醒障碍、与昼夜节律睡眠障碍有关的抑郁等、以及失眠、身体状况不佳(poorphysical conditions)、注意力缺陷、情感淡漠(apathy)、皮肤粗糙(rough skin)和各种其它的与昼夜节律失调相关的症状的预防、改善、治疗等。[实施例] 下文将使用实施例详细叙述本发明，但本发明不限于这些实施例。皮肤成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、色素细胞、脂肪细胞、神经细胞和各种其它类型的细胞可用作培养细胞。然而在实施例中使用人皮肤成纤维细胞进行评价。因为时钟基因的核心系统是所有物种的生物和所有类型的细胞所共有的，所以认为由人皮肤成纤维细胞得到的评价结果应当可适用于其它物种的生物和其它类型的细胞。在人类中，有两种基因被称为Bmal基因Bmall和Bmal2。由于它们属于同一基因家族，所以认为它们的表现相似。在以下的实施例中，以Bmall表达作为代表进行测定。对于使用培养的人皮肤成纤维细胞的时钟基因表达节律的评价系统的研究已证实能够在使用培养的人皮肤成纤维细胞的系统中评价时钟基因表达节律。购买了来自正常人皮肤的成纤维细胞作为培养的人成纤维细胞(CellApplication, Inc.)并将其用于试验中。将它们接种于DMEM培养基(补充有10%FBS、20mMHEPES、Glutamax和抗菌剂)中，并在37° C、5%C02条件下培养。在培养的第6天，添加50ng/mL氢化可的松或10 μ M福斯高林，并在O时间后的多个时间点收获各样品，所述O时间定义为一经添加氢化可的松或福斯高林后的时间。使用商购可得的RNA提取试剂盒从细胞提取RNA,并使用商购可得的PCR引物(Perfect Real Time Primer, Takara Bio)通过RT-PCR技术测定目标基因的表达的量。对于时钟基因，测定PeriocK由Periodl代表)和Bmall (它们包括在所述核心系统中)的表达的量。相似地，定量测定管家基因RPLPO的表达的量，并用作内标准以计算目标基因相对于RPLPO的表达。在活的生物体中，糖皮质激素诸如氢化可的松与在外周组织等中调节生物钟相关，而且认为当在早上觉醒时，氢化可的松的血液浓度升高以重置生物钟。在培养的细胞中，单独的细胞通常独立地保持它们的节律。通过使用信号刺激因子诸如氢化可的松或福斯高林进行刺激能同步时钟基因的表达节律以诱导昼夜节律。结果在图2中显示。证实了 Bmall和Periodl表达分别在刺激后约16小时和约2小时出现高峰，且这两种基因均以约24小时周期的昼夜节律循环表达。测试物质对Bmal基因的表汰调节作用的评价使用培养的人皮肤成纤维细胞的评价系统的以上提及的结果证明Bmall显示了在使用试剂刺激后约16小时具有基因表达的高峰的昼夜节律。基于在刺激后16小时的基因表达的量评价测试物质对Bmal基因的表达调节作用。为证实对Bmal基因的表达节律的诱导，还测定了 Bmal基因在刺激后2小时的表达的量。根据与上文所使用的相似的方法接种来自正常人皮肤的成纤维细胞(CellApplication, Inc.)。在培养的第6天加入各个测试物质,最终浓度IOOppm,并在刺激后2和16小时收获细胞。使用商购可得的RNA提取试剂盒从细胞提取RNA。使用商购可得的PCR 引物(Perfect Real Time Primer, Takara Bio)通过 RT-PCR 技术测定 Bmal 基因的表达的量。此外，还针对透明质酸合成酶(HAS)类似地测定了基因表达，透明质酸合成酶与透明质酸的生成相关，透明质酸在保持皮肤水分方面起重要作用。HAS1、HAS2和HAS3被称为HAS，且将HAS2作为透代表性的明质酸合成酶进行了测定。定量测定管家基因RPLPO的基因表达的量，并将其用作内标准以计算目标基因相对于RPLPO的相对表达。对得到的各测定结果进行Dunnett的多重比较检验，与对照相比 具有单向的5%的显著性水平的测定结果被认定为是显著有效的。图3显示在添加各种测试物质和作为阳性对照的氢化可的松或福斯高林2和16小时后Bmall基因的基因表达的相对量。下表I显不在16小时后Bmall基因的基因表达的相对量。对于一些测试物质，Has2基因的基因表达的相对量也显示表I中。[表 I]

本发明提供了能有效调节Bmal基因的表达的物质，其具有广泛的应用。所述Bmal基因的表达调节剂包含作为活性成分的一种或多种选自以下的物质日本扁柏提取物、小球藻提取物、酒花提取物、花椒提取物、刺柏油、熏衣草油、桉树油、乳香、柏木油、玫瑰草油、松针油、玫瑰油、依兰油、榄香油、卑柠油、胡椒油、百里香油和春黄菊油。