Il-21在制备免疫抑制剂中的用途[0002]自身免疫性疾病是目前较常见的累及人类健康的疾病，常伴有多器官多系统的损伤，其目前发病机制尚不清楚。临床实践中对自身免疫性疾病的治疗，常采用激素和各种免疫抑制剂进行治疗，常用药物包括；糖皮质激素、环孢素A、酶酚酸酯、环磷酰胺和雷公藤等，但长期使用可诱发一系列的副作用，如长期大量的激素使用可诱发和加重冠心病、糖尿病、股骨头坏死、胃溃疡、青光眼、致命性侵袭性真菌感染和结核感染等；其中，所述的环磷酰胺属细胞毒性抗肿瘤药物，其可诱导骨髓抑制，导致血小板和白细胞减少，出血性膀胱炎、诱发肿瘤和生殖抑制；所述环孢素A和酶酚酸酯具有较强的免疫抑制作用，但价格昂贵，长期使用导致机会感染概率增加，且耐药菌、病毒、真菌和结核感染可能性明显增多；而雷公藤的较强生殖抑制和骨髓抑制也限制了其广泛应用；目前，寻找安全而有效的治疗方法和药物对自身免疫性疾病的长期治疗尤为重要。[0003]有报道指出，调节性B细胞是近年来新发现的一群具有免疫调节作用的B细胞，因其膜标记为⑶5+CDldhigh并主要分泌抑制性的细胞因子IL-10，故又称为BlO细胞。研究显示，所述BlO细胞在自身免疫性疾病发病过程中起关键的调控作用，如在自身免疫性疾病的动物模型中BlO细胞的减少或缺失可导致系统性红斑狼疮(SLE)、胶原诱导关节炎(CIA)、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)等的病情加重。研究还显示，所述BlO细胞数量较少，只占正常小鼠脾脏B细胞的1-3%，占小鼠外周血细胞的0.4-0.8% ;有研究显示，通过输注BlO细胞或细胞因子IL-10可缓解系统性红斑狼疮鼠的发病，结果表明，BlO细胞及其分泌的IL-10具有治疗SLE等自身免疫性疾病的潜力；然而BlO细胞体内数量较少，体外扩增困难，进而限制了其临床的使用。[0004]已知白细胞介素-21 (IL-21)是滤泡辅助T细胞(Tfh)、Thl7细胞等效应性T细胞分泌的细胞因子。有研究认为IL-21与SLE等自身免疫性疾病的发病相关，IL-21主要与生发中心的产生，B细胞的分化、浆细胞的成熟和自身抗体的分泌密切相关。[0005]目前国内外还不清楚IL-21是否能促进BlO细胞的分化和IL-10的产生，也未见有关IL-21是否通过诱导BlO的产生发挥免疫调节的作用进而对SLE等自身免疫性疾病起治疗作用报道。
[0006]本发明的目的是提供IL-21在制备免疫抑制剂中的新的用途，具体涉及IL-21通过促进调节性B细胞(B10细胞)的分化和促进具有免疫抑制作用的IL-10的分泌，进一步用于制备治疗系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病等自身免疫性疾病的药物。[0007]本发明中，IL-21能促进BlO细胞分化和IL-10的分泌，其中，所述IL-21主要通过诱导磷酸化-STAT3的活化促进IL-10分泌；[0008]本发明通过以下实验证实所述的IL-21能促进BlO细胞分化和IL-10的分泌的新用途:
[0009](I)体外 IL-21 促进 BlO 中 IL-1OmRNA 的表达
[0010]米用免疫磁珠分选小鼠脾脏中的幼稚B淋巴细胞并培养,在培养液中加入IOng/ ml LPS和10ng/ml IL-21，培养5小时或24小时，最后5小时在培养液中加入50ng/ml PMA 和 500ng/ml ionomycin和 20 u g/ml brefeldin A ;通过real-time RT-PCR检测 IL-1OmRNA 的表达，结果显示，IL-21能时间依赖的促进BlO细胞中IL-1OmRNA的表达(如图1所示)；
[0011](2)体外 IL-21 促进 BlO 分泌 IL-10
[0012]培养幼稚B淋巴细胞，在培养液也中加入10ng/ml LPS和10ng/ml IL-21，培养48 小时，最后5小时在培养液中加入50ng/ml PMA和500ng/ml ionomycin ;通过ELISA检测培养上清中IL-10的分泌量，结果显示，IL-21能促进BlO细胞分泌IL-10 (如图2所示)；
[0013](3)体外IL-21促进BlO中STAT3 mRNA的表达和蛋白的磷酸化
[0014]培养幼稚B淋巴细胞，在培养液中加入10ng/ml LPS和10ng/ml IL-21，培养48小时，最后 5 小时在培养液中加入 50ng/ml PMA、500ng/ml ionomycin 和 20 u g/mlbrefeldin A ;通过real-time RT-PCR检测STAT3mRNA的表达，或单独使用IL-21刺激B细胞不同时间，通过蛋白质印迹(Western blot)检测结果STAT3和磷酸化-STAT3蛋白的表达；结果显示，IL-21能促进BlO细胞中STAT3的表达和STAT3的磷酸化(如图3和4所示)；
[0015](4) STAT3的抑制剂(AG490)抑制体外IL-21诱导的磷酸化-STAT3的表达
[0016]培养幼稚B淋巴细胞，在培养液中加入10ng/ml IL-21或50 y M STAT3抑制剂 AG490,分别刺激15分钟、45分钟和60分钟后收取细胞，通过Western blot检测磷酸化-STAT3的表达；结果显示，IL-21能促进磷酸化-STAT3的表达而AG490能抑制IL-21诱导的磷酸化-STAT3的表达(如图5所示)；
[0017](5)抑制磷酸化-STAT3的表达能抑制IL-21诱导的IL-10的分泌
[0018]培养幼稚B淋巴细胞，在培养液中加入10ng/ml LPS和10ng/ml IL-21或 50 u MSTAT3抑制剂AG490，培养24或48小时，最后5小时在培养液中加入50ng/ml PMA和 500ng/ml ionomycin ;通过ELISA检测培养上清中IL-10的分泌量,或加入10ng/ml、20ng/ ml、50ng/ml不同剂量的IL-21和50 u MAG490刺激48小时，最后5小时在培养液中加入 50ng/ml PMA和500ng/ml ionomycin,通过ELISA检测上清IL-10的表达，结果显示,抑制磷酸化-STAT3的表达能时间和剂量依赖的抑制IL-21诱导的BlO细胞分泌IL-10 (如图6 和7所示)；
[0019](6) IL-21诱导的IL-10能抑制T细胞的增殖
[0020]培养幼稚B淋巴细胞，在培养液中加入10ng/ml LPS和10ng/ml IL-21刺激48 小时，最后5小时在培养液中加入50ng/ml PMA和500ng/ml ionomycin,收集培养上清以备后用；培养幼稚性T细胞，在培养液中加入20%的上一步收集的培 养上清；部分孔中加入 20 u g/ml ant1-1L-21中和抗体，通过MMT检测T细胞的增殖，结果显示，IL-21诱导的BlO 细胞分泌的IL-10能抑制T细胞的增殖，而中和了 IL-10的效应能抑制其对T细胞增殖的影响(如图8所示)。[0021]本发明进一步提供了一种能促进BlO细胞分化和IL-10分泌的方法；所述方法采用IL-21促进BlO细胞的分化和IL-10的分泌，其中，IL-21诱导产生的IL-10具有免疫抑制的作用，可用于治疗自身免疫性疾病；所述的IL-21可作为体外扩增BlO细胞的细胞因子，用于制备预防和治疗系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病等自身免疫性疾病的药物。[0022]本发明的IL-21促进BlO细胞分化和IL-10分泌的方法，其特征在于，其包括步骤:
[0023]通过免疫磁珠从小鼠脾脏中分选幼稚性B淋巴细胞，体外培养，在培养液中加入 10ng/ml LPS和10ng/ml IL-21，培养48小时，最后5小时在培养液中加入50ng/mlPMA和 500ng/ml ionomycin或20 u g/ml brefeldin A,继续培养5小时；通过实时定量聚合酶联反应(real-time RT-PCR)检测IL-10和信号转导与转录活化因子3 (STAT3)mRNA的表达， 通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清中IL-10的分泌情况；并通过MTT检测IL-21诱导的IL-10对T细胞增殖的影响。
[0024]本发明以调控B细胞转化为靶点，经试验证实，IL-21能调控B细胞转化为具有免疫抑制作用的调节性B细胞，并促进具有免疫抑制作用的细胞因子IL-10的分泌，其优点如下:
[0025](I)新颖:本发明对已知细胞因子IL-21发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域；所述IL-21促进BlO细胞分泌IL-10，可用于体外促进BlO细胞增殖和诱导IL-10 的分泌；
[0026](2)方便快捷:本发明只需要在原有BlO的培养液中加入微量的IL-21 (如IOng/ ml)，继续培养48小时就能诱导IL-10的分泌；
[0027](3)可靠性高:通过实时定量聚合酶联反应和酶联吸附试验从mRNA水平和蛋白水平检测，IL-21对BlO中IL-10表达的促进作用，结论可靠；
[0028](4)应用前景广:IL_21诱导B细胞产生的细胞因子IL-10具有免疫抑制作用，可进一步制备免疫制剂，用于自身免疫性疾病的治疗。
[0029]本发明中，所述IL-21主要通过诱导磷酸化-STAT3的活化促进IL-10分泌，其诱导产生的IL-10具有免疫抑制的作用；因此，所述IL-21可作为体外扩增BlO细胞的细胞因子，进一步制备免疫抑制剂，尤其是预防和治疗自身免疫性疾病的免疫抑制药物，更具体的是制备预防和治疗系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎或硬皮病等自身免疫性疾病的药物。
[0030]为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。



[0031]图1为实时定量聚合酶联反应检测图，显示了 IL-21促进BlO中IL-1OmRNA的表达。
[0032]图2为酶联吸附试验检测图，显示了 IL-21促进BlO中IL-10的分泌。
[0033]图3为聚合酶联反应检测图，显示了 IL-21促进BlO中STAT3mRNA的表达。[0034]图4为蛋白质印迹检测图，显示了 IL-21促进B细胞中STAT3蛋白的磷酸。
[0035]图5为蛋白质印迹检测图，显示了 AG490抑制IL-21诱导的磷酸化-STAT3的表达。
[0036]图6为酶联吸附试验检测图，显示了 AG490时间依赖的抑制IL-21诱导的IL-10 的分泌。
[0037]图7为聚合酶联吸附试验检测图，显示了 AG490能剂量依赖的抑制IL-21诱导的 IL-10分泌。
[0038]图8为MTT检测图，显示了 IL-21诱导的IL-10能抑制T细胞的增殖。

[0039]实施例1体外IL-21促进BlO中IL-1OmRNA的表达
[0040]体外培养幼稚B淋巴细胞，在培养液也中加入10ng/ml LPS和10ng/ml IL-21，培养5小时或24小时，最后5小时在培养液中加入50ng/ml PMA和500ng/mlionomycin和 20 u g/ml brefeldin A ;Real_time RT-PCR检测，结果如图1 所示，IL-21 能促进 IL-1OmRNA 的表达。
[0041]实施例2体外IL-21促进BlO分泌IL-10
[0042]培养幼稚B淋巴细胞，在培养液也中加入10ng/ml LPS和10ng/ml IL-21，培养48 小时，最后5小时在培养液中加入50ng/ml PMA和500ng/ml ionomycin ;ELISA检测，结果如图2所示，IL-21能促进BlO分泌IL-10。
[0043]实施例3体内IL-21与IL-10的分泌相关
[0044]本发明人收集了 30例系统性红斑狼疮患者和15例健康对照外周血清，并通过酶联吸附试验检测外周血中IL-21和IL-10的含量，通过相关性分析发现IL-21的分泌与体内IL-10的分泌密切相关；本发明人收集了 6例5月龄发病的自发性系统性红斑狼疮鼠 MRL/lpr外周血清和6例对照B6鼠外周血清，并通过ELISA检测外周血中IL-21和IL-10 的含量，通过相关性分析，结果表明，IL-21的分泌与体内IL-10的分泌密切相关。
[0045]实施例4IL-21诱导的IL-10能抑制T细胞的增殖
[0046]体外培养幼稚B淋巴细胞，在培养液中加入10ng/ml LPS和10ng/ml IL-21刺激 48小时,最后5小时在培养液中加入50ng/ml PMA和500ng/ml ionomycin,后收集培养上清以备后用；培养幼稚性T细胞，在培养液中加入20%的上一步收集的培养上清；部分孔中加入20 u g/ml ant1-1L-21中和抗体，通过MMT检测T细胞的增殖，结果显示，IL-21诱导的IL-10能抑制T细胞的增殖。