一种寡聚核酸分子及其应用的制作方法【技术领域】。更具体地说，本发明涉及一种用于小分子RNA分离的寡聚核酸分子、利用该寡聚核酸分子分离小分子RNA的方法及用于该方法的试剂盒。[0002]目前，小分子RNA-100个核苷酸或更小的RNA分子是极为引人关注的领域，并且在分子治疗领域很有前途。这些小分子RNA主要包括微小RNA分子(microRNA，简写做miRNA)和小干扰RNA分子(small interfering RNA,简写做siRNA),由于这两种RNA分子都能够与靶mRNA杂交，所以能够调苄基因表达。在不同的组织、器官和不同的发育时期，miRNA和/或siRNA的表达是不同的，它们可能在各种生物发育、生理活动、疾病发生过程中起重要的调节作用。这些小分子RNA的错误表达会导致肿瘤、自身免疫性疾病等的发生。因此，对这些小分子RN A的研究，尤其是对它们的定量研究将对它们的生物功能的研究起到重要推动作用。[0003]但是，以目前广泛进行的miRNA的研究为例,无论是Northern blot、miRNA克隆还是实时定量PCR方法，都是使用总RNA作为样品。由于成熟的miRNA分子产生于miRNA前体，与其前体具有共同的序列，因此使用总RNA进行研究必然导致不准确的结果。中国专利申请200480025190.7采用固相支持物如硅膜等吸附的方式分离小分子RNA。中国专利申请200810036769.3公开了一种通过分子筛方法分离小分子核酸的方法，该方法使得具有相同或相近似分子量的核酸分子一起被分离。上述方法虽然可以分离到小分子RNA，但是通常得到的产物中还混杂有其他非靶RNA。[0004]对于miRNA研究来说，一个关键问题就是特异性分离得到这些小分子RNA。因此，本领域仍需提供一种高效特异的分离小分子RNA的方法。
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种用于小分子RNA分离的寡聚核酸分子，通过与特异性的小分子RNA互补配对,实现对目标RNA分子的分尚。[0006]本发明涉及以下按顺序编号的段落中定义的主题:
[0007]1、一种用于小分子RNA分离的寡聚核酸分子，其特征在于所述寡聚核酸分子由连续的两段核酸序列构成，其中第一核酸序列为一发夹结构的通用序列，其3’端区域与第二核酸序列的3’端区域完全或部分互补；第二核酸序列由5’端区域和3’端区域组成，其5’端区域与待分离的小分子RNA序列完全或部分互补，其3’端区域与第一片段的3’端区域完全或部分互补。
[0008]2、一种用于小分子RNA分离的寡聚核酸分子，其特征在于所述寡聚核酸分子由连续的两段核酸序列构成，其中第一核酸序列为一发夹结构的通用序列，其3’端区域与第二核酸序列的3’端区域完全或部分互补，第一核酸序列与一种可筛选标记物连接，可筛选标记物可标记在寡聚核酸分子的中间位置或末端位置；第二核酸序列由5’端区域和3’端区域组成，其5’端区域与待分离的小分子RNA序列完全或部分互补，其3’端区域与第一片段的3’端区域完全或部分互补。
[0009] 3、段落1-2任一项所述的寡聚核酸分子，其特征在于所述寡聚核酸分子为包含至少一个核糖核苷酸(RNA)分子的杂合分子。
[0010]4、段落1-3任一项所述的寡聚核酸分子，其特征在于所述第二核酸序列的5’端区域和3’端区域之间无间隔序列。
[0011]5、段落1-3任一项所述的寡聚核酸分子，其特征在于所述第二核酸序列的5’端区域和3’端区域之间包含至少一个碱基的间隔序列。
[0012]6、段落1-5任一项所述的寡聚核酸分子，其特征在于所述寡聚核酸分子为包含化学修饰的寡聚核酸分子，所述修饰为如下的修饰中的至少一种:
[0013](I)对所述寡聚核酸分子的核苷酸序列中核糖的修饰；
[0014](I)对所述寡聚核酸分子的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；
[0015](3)对所述寡聚核酸分子的核苷酸序列中碱基的修饰。
[0016]7、段落6所述的寡聚核酸分子，其特征在于所述修饰为对所述寡聚核酸分子的核苷酸序列中核糖的2’ -OH的修饰。
[0017]8、段落6-7任一项所述的寡聚核酸分子，其特征在于所述修饰为所述寡聚核酸分子的核苷酸序列中核糖的2’ -OH被甲氧基或氟取代。
[0018]9、段落1-8任一项所述的寡聚核酸分子，其特征在于所述寡聚核酸分子中包含至少一个锁核酸(LNA)分子。
[0019]10、段落2所述的寡聚核酸分子，其特征在于所述可筛选标记物选自生物素、地高辛或特异性核酸序列。
[0020]11、段落10所述的寡聚核酸分子，其特征在于所述特异性核酸序列选自oligodT、oligo dA、oligo dC、或 oligo dG。
[0021]12、段落1-2任一项所述的寡聚核酸分子，其特征在于第二核酸序列5’端区域与待分离的小分子RNA序列充分互补，能够形成有效的杂交。
[0022]13、段落1-2任一项所述的寡聚核酸分子，其特征在于第二核酸序列5’端区域与待分离的小分子RNA的互补区域的长度为至少4个碱基。
[0023]14、段落1-2任一项所述的寡聚核酸分子，其特征在于所述小分子RNA选自microRNA、siRNA、pi RNA、snoRNA 或 snRNA。
[0024]15、段落1-14任一项所述的寡聚核酸分子的制备方法，其特征在于分别获得所述第一核酸序列片段和第二核酸序列片段，其中第一核酸序列片段为5’末端磷酸化的发夹结构的通用序列，其3’端区域与第二核酸序列的3’端区域完全或部分互补，第一核酸序列与一种可筛选标记物连接；第二核酸序列由5’端区域和3’端区域组成，其5’端区域与待分离小分子RNA序列完全或部分互补，其3’端区域与第一片段的3’端区域完全或部分互补；进一步使第一核酸序列片段与第二核酸序列片段连接，成为一个寡聚核酸分子。
[0025]16、段落1-14任一项所述的寡聚核酸分子的制备方法，其特征在于直接合成包含所述第一核酸序列和第二核酸序列的寡聚核酸分子。
[0026]17、一种小分子RNA的分离方法，包括以下步骤:1)获得段落1_14任一项所述的至少一种特异于待分离小分子RNA的寡聚核酸分子；2)将至少一种寡聚核酸分子与含有待分离小分子RNA的样品混合，使寡聚核酸分子与待分离的小分子RNA杂交形成寡聚核酸分子-小分子RNA复合物；3)利用与寡聚核酸分子连接的可筛选标记物进行寡聚核酸分子-小分子RNA复合物的分离；4)获得分离的小分子RNA。
[0027]18、一种microRNA的分离方法，包括以下步骤:I)获得段落1_14任一项所述的特异于待分离miCToRNA的寡聚核酸分子；2)将至少一种寡聚核酸分子与含有待分离microRNA的样品混合，使寡聚核酸分子与待分离的microRNA杂交形成寡聚核酸分子-microRNA复合物；3)利用与寡聚核酸分子连接的可筛选标记物进行寡聚核酸分子-microRNA复合物的分离；4)获得分离的microRNA。
[0028]19、段落17或18任一项所述的分离方法，其特征在于所述可筛选标记物为生物素，分离与生物素连接的寡聚核酸分子-小分子RNA/microRNA复合物的方法包括:利用生物素与亲和素或链亲和素之间特异性的相互作用，将与可分离载体偶连的亲和素或链亲和素以及与生物素连接寡聚核酸分子-小分子RNA/microRNA复合物共同孵育，利用可分离载体进行寡聚核酸分子-小分子RNA/microRNA复合物的分离。
[0029]20、段落17或18任一项所述的分离方法，其特征在于所述可筛选标记物为地高辛，分离与地高辛连接的寡聚核酸分子-小分子RNA/microRNA复合物的方法包括:利用地高辛与抗地高辛抗体之间特异性的相互作用，将与可分离载体偶连的抗地高辛抗体和与地高辛连接的寡聚核酸分子-小分子RNA/microRNA复合物共同孵育，利用可分离载体进行寡聚核酸分子-小分子RNA/microRNA复合物的分离。
[0030]21、段落17或18任一项所述的分离方法，其特征在于所述可筛选标记物为特异性核酸序列，分离与特异性核酸序列连接的寡聚核酸分子-小分子RNA/microRNA复合物的方法包括:利用特异性核酸序列之间的相互作用 ，将与可分离载体偶连的且能够与所述特异性核酸序列杂交的核酸序列和与特异性核酸序列连接的寡聚核酸分子-小分子RNA/microRNA复合物共同孵育，利用可分离载体进行寡聚核酸分子-小分子RNA/microRNA复合物的分离。
[0031]22、段落17-21任一项所述的分离方法，其特征在于所述可分离载体为琼脂糖凝胶珠或磁珠。
[0032]23、段落17-22任一项所述的方法，其特征在于所述含有待分离小分子RNA的样品为来源于组织或细胞的总RNA样品。
[0033]24、段落17-22所述的方法，其特征在于所述含有待分离小分子RNA的样品为来源于血清的RNA样品。
[0034]25、段落17-22所述的方法，其特征在于所述含有待分离小分子RNA的样品为血清样品。
[0035]26、段落17-22所述的方法，其特征在于所述含有待分离小分子RNA的样品为血清microRNA 样品。
[0036]27、一种用于小分子RNA分离的试剂盒，包括至少一种段落1_14任一项所述寡聚核酸分子和可分离载体，所述可分离载体连接有与相应可筛选标记物结合的适配体。
[0037]28、一种用于血清microRNA分离的试剂盒,包括至少一种段落1_14任一项所述寡聚核酸分子和可分离载体，所述可分离载体连接有与相应可筛选标记物结合的适配体。
[0038]在本发明的第一方面，提供了一种用于分离小分子RNA的寡聚核酸分子，所述寡聚核酸分子由连续的两段核酸序列构成，其中第一核酸序列为一发夹结构的通用序列，其3’端区域与第二核酸序列的3’端区域完全或部分互补，第一核酸序列与一种可筛选标记物连接；第二核酸序列由5’端区域和3’端区域组成，其5’端区域与待分离的小分子RNA序列完全或部分互补，其3’端区域与第一片段的3’端区域完全或部分互补。第一核酸序列的3’端区域与第二序列的3’端区域完全或部分互补的核苷酸数目没有限制，只要能够实现双链的充分配对即可。进一步的，所述第二核酸序列的5’端区域和3’端区域之间可以包含至少一个核苷酸的间隔序列。在一种优选情况下，所述用于分离小分子RNA的寡聚核酸分子包含至少一个核糖核苷酸(RNA)分子；在另一种优选情况下，所述用于分离小分子RNA的寡聚核酸分子包含至少一个锁核酸(LNA)分子；在再一种优选情况下，所述用于分离小分子RNA的寡聚核酸分子是化学修饰的寡聚核酸分子。所述化学修饰方式选自下列修饰中的至少一种: [0039]I)对所述寡聚核酸分子的核苷酸序列中核糖的修饰；
[0040]2)对所述寡聚核酸分子的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；
[0041]3)对所述寡聚核酸分子的核苷酸序列中碱基的修饰。
[0042]用于小分子RNA分离的寡聚核酸分子，所述的可筛选标记物选自生物素、地高辛或特异性核酸序列；进一步的，所述特异性核酸序列选自oligo dT、oligo dA、oligo dC、或oligo dG。可筛选标记物可标记在寡聚核酸分子的一端，也可标记在中间的任意位置。
[0043]上述任一项所述的用于小分子RNA分离的寡聚核酸分子，其第二核酸序列5’端区域与待分离的小分子RNA序列部分互补为至少4个碱基互补，优选为7、8、9、1、0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22 或 23 个碱基互补。
[0044]上述任一项所述的用于小分子RNA分离的寡聚核酸分子，其中所述小分子RNA选自 microRNA、siRNA、piRNA 或 snRNA。
[0045]本发明另一方面提供了上述任一项所述的用于小分子RNA分离的寡聚核酸分子的制备方法，可直接合成包含所述第一核酸序列和第二核酸序列的寡聚核酸分子；也可分别获得两段序列，然后再将两段序列连接成为一个寡聚核酸分子。优选情况下，分别获得所述第一核酸序列片段和第二核酸序列片段，其中第一核酸序列片段为5’末端磷酸化的发夹结构的通用序列，其3’端区域与第二核酸序列的3’端区域完全或部分互补，第一核酸序列与一种可筛选标记物连接；第二核酸序列由5’端区域和3’端区域组成，其5’端区域与待分离microRNA的成熟体序列完全或部分互补，其3’端区域与第一片段的3’端区域完全或部分互补；进一步使第一核酸序列片段与第二核酸序列片段连接，成为一个寡聚核酸分子。
[0046]本发明第三方面提供了一种小分子RNA的分离方法，包括以下步骤:1)获得上述任一项所述的特异于待分离小分子RNA的寡聚核酸分子；2)将至少一种寡聚核酸分子与含有待分离小分子RNA的样品混合，使寡聚核酸分子与待分离的小分子RNA杂交形成寡聚核酸分子-小分子RNA复合物；3)利用与寡聚核酸分子连接的可筛选标记物进行寡聚核酸分子-小分子RNA复合物的分离；4)获得分离的小分子RNA。在一种优选的分离方法中，所述可筛选标记物为生物素，分离与生物素连接的寡聚核酸分子-小分子RNA复合物的方法包括:利用生物素与亲和素或链亲和素之间特异性的相互作用，将与可分离载体偶连的亲和素或链亲和素以及与生物素连接的寡聚核酸分子-小分子RNA复合物共同孵育，利用可分离载体使寡聚核酸分子-小分子RNA复合物得到分离。在另一种优选的分离方法中，所述可筛选标记物为地高辛，分离与地高辛连接的寡聚核酸分子-小分子RNA复合物的方法包括:利用地高辛与抗地高辛抗体之间特异性的相互作用，将与可分离载体偶连的抗地高辛抗体和与地高辛连接的寡聚核酸分子-小分子RNA复合物共同孵育，利用可分离载体进行寡聚核酸分子-小分子RNA复合物的分离。在第三种优选的分离方法中，所述可筛选标记物为特异性核酸序列，分离与特异性核酸序列连接的寡聚核酸分子-小分子RNA复合物的方法包括:利用特异性核酸序列之间的相互作用，将与可分离载体偶连的且能够与所述特异性核酸序列杂交的核酸序列和与特异性核酸序列连接的寡聚核酸分子-小分子RNA复合物共同孵育，利用可分离载体进行寡聚核酸分子-小分子RNA复合物的分离。优选情况下，所述小分子RNA为microRNA。“特异于待分离小分子RNA的寡聚核酸分子”，其中特异于是指寡聚核酸分子与待分离小分子RNA的序列部分或全部互补；当小分子RNA为microRNA时，是指寡聚核酸分子与待分离的成熟体microRNA的序列部分或全部互补。
[0047]在上述任一项所述的分离方法中，所述可分离载体选自:平板、微平板、微量板、载玻片、皿、微珠、颗粒、微粒、杯子、条状物、芯片、微芯片、带状物、膜、微阵列和试管。所述可分离载体的制造材料选自:玻璃、娃、塑料、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯和聚碳酸酯。优选情况下，所述可分离载体为琼脂糖凝胶珠和/或磁珠。
[0048]可用于分离小分子RNA的样品包括含有这种分子的任何样品。该样品可以是包含细胞、组织、器官或其他生物样品的物质，或者该样品可以是反应混合物，如通过酶学、合成和/或重组方法生产的小分子RNA的混合物。
[0049]在上述任一项所述的分离方法中，含有待分离小分子RNA的样品为来源于组织或细胞的总RNA样品。
[0050]在上述任一项所述的分离方法中，含有待分离小分子RNA的样品为来源于血清的RNA样品。
[0051]在上述任一项所述的分离方法中，含有待分离小分子RNA的样品为血清样品。
[0052]寡聚核酸分子与核酸样品可以任意比例混合进行分离。为实现最佳分离效果，所述寡聚核酸分子应过量于核酸样品，优选情况下寡聚核酸分子与核酸样品的浓度比为
3: I或更高。
[0053]本发明第四方面提供了一种用于小分子RNA分离的试剂盒，包括至少一种上述任一项所述的寡聚核酸分子和分离载体，所述分离载体连接有与相应可筛选标记物结合的适配体。其中，可筛选标记物选自生物素、地高辛或特异性核酸序列；进一步的，所述特异性核酸序列选自oligo dT、oligo dA、oligo dC、或oligo dG。所述适配体,对于生物素来讲是亲和素或链亲和素，对于地高辛来讲是抗地高辛抗体，对于特异性核酸序列来讲是与特异性核酸序列互补的核酸序列。
[0054]本发明的有益效·果
[0055]由于小分子RNA在生物生长发育和疾病发生过程中具有重要作用，对小分子RNA的研究具有重要的应用前景和临床价值。与现有技术相比，本发明所提供的技术方案具有分离效率高、操作方便等优点，具有显著的进步。



[0056]图1.寡聚核酸分子的结构示意图。发夹结构的第一核酸序列片段用细实线表示，其5’端被磷酸化，用于和第二核酸序列片段连接；在其单链区域内含有生物素标记，用于与链亲合素标记的可分离载体结合；其5’端区域与3’端部分区域互补配对，形成所述的发夹结构。第二核酸序列片段用粗实线表示，其5’端区域与目标小分子RNA完全或部分互补，其3’端区域与第一片段的3’端区域完全或部分互补。目标小RNA分子用间断的虚线表示，其序列与第二核酸序列片段的5’端区域完全或部分互补。

[0057]下面结合具体实施例及附图，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不能用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。本发明所使用的DNA寡聚核酸由Invitrogen北京分公司合成，所使用的RNA寡聚核酸由广州市锐博生物科技有限公司合成。
[0058]尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的 前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
[0059]O表一、第一核酸序列的类型及修饰

S标记及修饰类型:生物素标记，(Niita); 2’-氟代修饰，(Nf); 2’-甲氧基修饰，

硫代磷酸二酯键修饰，(NpsN); RNA核苷酸取代修饰，(Nrna); LNA核苷g